一种新型饱和突变方法：利用硫代磷酸酯一步法表征RNA中调控蛋白结合位点

摘要

结合特定RNA序列的蛋白质在基因表达中发挥关键作用。对这些结合位点进行详细表征，对于我们理解基因调控机制至关重要。本文描述了一种针对RNA中蛋白质结合位点的单步饱和突变方法。该方法适用于RNA中所有蛋白质结合位点的研究。

摘要

基因调控在发育过程中起着重要作用。多种DNA和RNA结合蛋白能够以高度特异性结合其靶序列，从而控制基因表达。这些调控蛋白可在DNA水平（转录）或RNA水平（前体mRNA剪接、多聚腺苷酸化、mRNA转运、降解和翻译）调控基因表达。鉴定调控序列不仅有助于理解某个基因如何被激活或抑制，还能揭示特定调控蛋白所调控的下游基因。本文介绍一种单步方法，可用于对RNA中的蛋白质结合位点进行饱和突变分析。该方法包括在结合位点区域内向DNA模板中掺入非野生型核苷酸，分别合成含有每种硫代磷酸酯核苷酸的RNA，并在与蛋白质孵育后分离出结合组分。非野生型核苷酸会干扰蛋白质结合，因而更倾向于被排除在蛋白结合组分之外。通过碘选择性切割含硫代磷酸酯的磷酸二酯键（硫代磷酸酯突变，PTM），随后进行凝胶电泳，即可监测该干扰效应。这种单步饱和突变方法适用于表征RNA中任何蛋白质结合位点。

引言

基因调控在生物学中具有重要作用。基因可在转录、pre-mRNA剪接、3'端形成、RNA输出、翻译、mRNA定位、降解、翻译后修饰/稳定性等多个层面受到调控。etc. DNA结合蛋白和RNA结合蛋白均在基因调控中发挥关键作用。尽管分子遗传学分析已鉴定出大量调控蛋白，但其中仅有少数蛋白的细胞功能或在体内的结合位点得到了全面表征。in vivo。系统发育序列分析和诱变技术为研究DNA-或RNA-蛋白质相互作用提供了互补的研究手段。

RNA结合蛋白在发育过程中具有重要作用，包括性别分化。Drosophila中的Sex-lethal（SXL）蛋白，即主控性别转换蛋白，在雄性中缺失，而在雌性中存在。该蛋白可识别体细胞中下游pre-mRNA靶标（transformer、Sex-lethal和male-specific lethal2）特定剪接位点附近的富含尿嘧啶序列或嘧啶序列片段^1,2,3,4。此外，SXL通过结合enhancer of rudimentary（e(r)）转录本中富含尿嘧啶的多聚腺苷酸化增强子序列，调控多聚腺苷酸化位点的选择^5,6。SXL可能还在雌性生殖系中调控其他尚未被鉴定的靶标^{1,7,8,9,10,11,12,13}。

通常，结合位点的表征需要通过诱变来实现，例如通过单个或多个核苷酸的缺失或替换。相对于野生型RNA序列，每个突变的结合位点随后利用一系列蛋白质浓度进行分析，以确定其与目标蛋白质的结合亲和力（K_d，即平衡解离常数）；K_d 是指达到50% RNA结合所需的蛋白质浓度。这种详尽的诱变过程工作量大，涉及大量突变体的构建与分析——每个结合位点的每个位置需检测三种非野生型核苷酸。因此，亟需一种替代方法，以更快速、简便且经济的方式实现RNA中蛋白质结合位点的饱和诱变。

本文介绍一种单步法，可实现对RNA中蛋白质结合位点的饱和突变。该方法包括在结合位点区域内向DNA模板中掺入非野生型核苷酸，分别合成含有每个磷硫代核苷酸的RNA，并在与蛋白质孵育后分离结合组分。非野生型核苷酸产生的干扰会导致其在蛋白质结合组分中被优先排除。通过碘选择性切割含磷硫代的磷酸二酯键（磷硫代突变，PTM），随后进行凝胶电泳，即可监测该过程。这种单步饱和突变方法适用于表征RNA中任何蛋白质结合位点。

