复制集方法: 一种高通量方法定量测量秀丽线虫寿命

摘要

在这里, 我们描述了复制集方法, 一种定量测量C. 线虫寿命/生存和 healthspan 的方法, 以高通量和健壮的方式, 从而允许筛选许多条件而不牺牲数据质量。该协议详细介绍了策略, 并提供了用于分析副本集数据的软件工具。

摘要

复制集方法是一种以高通量方式定量测量秀丽线虫的寿命或存活的方法, 从而使单个调查人员能够在相同数量的时间内筛查更多的治疗或条件。没有数据质量损失的时间。这种方法需要在大多数实验室中发现的常见的设备与C. 线虫, 因此是简单的采用。该方法的中心是在每个观察点上对一个种群的独立样本进行化验, 而不是随着时间的推移与传统的纵向方法进行抽样。评分需要在多井板块的井中加入液体, 这会刺激C 线虫移动并促进量化 healthspan 的变化。复制集方法的其他主要好处包括减少琼脂表面暴露于空气中的污染物 (例如霉菌或真菌), 对动物的最小处理, 以及对零星错误评分的鲁棒性 (例如, 当动物仍然活着)。为了对副本集样式实验中的数据进行适当的分析和可视化, 还开发了一种自定义软件工具。该软件的当前功能包括绘制副本集和传统 (卡普兰) 实验的生存曲线, 以及副本集的统计分析。这里提供的协议描述了传统的实验方法和副本集方法, 以及对相应数据分析的概述。

引言

在了解衰老的遗传基础方面, 最具变革性的技术进步之一是在¹线虫中发展基于喂养的 rna 干扰;在实验性地使用 rna 干扰之前, 许多衰老的表型不是遗传的。以喂养为基础的 rna 干扰是通过生产大肠杆菌中的 dsRNA 与内源c. 线虫mRNA: IPTG 诱导双向转录跨插入的任何c. 线虫cDNA 或一部分的在质粒²中打开阅读框架。当C. 线虫饲料在完整的大肠杆菌,由细菌产生的 dsRNA 通过 SID-2 跨膜蛋白³从流明传输到肠道细胞, 然后通过 SID-1⁴分布到其余的动物。在每个细胞内, 外源 dsRNA 由 Dicer 复合体处理成 siRNA, 通过互补基配对与成熟的 mRNA 相互作用, 创建一个新的 siRNA-mRNA 双工。这种双工是由 RISC 复合体和劈裂的, 从而降解内源 mRNA⁵。因此, 仅仅改变质粒的插入, 你就可以使几乎任何基因在线虫基因组中的功能失效。这一发现导致了几个大的基于喂食的 rna 干扰库的创建--转化的大肠杆菌种群的集合, 可以结合起来以达到约86% 已知的C. 线虫基因的覆盖率^6,7。

自从饲养基 rna 干扰的推进, 在C. 线虫的全面屏幕导致发现了900多个基因, 改变生命的灭活时 (由 WormBase 的 rna 干扰-表型协会证明), 我们提到为 gerogenes。大多数 gerogenes 在长寿控制中的作用是在一些精算报告中发现的, 通过喂食为基础的 rna 干扰 (见图 1A和补充文件 1的细节)。在某些情况下, 这些 gerogenes 是根据在单个或几个时间点测量生存能力而确定的, 这不能为使用 rna 干扰治疗的寿命变化提供可量化的衡量标准。在其他情况下, 这些基因已经定量地评估了寿命的变化, 以及其他年龄相关的表型。例如, 我们以前确定了159种基因, 对正常和增加的动物寿命都是必要的, insulin/IGF-1 信号减少, healthspan 的量化变化。其中, 103 基因 inactivations 导致 progeric 表型, 因为损失导致一个或多个过早衰老的迹象⁸。

虽然有些 gerogenes 与100项或更多的研究相关 (例如 daf-16、daf-2、sir-2.1), 但超过 400 gerogenes 有10或更少的引文 (图 1B和补充文件 2)。因此, 虽然综合饲料基 rna 干扰屏幕发现和马虎的特点数以百计的假定 gerogenes, 如何这些基因在长寿控制中的作用, 这些基因产品之间的遗传关系仍然很差研究。对年龄相关表型的全纵向分析是确定 gerogenes 之间的基因相互作用 (如上位相互作用、asynthetic 相互作用等) 的先决条件。深入了解 gerogenes 之间的遗传相互关系需要一种高通量定量方法, 这也利用了基于喂养的 rna 干扰的优势。

