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方法文章

高分辨率细菌接合频率比较

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DOI：

10.3791/57812

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2019年1月10日

 ,  , 
1Applied Chemistry and Biochemical Engineering Course, Department of Engineering, Graduate School of Integrated Science and Technology, Shizuoka University, 2Department of Bioscience, Graduated School of Science and Technology, Shizuoka University, 3Japan Collection of Microorganisms, RIKEN BioResource Research Center

本文内容

摘要

为了理解不同条件下各种细菌接合型DNA元件的行为，我们描述了一种高分辨率检测接合频率差异的实验方案，以评估供体细菌启动接合的效率。

摘要

细菌接合是通过接合型DNA元件进行抗生素抗性基因水平转移的重要步骤。为了理解接合型元件在自然界中的传播方式，需要在不同条件下对接合频率进行深入比较。然而，由于选择性平板上会发生额外的接合事件，导致背景值较高，传统的接合频率比较方法并不适用于深入分析。我们通过引入最可能数（MPN）方法以及提高抗生素浓度，成功降低了背景干扰，从而在选择性液体培养基中抑制了进一步的接合反应。此外，我们开发了一种通过荧光激活细胞分选（FACS）将单个供体细胞分选到受体细胞群体中的方法，用于估算供体细胞启动接合的频率。利用两种质粒pBP136和pCAR1，可在不同振荡速率的液体培养基中检测到恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）细胞间接合频率的差异。结果显示，pBP136的接合启动频率高于pCAR1。基于这些结果，我们能更深入地理解这两种质粒的接合特性。

引言

移动遗传元件、接合性质粒以及整合和接合元件（ICEs）的细菌接合在遗传信息的水平转移中具有重要作用。它可促进细菌的快速进化与适应，并传播多重耐药基因1,2。接合频率可受到接合元件上编码的DNA转移（MOB）和接合对形成（MPF）相关蛋白的影响，其中包括性菌毛，这些蛋白根据MOB和MPF类型进行分类3,4,5。此外，接合频率还受到供体与受体菌株组合6以及细胞生长条件7,8,9,10,11,12（如生长速率、细胞密度、固体表面或液体培养基、温度、营养物质的可利用性以及阳离子的存在）的影响。为了深入理解接合元件在细菌间的传播机制，有必要对接合频率进行详细比较分析。

接合过程中供体与受体配对之间的接合频率通常通过以下传统方法进行估算：（i）首先，计数供体和受体的菌落数量；（ii）随后，计数获得接合元件的受体菌落（即接合子）；（iii）最后，通过将接合子的菌落形成单位（CFU）除以供体和/或受体的菌落形成单位来计算接合频率13。然而，使用该方法时，由于在高细胞密度条件下，选择性平板上可能发生额外的接合事件，导致背景值较高10。因此，难以检测频率上的微小差异（低于10倍的差异）。我们近期引入了一种最可能数（MPN）方法，该方法使用含有较高浓度抗生素的液体培养基。此方法通过抑制选择性培养基中进一步的接合反应而降低了背景值，从而能够以更高的分辨率估算接合频率。

接合过程可分为三个步骤：（1）供体-受体细胞对的结合；（2）接合转移的启动；（3）细胞对的解离14。在步骤（1）和（3）期间，供体与受体细胞之间存在物理相互作用；因此，细胞密度和环境条件可能影响这些步骤，尽管性菌毛的特性也具有重要作用。步骤（2）可能受到多个与接合相关的基因表达的调控，这些基因响应外界变化而表达，其调控可能受到质粒、供体和受体多种特性的共同影响。虽然供体-受体细胞对的物理结合或解离可通过将细胞视为粒子进行数学模拟，但步骤（2）的发生频率仍需通过实验测定。已有少数研究利用荧光显微镜直接观察供体细胞启动接合（即步骤（2））的频率15,16；然而，这些方法通量较低，因为需要监测大量细胞。因此，我们开发了一种新方法，利用荧光激活细胞分选技术（FACS）来估算步骤（2）发生的概率。该方法可应用于任何质粒，且无需事先鉴定接合所必需的基因。