方案

注意：图1 展示了硫代磷酸酯诱变的总体流程，并总结了该过程中的关键步骤。

1. 突变体文库的构建——通过掺入非野生型核苷酸对DNA模板进行修饰

1. 使用DNA合成仪通过化学合成法合成T7引物（5’-GTAATACGACTCACTATAG-3’）。
2. 在DNA合成仪上通过化学合成法合成一条与蛋白质结合位点互补的掺杂寡核苷酸（互补链）。在化学合成过程中，针对每个掺杂位点（下文中的X），使用适当比例的亚磷酰胺单体混合物，其中野生型核苷酸A占90%，非野生型核苷酸T占10%（参见代表性结果部分对此比例的详细说明）。
   注意：此处掺杂寡核苷酸的序列为 5’-GTTCACTACACTXGAXAXAXAXCAXCXAXAXGXTGCCCTATAGTGAGTCGTATTAC-3’。下划线序列为SXL蛋白结合位点的反向互补序列，包含结合位点外的额外核苷酸，这些额外核苷酸可作为有效对照，证实并非RNA的每一处改变都会影响结合，并可作为上样对照，用于结合位点内核苷酸的比较与归一化。SXL结合位点序列UUUUUGUUGUUUUUUUU存在于 变压器 前体mRNA^14,15,16,17，用于设计所提出的方法。斜体序列与T7引物序列互补，且为T7启动子序列 体外 转录

2. RNA 的合成

1. 按照先前所述方法，在 20 µL 转录反应中合成 RNA¹⁸。
   1. 混合 T7 转录缓冲液、1 µM T7 寡核苷酸、1 µM 掺杂寡核苷酸、10 mM 二硫苏糖醇（DTT）、2 mM GTP、每种 1 mM ATP、CTP 和 UTP（鸟苷、腺苷、胞苷和尿苷三磷酸），以及 2 U/µL T7 RNA 聚合酶。
   2. 在两个独立的微量离心管中分别加入 0.167 mM α-硫代 ATP 或 0.05 mM α-硫代 UTP，以将硫代磷酸酯（见图 2中的示意图）引入 RNA 中。
      注：对于替代方案，可在含有掺杂寡核苷酸的适当转录反应中加入 0.2 mM α-硫代 CTP 或 0.2 mM α-硫代 GTP，以测试其余两种核苷酸替换。
   3. 将 RNA 合成反应混合物在 37 °C 下孵育 2 小时。
2. 向 RNA 样品中加入 2.5 µL 热不稳定性碱性磷酸酶和 2.5 µL 10× 磷酸酶缓冲液。将该 25 µL 反应体系在 37 °C 下孵育 10–30 分钟，以去除 5’ 磷酸基团。
3. 通过在 80 °C 加热 2–5 分钟使碱性磷酸酶失活。
4. 使用 1 µL T4 多核苷酸激酶和 1 µL γ-³²P ATP，在 10 µL 反应体积中对去磷酸化的 RNA（5 pmol）进行 5’ 端放射性标记。将反应混合物在 37 °C 下孵育 30–60 分钟。
5. 通过在 65 °C 加热 20–30 分钟使 T4 多核苷酸激酶失活。
6. 通过 10% 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳对 RNA 进行凝胶纯化。通过放射自显影法在凝胶上定位 RNA。切下含有放射性标记 RNA 的凝胶条带，用移液器枪头在微量离心管中压碎，并浸泡于蛋白酶 K（PK）缓冲液（100 mM Tris，pH 7.5，12.5 mM EDTA，150 mM NaCl，1% 十二烷基硫酸钠）中。在室温下旋转孵育 2 小时至过夜。
7. 离心凝胶悬液，弃去凝胶，收集缓冲液。
8. 用等体积酚-氯仿萃取溶液两次，再用氯仿萃取一次，收集水相。
9. 向水相中加入 0.1 体积的 3 M 醋酸钠（pH 5.2）、载体 tRNA 或糖原，以及 2.5 体积乙醇。将样品置于 -80 °C 保持 1 小时。
10. 在高速微量离心机中以 16,873 × g 离心 5–10 分钟。小心移除缓冲液/乙醇溶液，避免扰动 RNA 沉淀。
11. 用 70% 乙醇洗涤沉淀，离心 2–5 分钟。小心移除乙醇。将沉淀在空气中干燥。
12. 将沉淀重悬于 20–50 µL 焦碳酸二乙酯（DEPC）处理的水中。储存于 -20 °C，直至使用。
    注：所有涉及放射性标记 RNA 的操作均应采取适当防护措施，并使用有机玻璃屏蔽板以防止辐射暴露。目前，离心柱更为常用且更方便用于去除未掺入的放射性物质，可作为 RNA 凝胶纯化的替代方法。