衰老最常见的替代措施是寿命。传统的测量C. 线虫死亡率的方法是在一小部分人口样本中追踪个别动物的死亡情况。随着时间的推移, 动物数量相对较少, 并且周期性地用铂丝或睫毛轻轻地戳, 以运动作为生存能力的指示器 (图 2A)。这种方法得到了广泛的应用, 因为它提供了直接的平均值和最大寿命的测量。然而, 这种传统的方法是耗时和相对较低的吞吐量, 这限制了动物的数量和条件, 可以同时测量的控制方式。最近的一项模拟研究发现, 许多C. 线虫寿命研究并没有对足够数量的动物进行检测, 从而能够可靠地检测出条件⁹之间的细微变化。此外, 这种传统的方法包括反复处理同一队列动物随着时间的推移, 这反过来可以引入污染, 并可能损害或杀死越来越脆弱, 衰老的动物。

我们开发了一种替代的 "复制集" 方法来测量C. 线虫的寿命。为此, 大量人口的年龄同步, 等基因系动物被划分成少数人口 (或复制品)。生成的副本样本足以覆盖计划实验中的每个时间点。在每个观察时间点, 其中一个副本是为生存, 死亡和被截断的动物的数量得分, 然后动物在复制被丢弃。因此, 在整个人口的预期寿命内, 一系列独立的亚群定期取样 (图 2B)。在使用副本集, 没有重复的刺激动物, 并没有重复暴露在潜在的环境污染。在同一时间点观察到的生存能力完全独立于其他所有观察, 这将最大限度地减少处理和提高吞吐量。这使得我们能够定量^8,10的上百个 rna 克隆的寿命变化。

在这里, 我们提出了通过复制集和传统的方法来进行c. 线虫寿命的详细协议, 以评分c. 线虫长寿。我们证明了相似的结果在方法之间得到。我们开发了软件, 以协助对通过任一方法生成的寿命数据进行图形分析, 我们可以根据 GPL V3 许可证免费提供这些信息 (见材料表)。"WormLife" 是在 R¹¹中编写的, 包括图形用户界面 (GUI), 用于绘制数据, 该接口已在 Mac OS 和 Linux 中进行了测试。最后, 我们比较和对比了每种方法的局限性, 并强调在选择方法来测量线虫寿命的定量变化的其他因素。