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方案

1. 准备含有绿色荧光蛋白（GFP）和卡那霉素抗性基因标记质粒的供体菌

  1. 将标记基因导入目标质粒 pBP136
    注意：本实验方案的目标是构建 pBP136::gfp。本研究中使用的所有菌株和质粒列于表1。
    1. 在5 mL无菌Luria肉汤（LB）中培养携带pBP13617的Escherichia coli DH10B，同时在含50 μg/mL卡那霉素（Km）的5 mL无菌LB中培养携带pJBA2819 [包含卡那霉素抗性基因和带有启动子与终止子的gfpmut3*基因，位于mini-Tn5中] 的E. coli S17-1λpir18，于37 °C振荡培养过夜（O/N，16–24 h），转速为200转/分钟（rpm）。
    2. 收集与洗涤
      1. 取1 mL上述每种培养物，转移至2 mL微量离心管中，离心（10,000 × g，室温，2 min）。弃去上清液，将菌体沉淀重悬于2 mL无菌磷酸盐缓冲液（PBS）中。
      2. 再次离心（10,000 × g，室温，2 min），并将菌体重悬于500 μL无菌PBS中。
    3. 滤膜接合
      1. 制备含1.6%琼脂的无菌LB平板，并在其表面放置一张无菌0.22 μm孔径的滤膜。取500 μL携带pJBA28的E. coli S17-1λpir与携带pBP136的E. coli DH10B混合，将混合液点样于LB平板上的滤膜表面。于30 °C培养过夜（O/N）。取出滤膜，转移至无菌50 mL塑料离心管中，加入1 mL无菌PBS。
        注意：pJBA28可在由pir基因编码的Π蛋白存在下复制18，并可从S17-1λpir转移至DH10B。pBP136不含任何标记基因17，可从DH10B转移至S17-1λpir。因此，在此阶段无法区分携带pBP136和pJBA28的S17-1λpir与携带pBP136及mini-Tn5（插入染色体或pBP136中）的DH10B。因此，后续步骤（1.1.4.–1.1.5.）中我们使用这些混合物作为供体。
    4. 将上述接合混合物在含50 μg/mL Km的无菌LB中于37 °C、200 rpm振荡条件下培养过夜；同时将Pseudomonas putida KT2440 [对卡那霉素敏感（Kms）、利福平敏感（Rifs）、庆大霉素敏感（Gms），但对四环素耐药（Tcr）] 在含12.5 μg/mL Tc的培养基中于30 °C、200 rpm振荡条件下培养过夜。
    5. 按照步骤1.1.2的方法收集并洗涤细胞后，将所得细胞（接合混合物和KT2440）用于滤膜接合（O/N，30 °C），操作同步骤1.1.3。
    6. 制备含50 μg/mL Km和12.5 μg/mL Tc的无菌LB平板（LB + Km + Tc平板）。
    7. 用无菌PBS将滤膜上重悬的混合物进行101–105倍梯度稀释，取各稀释液涂布于LB + Km + Tc平板，于30 °C培养2–3天。
    8. 挑取平板上的单菌落，在含Km和Tc的无菌LB中培养过夜；同时将P. resinovorans CA10dm4RG（Rifr 和 Gmr）6在含利福平（Rif，25 μg/mL）和庆大霉素（Gm，30 μg/mL）的无菌LB中于30 °C、200 rpm条件下培养过夜。
      注意：如前所述，LB + Km + Tc平板（来自步骤1.1.7）上的菌落可能为携带含mini-Tn5的pBP136的KT2440，或染色体中插入mini-Tn5的KT2440，因为pJBA28可直接从同时携带pBP136和pJBA28的S17-1λpir转移至KT2440。因此，为获得目标质粒pBP136（含mini-Tn5），后续步骤中需与P. resinovorans CA10RG进行另一次接合。
    9. 按照步骤1.1.2的方法收集并洗涤细胞后，将所得细胞用于滤膜接合（O/N，30 °C），操作同步骤1.1.3。
    10. 制备含Rif、Gm和Km的无菌LB平板（LB + Rif + Km + Gm平板）。
    11. 将滤膜上的混合物重悬后进行101–105倍梯度稀释，涂布于LB + Rif + Km + Gm平板，于30 °C培养2–3天。
    12. 挑取菌落，使用针对该质粒的特异性引物通过PCR检测是否携带pBP136。
  2. 将选择性标记基因导入目标质粒pCAR1
    注意：本实验方案的目标是构建pCAR1::gfp
    1. 在含50 μg/mL Km的5 mL无菌LB中，于200 rpm、37 °C条件下培养携带pJBA28的E. coli S17-1λpir18；同时在200 rpm、30 °C条件下培养携带pCAR1（Kms、Gms、Rifs、Tcr）20的P. putida KT2440，培养过夜。
    2. 按照步骤1.1.2的方法收集并洗涤细胞后，将所得细胞用于滤膜接合（O/N，30 °C），操作同步骤1.1.3。
    3. 从LB平板上取下滤膜，转移至无菌50 mL塑料离心管中，加入1 mL无菌PBS。
    4. 用无菌PBS将重悬液进行101–105倍梯度稀释，取稀释后的混合液涂布于无菌选择性LB + Tc + Km平板。
      注意：pCAR1不能在E. coli中复制；因此，可在LB + Tc + Km平板上筛选出携带含mini-Tn5的pCAR1的P. putida KT2440。
    5. 从平板上挑取单菌落，在含Km和Tc的无菌LB中培养过夜；同时将P. resinovorans CA10dm4RG在含Rif和Gm的无菌LB中于200 rpm、30 °C条件下培养过夜。
    6. 按照步骤1.1.2的方法收集并洗涤细胞后，将所得细胞用于滤膜接合（O/N，30 °C），操作同步骤1.1.3。
    7. 将滤膜上的混合物重悬后进行梯度稀释，涂布于LB + Rif + Km + Gm平板，于30 °C培养2–3天。
    8. 挑取菌落，使用针对该质粒的特异性引物通过PCR检测是否携带pCAR1。
  3. 确认标记质粒的可转移性并为后续步骤准备供体菌
    注意：本实验方案的目标是确认上述构建的质粒的可转移性，并为后续实验准备供体菌。
    1. 在含Km的无菌LB中培养携带pBP136::gfp或pCAR1::gfp的P. resinovorans CA10dm4RG；同时在含Tc的3 mL LB中于200 rpm、30 °C条件下培养P. putida SMDBS [Kms、Gms、Rifr、Tcr、lacIq，其染色体上的lacIq基因抑制了PA1/O4/O3-gfpmut3*的表达]21，培养过夜。
    2. 按照步骤1.1.2的方法收集并洗涤细胞后，将所得细胞用于滤膜接合（O/N，30 °C），操作同步骤1.1.3。
    3. 将滤膜转移至无菌50 mL塑料离心管中，用1 mL无菌PBS重悬。用无菌PBS将重悬液进行101–105倍梯度稀释，取稀释液涂布于无菌选择性LB + Tc + Km平板。
    4. 挑取菌落，使用特异性引物通过PCR检测是否携带相应质粒。
      注意：可选步骤：在质粒提取后通过直接测序确认mini-Tn5的插入位点，以验证插入不影响质粒的转移功能。