3. 蛋白质结合反应及结合RNA的分离

1. 在宿主中表达并纯化重组蛋白 E. coli.
2. 通过分光光度法测定重组蛋白浓度，或将其与已知浓度的蛋白质标准品——牛血清白蛋白（BSA）一同在SDS-聚丙烯酰胺凝胶上进行分离。使用考马斯亮蓝R-250染色凝胶以显现出目标蛋白和BSA标准品条带。通过与同一凝胶上已知浓度的BSA稀释液进行比较，对蛋白含量进行定量分析。
   注意：将重组蛋白于 -80 °C 保存至使用前，并用含 20 mM 4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙磺酸（HEPES），pH 8.0，1 mM 二硫苏糖醇（DTT），0.2 mM 乙二胺四乙酸（EDTA），0.05% NP-40，20% 甘油的溶液稀释。可选择性添加 0.5–1.0 mM 蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟（PMSF）。
3. 在含有10 mM Tris-HCl（pH 7.5）、1 mM DTT、50 mM KCl、0.5单位/µL RNase抑制剂、0.09 µg/µL乙酰化牛血清白蛋白、1 mM EDTA、0.15 µg/µL tRNA、5'端放射性标记的RNA以及6 µL适当浓度（使约50% RNA与蛋白结合的蛋白浓度）蛋白的反应体系（20–100 µL）中进行RNA结合反应。
   注意：该结合缓冲液适用于三种RNA结合蛋白（SXL, U2AF）⁶⁵，以及PTB），但必须针对目标蛋白进行标准化。通过经验法估算蛋白浓度，即对特定蛋白样品使用不同稀释度，确定获得约50% RNA结合率所需的蛋白浓度。此条件或 K_d 代表RNA结合曲线中最敏感的部分。
4. 将蛋白结合反应在25 °C孵育20–30分钟（或在冰上孵育）。
5. 使用以下两种方法之一将蛋白质结合的RNA组分与未结合的组分分离：
   1. 硝酸纤维素滤膜结合
      1. 将结合反应液（20–100 µL）在室温下加入连接真空 manifold 的硝酸纤维素滤膜上。
         注意：只有RNA-蛋白质复合物会被滤膜保留，而未结合的RNA则会流过滤膜。与凝胶迁移率变动实验相比，滤膜结合法具有更高的结合RNA回收率，且操作更快速简便。在硝酸纤维素滤膜下方放置一张DEAE膜，还可收集未结合的RNA组分或游离RNA，以便与结合组分进行比较。
      2. 将含有滞留放射性RNA的硝酸纤维素滤膜部分剪成小块，以适配微量离心管，加入足量PK缓冲液（300–500 µL，含10–20 µg PK），确保滤膜碎片完全浸没，然后在2–3小时或过夜时间内从滤膜上洗脱RNA。
      3. 用苯酚-氯仿、氯仿抽提，收集水相。加入乙酸钠和乙醇，冷冻孵育后离心，洗涤，干燥，并将RNA重悬于经DEPC处理的水中。具体操作步骤详见上述2.10至2.14步。
   2. 凝胶迁移率 shift
      1. 在开始结合反应之前，配制并聚合一块5%的天然聚丙烯酰胺凝胶（60:1 丙烯酰胺:双丙烯酰胺），使用0.5×TBE（标准Tris-硼酸-EDTA缓冲液），作为滤膜结合方法的替代方案。
      2. 在4 °C的冷室中以250 V预电泳15分钟。
      3. 将上述每个结合反应分别加入上述预先电泳的凝胶的不同加样孔中。
         注意：蛋白储存缓冲液中已含有足量的甘油，可直接用于上样至加样孔中。
      4. 在低温室中，根据RNA大小和特定蛋白质，以250 V电压进行凝胶电泳1至2小时，分离与蛋白质结合的RNA。
      5. 通过放射自显影确定凝胶中RNA-蛋白质复合物的位置。切下含有RNA-蛋白质复合物的凝胶片段。将凝胶片段碾碎后浸泡于PK缓冲液中，以洗脱RNA。
      6. 用苯酚-氯仿、氯仿抽提，收集水相。加入乙酸钠和乙醇，冷冻孵育后离心，洗涤，风干，将RNA重悬于经DEPC处理的水中。具体操作步骤详见上述2.10至2.14步。