方案

1. 传统的线虫寿命评分方法

1. 试剂的制备
   1. 通过基于喂养的 rna 识别基因进行灭活。购买已转换的 HT115大肠杆菌²的股票, 其中含有对利益的 rna 克隆。另外, 亚克隆的基因 cDNA 的 multicloning 的 L4440 质粒的网站。
      注: HT115 是一种 RNase III. 型大肠杆菌菌株, IPTG 诱导 T7 聚合酶活性, 用于防止细菌中 dsRNA 的降解。对于不使用基于喂养的 rna 干扰的寿命研究, 可以使用标准 NGM 板上的 HT115 或 OP50大肠杆菌.
   2. 为每个测试条件准备 3–6 (或更多) 6 厘米的 rna 干扰板 (配方的补充文件 3 )。在细菌播种4摄氏度前, 将 rna 干扰盘贮存到几个月。
   3. 一夜之间生长转化为大肠杆菌(16–20 h, 37 °c 震动孵化器在 180–220 RPM)。
      注: HT115大肠杆菌生长在 LB 与氨苄西林 (50 毫克/毫升)。标准 OP50大肠杆菌是不耐药性的, 并在没有氨苄西林的情况下生长。区域性体积取决于板块的 #, 但通常介于8到100毫升的磅之间, 这取决于实验设计。
      1. 在台式离心机中, 用 3000 x g离心法浓缩细菌, 15–20分钟。吸入上清液, 并在 1/第十起始容积 (即10x) 磅与氨苄西林 HT115 (或无氨苄西林标准 OP50) 中重新悬浮颗粒。
      2. 整除200µL 的浓缩10x 细菌, 每6厘米板。准备3–4复制每个测试条件, 有2个额外的备份板, 用于在发生污染的情况下使用。在准备盘子的时候, 给它们贴上标签, 这样实验者就可以用颜色代码或类似的编码方案来检测试验条件。确保记录了代码。
      3. 在清洁的环境中, 如层流工作台, 允许打开的盘子干燥, 直到所有液体被吸收或允许盖板在工作台上一夜之间晾干。在干燥时监测板材, 以确保琼脂干燥而不过度干燥。
         注意: 过度干燥的板块导致的琼脂开裂, 将导致C. 线虫的洞穴进入琼脂。湿琼脂表面也促进穴居。
   4. 将干燥的盘子在一个蠕虫盒子里过夜 (高达24小时) 在室温下, 以允许 dsRNA 生产。经过1天的 RT, 储存板在4°c 2 周, 在一个密封的拉链袋 (以防止板材干燥)。使用前, 返回板在拉链袋内的室温, 以防止冷凝从引入空气中的真菌污染物。
2. 用次氯酸盐处理C. 线虫的同步
   注: 参阅 M9 和次氯酸盐溶液配方的补充文件 3 。
   1. 用 M9 收集妊娠成年动物。使用插入的玻璃吸管移动到 2x 15 毫升管。
   2. 旋转管为 30 "在2000转每分钟。检查管底部的线虫池。吸入上清液。用 M9 溶液清洗两次, 重复旋转和吸入。
   3. 在4毫升的 M9 中重新悬浮C 线虫。加入2毫升次氯酸盐溶液。立即旋涡为 ~ 3 分钟, 周期性剧烈晃动。3分钟后, 在解剖显微镜下寻找卵云。漩涡一个额外的 10–20 s, 如果鸡蛋没有被释放后3分钟。
      注意: 时间的次氯酸钠治疗是必不可少的。卵子内的妊娠成人是什么生存治疗。在3分钟后, 怀孕的成年人打破开放, 鸡蛋溢出。然而, 如果鸡蛋是在次氯酸盐溶液太长后释放, 他们将死。反之, 如果妊娠成年人不留在次氯酸盐溶液足够长的时间, 没有鸡蛋将被释放。
   4. 用 M9 溶液快速清洗两次, 如步骤2.1.2。
   5. 在3毫升 M9 中重新悬浮线虫卵颗粒, 并转移到一个新的15毫升管。允许胚胎在3毫升的 M9 溶液中过夜, 旋转20摄氏度。