2. 采用MPN法计算接合频率

  1. 准备无菌的 LB + Km 和 LB + Gm 平板。
  2. 在 3 mL 含 Km 的无菌 LB 培养基中培养携带 pBP136::gfp 或 pCAR1::gfp 的 P. putida SMDBS 过夜培养物，并在 3 mL 含 Gm 的 LB 培养基中培养 P. putida KT2440RGD（Gmr，Rifr）过夜培养物（140 rpm，30 °C）。
  3. 按照步骤 1.1.2 收集并洗涤细胞后，按步骤 1.1.3 的方法在 30 °C 下进行滤膜接合 45 分钟。
  4. 将上述供体和受体培养物依次稀释（101 –107），并分别涂布于 LB + Km（供体）或 LB + Gm（受体）平板上（每组设三个重复），以计数菌落形成单位（CFU）。将平板在 30 °C 下培养 2 天。
  5. 将滤膜上的混合物重悬于含 Km 和 Gm 的无菌 LB 培养基中，并使用 96 孔细胞培养板进行系列稀释（从 21 到 224–107.2，设四个重复）。
  6. 将 96 孔板在适当条件下培养（30 °C 下培养 2 天）。
  7. 计数平板上供体和受体的 CFU（步骤 2.4），并统计各稀释度下转接合子生长的孔数。
  8. 使用 Jarvis et al.22 开发的 MPN 计算程序计算 MPN 及其偏差，该程序可从以下网址获取：http://www.wiwiss.fu-berlin.de/fachbereich/vwl/iso/ehemalige/professoren/wilrich/MPN_ver5.xls。
    1. 在 Excel 文件（“MPN_ver5.xls”）的“Program”工作表第 7 行中输入实验名称（例如，“test”）、实验日期（例如，2018/4/9）、测试系列数量以及最大稀释级数（输入“24”）。
    2. 在自动生成的“input data”表格中，“dilution factor d”列输入“2-1 (= 0.5) 到 2-24 (= 5.96 × 10-8)”，“volume in ml or g w”列输入“0.01”，“No. of tubes n”列输入“4”。
    3. 输入每个样品稀释度下转接合子生长的孔数（0–4）。
    4. 点击右上角的“Calculate Results”按钮，即可获得结果（单位为 MPN/μL）及其 95% 置信区间（下限和上限）。
  9. 通过将转接合子数量（MPN/mL）除以供体和受体细胞数量（CFU/mL），计算质粒的接合频率。