4. 碘裂解磷酸硫酯产物的分析以检测突变核苷酸位点

1. 在含有最多10 µg载体tRNA的20 µL DEPC处理水中加入1 mM碘，以在磷酸硫代酯掺入位点切割RNA（结合态和总RNA）。室温孵育5分钟。
   注：有关碘切割的更多细节（条件略有不同——7% (v/v) 碘乙醇，95 °C加热3分钟）可参见Gish & Eckstein 1988¹⁹。
2. 按上述方法加入乙酸钠/乙醇沉淀切割后的RNA。将沉淀物重悬于变性凝胶上样染料中。加热样品后上样，通过15–20%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离RNA片段。
3. 将聚丙烯酰胺凝胶曝光至X射线胶片。
4. 利用放射自显影技术检测结合组分与总RNA池中的条带。
   注：所有涉及碘的操作步骤均应在通风橱中进行。本实验所用的RNA分离方法采用楔形凝胶，该凝胶通过在凝胶板底部插入额外一英寸长的垫片，使底部两侧的间隔条厚度加倍而制成。此种形状可使较短的RNA片段间距更均匀或更接近。此外，也可使用磷屏成像仪替代X射线胶片进行放射性信号的检测与定量。

结果

利用掺杂进行饱和突变的原理：

对于野生型与其他核苷酸的合适摩尔比例，若仅分析一个位点，可使用四种核苷酸等量混合物；然而，若同时分析多个位点，则必须调整非野生型与野生型核苷酸的比例。 即， 减少。否则，除了期望的单个替换外，还可能出现分子中含有多个非野生型核苷酸的模板，从而无法分析单核苷酸替换的影响。因此，通常建议非野生型与野生型核苷酸的比例为1/n，其中n为需要分析的位置数目。本实验中同时分析了10个位置，使用含有90%野生型核苷酸和10%非野生型核苷酸的混合物对DNA模板进行掺杂。分别进行独立的转录反应，每个转录反应使用四种硫代磷酸酯中的一种。因此，每个反应可特异性监测掺杂位点上的某一特定核苷酸。

由于干扰导致的分相原理：

讨论

诱变技术长期以来被用于表征蛋白质结合位点。首先，可以构建一系列突变体，并在结合实验中逐一检测其对结合亲和力的影响。尽管传统的诱变方法能够分析若干序列，但该方法涉及多个步骤，例如突变体构建以及针对每个突变体进行一系列结合反应，过程繁琐且耗时，可能难以实现饱和诱变，尤其是对于较长的序列。其次，可将某段序列随机化，并利用该文库进行多轮结合与聚合酶链式反应（PCR）扩增。那些能够与蛋白质结合的序列需要经过克隆和测序，以从共有序列中鉴定并验证结合位点。然而，这种反复结合与扩增的方法仍包含多个步骤，在识别结合位点内关键残基方面工作量较大。此外，PCR固有的重复性序列扩增可能引入序列偏好性。第三，也可采用高通量测序这一更快的方法对随机文库中筛选出的序列进行测序，但该方法相对昂贵。因此，为了克服上述多步骤、费力和/或昂贵方法的局限性，我们设计了一种更快、更经济、且最重要的是单步完成的方法，本文即描述该方法，用于实现结合位点（PTM）的饱和诱变。

该方法的关键步骤包括识别或标记非野生型核苷酸。我们使用了硫代磷酸酯核苷酸，其中磷酸骨架中的一个氧原子被硫原子取代，如（

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
尿苷5’硫代三磷酸	NEN (波士顿, 马萨诸塞州)	NLP-017
腺苷5’硫代三磷酸	NEN (波士顿, 马萨诸塞州)	NLP-016
真空抽滤装置	Fisher Scientific	XX1002500	Millipore 25 mm 玻璃微量分析真空滤器
真空抽滤装置	Millipore	XX2702552	1225 取样真空抽滤装置
硝酸纤维素膜	Millipore	HAWP
硝酸纤维素膜	Schleicher & Schuell	PROTRAN
去磷酸化试剂盒	NEB	M0508
T4 多核苷酸激酶	NEB	M0201S
蛋白酶K	NEB	P8107S
T7 RNA聚合酶	NEB	M0251S
RNasin	Promega		RNase抑制剂
玻璃板	标准	标准
凝胶电泳设备	标准	标准
X射线胶片	标准	标准
聚丙烯酰胺凝胶溶液	标准	标准