   6. 计算每µL 的 L1 动物 (或胚胎) 的密度, 方法是在6厘米的盘子上滴下10µL L1 溶液 3x, 并计算 L1 动物的数量以计算 L1s/µL 的平均数量。
      注意: L1 动物会随着时间的推移而安定下来。因此, L1 解决方案应定期混合。
   7. 每片种子 50 L1 动物。用橡皮筋将板材和密封件倒置。把盘子放在塑料蠕虫盒子里。密封盒在一个大的拉链袋。移动到20摄氏度孵化器。
3. 通过添加 5-氟-2 '-脱氧尿苷 (FUdR) 防止后代生产
   1. 种植动物直到 L4 阶段在20°c。检查同步动物是否已经发展到 L4 大约40小时后播种 (步骤 2.1.7)。
      注:线虫发育时间在不同温度下变化¹² , 变异动物的生长速率必须经过实证检验。
      1. 添加160µL 50x FUdR 到每6厘米板与 L4 动物。
         注意: 在 L4 阶段添加 FUdR 是非常重要的。为方便起见, 通过将1克 FUdR 分解成10毫升超纯 H₂o FUdR 过滤消毒库存 FUdR 与0.2 µm 过滤器和 10 cc 注射器, 使1,000x 库存。整除 ~ 1 毫升的库存进入无菌1.5 毫升管。冷冻并贮存在摄氏-20 摄氏度。
   2. 检查板材是否存在雄性线虫.移除所有雄性。
      注意: 寿命通常是测量雌雄同体而不是雄性。雌雄同体说, 即使在 FUdR¹³的存在下, 伴侣的寿命也比未交配动物短。雄性更小, 更薄, 然后雌雄同体, 可以很容易地识别出一个独特的钩尾¹⁴。
   3. 把盒子放回拉链袋里。返回20°c 孵化器。
4. 评分可行性
   1. 通过用铂丝或睫毛轻轻地接触头上的动物, 每天都能获得生存能力。得分的动物, 不能移动作为死亡和删除他们从板块 (图 2A)。记录每个观测时间点的每个条件所观察到的死数。
      注: 为了降低评分偏差的风险, 实验者必须保持对实验条件的盲目, 同样不能在评分过程中引用以前时间点的结果。
   2. 检查动物的破裂, 死于其他明显的发展缺陷, 或爬行的一侧的菜: 删除这些动物和记录的数字在每个观察到的时间点, 以考虑在统计分析。此外, 如果发现雄性, 取出它们并记录观察到的数字。
   3. 每天重复从步骤1.4.1 直到没有动物活着。
      注: 如果大肠杆菌的草坪明显减少或真菌开始生长在盘子上, 转移所有剩余的动物到一个新鲜的盘子与适当的 rna 干扰和 FUdR。
5. 数据分析. 制图和统计
   1. 在支持生存分析的软件中输入或打开记录的观测数据与非参数的卡普兰-梅尔估计¹⁵和日志等级测试¹⁶ (参见补充文件 3)。一定要包括被截断的动物。不要包括被观察到的雄性, 如果有的话。
      注意: 数据格式可能会因软件而异, 但通常的格式是记录在单独一行上观察到的每个单独的动物。动物被观察为死的实验 timepoint 是 "事件" 时间。如果被审查, "事件" 时间是动物被审查的 timepoint。通常有一个字段或复选框来指示被审查的观察。
   2. 剧情卡普兰-Meier 生存曲线。如果对多个条件进行了测定以提高可读性, 则为单个绘图选择少于六个条件。
      1. 检查是否存在视觉上明显缺失的观测、意外的控制结果等数据问题.-在统计分析之前处理这些问题。
   3. 使用软件中的日志级测试功能执行配对的统计比较。确保对被审查的结果的任何可用选项都适当地设置为右截尾数据。