3. 供体起始接合转移概率估算的准备工作

  1. 使用300 mL三角瓶，在3 mL含卡那霉素（Km）的无菌LB培养基中培养携带pBP136::gfp或pCAR1::gfp质粒的P. putida SMDBS过夜（O/N）培养物，同时在3 mL含庆大霉素（Gm）的无菌LB培养基中培养P. putida KT2440RGD（Gmr, Rifr）培养物，培养条件为140 rpm、30 °C，作为预培养物。
  2. 将200 μL预培养物转移至500 mL三角瓶中含Km或Gm的新鲜无菌LB培养基（200 mL）中，于30 °C、140 rpm振荡培养。
  3. 使用紫外-可见分光光度计测定培养物在600 nm处的浊度（OD600），并将培养物用LB培养基进行101–108倍系列稀释后涂布于含Km或Gm的LB平板。于30 °C培养1–2天，测定菌落形成单位（CFU）。
  4. 以OD600值和CFU值对生长时间作图，绘制供体菌和受体菌的生长曲线。
  5. 根据生长曲线，将供体菌和受体菌培养至对数中期。
  6. 收集并洗涤细胞后，用10 μL LB缓冲液制备含101–103 CFU的供体菌悬液，以及用100 μL LB缓冲液制备含105–107 CFU的受体菌悬液。
  7. 在96孔板中（每组设三个重复），以不同密度混合10 μL供体菌液与100 μL受体菌液。例如，将含101 CFU的供体菌与含105 CFU的受体菌混合后加入各96孔板的孔中；另取含101 CFU的供体菌与含106 CFU的受体菌混合至另一块96孔板中，依此类推。
  8. 将混合液于30 °C孵育45分钟，随后向每孔加入高浓度抗生素（100 μg/mL Km和60 μg/mL Gm），以抑制进一步接合反应。
  9. 将96孔板于30 °C继续孵育2天。
  10. 统计出现接合子生长的孔数。
  11. 根据上述数据选择适合估算供体起始接合概率的受体菌密度（接合子应至少在96孔板的一个孔中出现）。
    注意：当供体和受体细胞密度较高时，每个孔中可能发生多次接合，导致所有孔均出现接合子生长；相反，若细胞密度过低，则所有孔中均无法检测到接合子。在后续实验中，单个供体细胞将被分选至单个孔中，因此受体菌密度应达到最大值。

4. 供体起始接合概率的估算

  1. 按照3.6–3.7节所述方法，准备200 mL处于对数中期的供体菌P. putida SMDBS（携带pBP136::gfp或pCAR1::gfp质粒）以及受体菌P. putida KT2440RGD的培养物。
  2. 将106 CFU的受体菌加入到96孔板每个孔中的100 μL LB培养基中。
  3. 设置FACS系统（配备机械臂、488 nm氩离子激光器和70 μm喷嘴孔径的流式细胞仪与细胞分选仪），以正向散射光（FSC）为参数，设定1%阈值作为采集触发条件。使用PBS作为阴性对照，将FSC和侧向散射光（SSC）的H增益和A增益调节至最大灵敏度，以排除假阳性信号。根据FSC和SSC设定分选门，并采用0.5滴分选模式以获得最高的分选纯度。
  4. 通过FACS将单个供体细胞分选至LB平板上（共384个不同位点），于30 °C培养2天后，统计分选细胞在平板上形成的菌落数量。
    注意：该步骤用于验证设定的分选门。若平板上出现384个菌落，则表明分选的细胞有100%能够形成菌落。通常分选的有效率在90–95%之间。
  5. 通过FACS将单个供体细胞分选至含有受体菌的96孔板的每一孔中（见4.2节）。
  6. 将96孔板在30 °C下孵育45分钟，然后向每孔中加入高浓度抗生素（100 μg/mL Km和60 μg/mL Gm），以阻止进一步的接合反应。
  7. 将96孔板在30 °C下继续孵育2天。
  8. 通过肉眼观察，统计出现接合子生长的孔数。
  9. 通过将含有接合子的孔数除以供体细胞被分选的总孔数，计算供体起始接合的概率。