2. 用副本集法对线虫长寿进行评分

注意: 虽然传统的方法需要3–6板的每个条件 (见 1.1.2), 副本集方法需要更多的 (请参见下面的步骤 2.2.2)。传统的方法是在整个实验中遵循同一板块的动物 (图 2A)。相比之下, 与副本集动物只得分一次: 许多相同的复制是建立在实验的开始, 以便一个复制在每个时间点 (每次试用) 得分 (图 2B)。

1. 库设置。
   注: 有关处理 rna 干扰克隆的其他详细信息, 请在这里介绍, 因为复制集协议可以同时得分许多 rna 克隆, 并且一次可缩放到100多个克隆。在96井格式板材中保持甘油类的储存, 将 rna 克隆的集合保留下来。副本集实验使用24井板。每个井是一个不同的测试条件, 这可能对应于一个收集的 rna 克隆, 不同的化学处理, 动物菌株, 等等。
   1. 装配 sublibrary 的布局, 以收集 rna 克隆, 以便满足以下条件:
      1. 确保在96井集合内, 以及 A1 是一个空的矢量负控制。
      2. 在每24口井中随机插入额外的空矢量控制。
      3. 将96井板拆分成24井块, 这样每个24井板都有一个随机插入的负控制 (图 2C)。
      4. 在每组24井中随机插入一个正控制 (图 2C)。
         注意: 正则控制依赖于实验问题。例如, 当查看增加寿命的 rna 克隆的集合时, 通常会包括2 (rna 干扰) 。反之, 当寻找缩短寿命时, 16 (rna 干扰)经常被使用。
2. 副本集的准备
   注意: 所需的复制数等于最小时间点数 (图 2B)。一个人必须知道在实验开始之前测量寿命的时间, 以及评分频率 (例如, 每隔一天得分40天的副本集实验需要准备至少20个副本集, 以便实验开始时的每个条件)。最好是制作5额外的备份集 (请参见下面的2.2.2 和 2.2.2.3)。
   1. 要创建一个新的标记的 rna sublibrary, 接种200µL 磅 + 安培每井在96井格式 (600 µL 板) 使用96针板复制器通过以下步骤:
      1. 将96针板复制器按顺序浸入50% 漂白剂、超纯 H₂O 和乙醇中。保持针脚浸泡至少三十年代的漂白剂和乙醇步骤。 浸泡在乙醇后, 简单地点燃提示。重复。
         注: 一定要冲洗掉所有的漂白剂, 不要让针脚暴露在漂白的长时间内, 因为漂白剂会腐蚀不锈钢针脚。
      2. 小心地从冷冻的96井甘油储存库板上取下胶箔盖, 轻轻而牢固地将灭菌后的印版复制器研磨到仍在冷冻的甘油储存井中。接种200µL 磅 + 安培培养基, 用透气膜封住接种板。允许文化在台式的一夜之间生长。
      3. 在步骤2.1.1 中对印版复制器进行消毒, 在一夜之间的生长和复制器引脚的浸泡技巧中小心地去除液体培养板上的密封。应用小贴士, 甚至压力, 以一个长方形的 LB 放大器 + 新年琼脂板, 并转移细菌从别针到盘子轻轻地用一个小小的圆形运动, 确保在相邻的斑点之间留有足够的空间。允许菌落在37摄氏度的琼脂盘上一夜之间生长。请参阅补充文件 3 , 以准备 LB + Amp/春节版。
      4. 使用前, 将琼脂盘存放在4°c 倒置 (盖子侧下), 包裹在石蜡膜中。
         注: 储存菌落盖一侧, 将允许冷凝交叉污染的 rna 克隆!大肠杆菌的菌落可以储存在4摄氏度的2–8周, 这取决于特定的 rna 克隆, 因为 rna 克隆保留在诱导 dsRNA 后 IPTG 诱导的时间长短的有效性。对于小集合的 rna 克隆, rna 的效率应该由 qPCR 的经验来确定击倒。
   2. 计算一次试验所需的最小24井板数: (每个副本集的 # 板) x (预期的 # 时间点)。确保包含一些额外的副本集, 用于处理诸如污染等问题 (图 2B)。
      注意: rna 克隆的总数决定了每一个时间点为一组复制副本 (图 2C) 的24井板数。
      1. 准备24井板, 作为步骤 1.1.2 (补充文件 3为食谱)。标签板当准备他们, 所以实验者评分的测试将是盲目的实验条件, 使用颜色代码或类似的编码方案。
      2. 为每10个副本接种一组1.5 毫升磅 + 安培的区域性 (请参见 2.2.2)。在96井深井板中接种培养基, 使用板块复制器 (如 2.1.3) 和2.1.4 细菌菌落 (图 2C,左)。密封与透气膜, 增长20小时 (37 °c) 与震动。
      3. 种子120µL 一夜文化每板使用一个6井多通道与可调的尖端间距 (图 2C,右)。干燥板在层流罩中被发现, 直到所有液体被吸收。不要过度干燥。在室温下隔夜储存盘子。
3. 用次氯酸盐处理C. 线虫的同步
   1. 计算实验所需的最小动物数: L1s 所需的最小数量 = (15-20 个动物/井) (24 个井/板) (X 板/副本集) (Y 副本集)。
      注意: 复制集方法比传统方法需要更多的动物。一个10厘米厚的板, 充分的妊娠蠕虫可以提供 20,000–50,000 L1 动物的密度, 取决于妊娠成年人。同样, 二十6厘米板产量约 3万 L1 动物。计划准备一个鸡蛋准备, 加倍的最低数量的动物需要。如果准备的人口挨饿, 重新喂养或大块到一个新的板块, 并允许至少三代在食物之前 proceding^17,18。一定要冻结剩下的 L1s。
   2. 遵循步骤 1.2 1.2.6 的传统方法获得同步 L1 动物。种子 15–20 L1 动物进入每个井使用6井可调整的间距吸管和试剂库, 类似于1.2.7。定期混合 L1 解决方案, 防止动物的沉降。
4. 添加 5-氟-2 '-脱氧尿苷 (FUdR) 预防后代生产
   1. 按照步骤1.3.1。 准备无菌 50x FUdR 库存 (见步骤 1.3.1.1)。
   2. 当动物到达 L4 时, 使用6通道可调间距吸管, 在24井板的每一个井中添加25µL 的 50x FUDR。
5. 评分可行性
   1. 删除一组复制板和洪水井与 M9 解决方案, 记录总的动物每井, 然后轻轻地触摸非移动的动物头部与蠕虫采摘 (图 2B)。没有移动的动物被评分为死亡。放弃得分的盘子。每日记录生存能力。
      注意: 破裂的动物, 显示总形态学缺陷, 没有开发, 或爬行在井的边将被审查通过排除他们从死亡和总价值。
      1. 记录每一个井中被审查的动物的数量在每个时间点单独地从其他价值。
      2. 不要在没有食物或被污染的油井中得分 (如真菌或粘液);这些水井被认为是被审查的。同时, 如果所有的动物都显示出形态学或发育缺陷, 那么审查一下。在此时间点记录此 rna 克隆/井的审查事件。
      3. 在打完复制盘后, 扔掉它。每天继续评分一个新的复制集, 直到所有的动物在所有的水井都死了。为了降低评分偏差的风险, 实验者必须保持对实验条件的盲目, 同样不能在评分过程中引用以前时间点的结果。
      4. 如果一个井内的所有动物都死在给定的时间点, 那么在那一天的得分之后, 检查是否所有的动物都被连续两个时间点的死亡评分为一个给定的井。如果是这样的话, 那么在随后的时间点, 得分的可行性就不再需要了。
      5. 进行额外的独立实验试验。与以前的试验中的试验次数分开, 跟踪连续实验的结果。