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结果

通过MPN法比较接合频率

在我们之前的报告中，我们比较了pBP136::的接合频率gfp 和 pCAR1::gfp 在125 mL 摇瓶中，使用三倍稀释的LB液体培养基（1/3 LB），在45分钟接合后以不同摇床转速培养10. 我们比较了pBP136::的接合频率gfp 和 pCAR1::gfp 106 不同搅拌条件（0–600 rpm）下供体与受体菌株的CFU/mL。两种质粒的接合频率均随搅拌速率升高而增加，接合频率的最大差异为 <10 倍稀释用于 pBP136::gfp （0 到 400 转/分之间），而 pCAR1::gfp 约为25倍（在0至200 rpm之间；图1）。

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讨论

本文介绍了一种利用最可能数（MPN）法估算接合子数量，以高分辨率检测不同条件下接合频率差异的实验方案。该方案的一个关键步骤是在接合反应后对供体菌和受体菌的混合物进行梯度稀释，直至无接合子生长；另一个步骤是在选择性液体培养基中添加高浓度抗生素，以抑制后续接合反应的发生。这些操作可有效降低选择性培养基中因持续接合而产生的背景干扰。即使在供体与受体菌之间进行短暂的接合后，我们也能成功检测到频率上的差异。本方案所计算出的接合频率可能因供体和受体菌株生长条件的微小差异而发生改变，因此这些条件应被精心设计。

此外，我们介绍了一种利用流式细胞术（FACS）进行单个供体细胞分选以估算接合转移第二步的实验方案。该方案最关键的步骤是确定与单个分选供体细胞相匹配的受体细胞适当密度。当围绕单个供体细胞的受体细胞数量足够多时，供体与受体细胞之间的物理接触便可得到保证。此时，接合频率将不再受供体与受体细胞相互接触概率的影响，而是取决于供体细胞启动接合转移的概率。通过FACS分选单个供体细胞并不困难；然而，96孔板并不总是足以准确估算该概率，因此应准备10至100块培养板。该方案的一个局限性在于，其不适用于测定...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

我们感谢日本国立感染症研究所的K. Kamachi博士提供质粒pBP136，以及东京大学的H. Nojiri教授提供质粒pCAR1。我们还感谢丹麦技术大学的Molin Sørensen教授提供质粒pJBA28。本研究由JSPS科研费（课题编号：15H05618和15KK0278）资助，资助对象为MS（https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-15H05618/，https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-15KK0278/）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
MoFlo XDPBeckman-CoulterML99030FACS
IsoFlowBeckman-Coulter8599600鞘液
Fluorospheres（10 μm）Beckman-Coulter6605359用于设置FACS的微球
培养箱Yamato Scientific Co. Ltd211197-IC802
紫外-可见分光光度计 UV-1800SIMADZU CorporationUV-1800
96孔板NIPPON Genetics Co, LtdTR5003
微孔板型培养皿AXEL1-9668-01用于分选验证
膜滤器ADVANTECC045A025A用于滤膜交配
移液器Nichiryo CO. Ltd00-NPX2-20,
00-NPX2-200,
00-NPX2-1000		0.5–10 μL、20–200 μL、100–1000 μL
多通道移液器Nichiryo CO. Ltd00-NPM-8VP,
00-NPM-8LP		0.5–10 μL、20–200 μL
胰蛋白胨BD Difco211705
酵母提取物BD Difco212750
NaClSigmaS-5886
琼脂Nakarai tesque01162-15
利福平Wako185-01003
庆大霉素Wako077-02974
卡那霉素Wako115-00342
培养皿AXEL3-1491-51JPND90-15
微量离心管Fukaekasei131-815C
500 mL 一次性悬浮培养瓶CorningCLS3578

参考文献

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