3. 图形数据

注意: 用副本集方法将曲线拟合应用于近似平均和最大寿命。评估C. 线虫死亡率的参数符合 logit 曲线¹⁹。 由于大多数生存工具不支持 logit 曲线拟合, 开发了一个新的程序来绘制 logit 曲线 (对于副本集);卡普兰-Meier 曲线 (为传统方法) 也支持。

1. 从软件开始。下载当前版本的发行 zip 文件 (请参阅参考资料部分)。将 zip 文件解压到文件夹。有关其他安装说明, 请参阅解压文件夹中的 "自述文件"。

1. 启动绘图界面。在从 zip 文件提取的文件夹中查找 "代码" 目录的位置 (例如, "/使用者/用户名/桌面/WormLife/代码")。
   1. 在 R 控制台中输入以下命令, 替换刚刚标识的文件夹路径。按 enter 或返回后, 每输入行: 1) setwd ("/用户/客户名/桌面/WormLife/代码"), 2) 源 ("plotGUI"), 3) openMain ()。
   2. 允许在新窗口中加载接口的时间, 从而显示默认屏幕, 如图 3A所示。让 R 在后台运行。
2. 将数据格式化为逗号分隔值 (CSV) 或制表符分隔值 (TSV) 文件。指定列和名称, 取决于分析类型。请参阅补充文件 4 (副本集) 和补充文件 5 (传统/卡普兰-梅尔) 为预先格式化的示例数据。
   注: 数据必须以 "长" 格式指定,即每次试用时每一个时间点每一个应变/处理的一行。建议使用 CSV 文件以在平台之间进行最佳兼容性。
   1. 移除与跳过或审查的观察相对应的行。检查是否缺少丢失值或非数值, 因为导入数据时可能会导致错误。
   2. 对于传统的卡普兰-梅尔风格分析, 不要从独立试验中汇集数据-分别绘制它们。对于副本集分析, 从多个试验中汇集数据, 然后使用 "TrialView" 功能进行调查 (请参见 6.3.3.4)。
3. 使用绘图界面
   1. 使用对话框加载数据文件 ("文件" 菜单下的 "导入")。要打开 ". csv" 文件, 请将下拉列表中的文件类型更改为 ". csv" (默认为 ".txt/. tsv"), 导航到带有数据文件的文件夹。这里的文件是副本集示例数据 (补充文件 4)。
      注意: 在数据集已打开时导入文件将替换当前数据集。
   2. 选择要导入的文件以启动 "导入向导", 通过标识所选文件的列 (图 S1A用于副本集)。如果输入数据对应于一个副本集实验, 请为学习类型选择 "Logit"。
      注意: 导入工作流不同于副本集 (图 S1A) 和传统 (卡普兰-Meier) (图 S1B)。
   3. "绘制数据"。选择 "添加行" 开始绘制数据。(一条线对应一组条件。有一些功能, 以帮助实验, 在许多条件被测试)。
      1. 情节控制条件-在例子数据 N2 (L4440) 以 (空的媒介) 干扰的情况下是适当的。在 "图形" 菜单下选择 "添加行" 以启动 "添加行向导": 选择要绘制的条件和表示线条的图形参数。
         1. 要手动为其他条件添加曲线, 请重复3.3.3.1 中的步骤。
         2. 要更改线条的颜色或绘制符号, 请在 "图形菜单" 下选择 "修改线条"。
         3. 若要在不清除所有行的情况下删除行, 请在 "图形菜单" 下选择 "删除行"。
         4. 要清除当前绘图中的所有行, 请在 "图形菜单" 下选择 "清除行"。
         5. 要覆盖自动选定的最大 x 轴 (时间) 值, 请在 "图形菜单" 下使用 "设置 x 刻度"。
            注意: y 轴 (幸存分数) 总是以20% 的增量显示 100% (顶部) 到 0% (底部)。x 轴始终以5为增量显示。在保存绘图图像后, 不绘制坐标轴标签以启用标记的灵活性。
      2. 要保存当前显示图形的 JPEG 格式图像, 请使用 "文件菜单" 中的 "保存绘图" 选项;仅保存当前绘图。
      3. 为了在一个实验中为许多不同的条件创建单个地块, 软件允许定义和绘制一个 "系列"。
         注意: 在使用大型实验时, 该系列概念的实现提高了效率。
         1. 如果从空白绘图工作区开始, 则添加对应于在系列中所有图块之间保持一致的控制条件的行 (请参见 3.3.3.1)。
         2. 在 "图形" 菜单中定义 "定义系列" 系列。选择与该系列中第一个显示的线条相对应的条件;只能选择一个。为线条选择图形参数 (线条颜色和绘图符号), 如3.3.3.1。
         3. 查看不同测试条件的地块。使用在主绘图窗口两侧以及顶部菜单栏中找到的左/右箭头按钮, 在条件之间切换 "系列线" 的显示 (图 3A-C)。
            注意: 如果选定的系列线与以前添加的控件/参照行的条件相同, 则新行可能会出现叠加。
         4. 定义系列以使某些其他函数可用 (保存系列图和 Trialview-请参见 3.3.3.4)。定义系列后, 使用 "文件" 菜单中的 "保存系列图" 选项, 可以为新文件夹中的系列中的每个图形保存单个绘图图像文件。
      4. Trialview-从副本集实验的独立试验中可视化结果。如果为一个或多个样本组运行多个试验, 则分别从各个试验和汇集的数据中单独绘制数据, 以评估独立试验之间的一致性 (见图 3D)。
         1. 设置3.3.3.3 中所述的系列。不同的试验将在不同的图像中针对指定的参照/控制样本的各自试验, 对每个 "不同" 样本组进行绘制。
         2. 要保存 TrialView 图像, 请转到 "数据" 菜单中的 "打印 TrialViews";将为序列中的每个图形输出 JPEG 图像。
            注:图 3D中的示例结果为一个有两个试验的案例。
   4. 副本集数据的中值寿命摘要表。通过目视检查曲线以确保数据的合理匹配, 然后在 "数据" 菜单中选择"汇总表" 选项, 以保存每个样本类型的平均寿命值表 (logit 曲线的50% 生存时间).
4. 通过副本集方法生成的数据的统计评估
   1. 对于两组从副本集实验中进行的统计分析, 请修改并运行在发行 zip 文件中提供的 R 脚本 (请参阅 "WormLife 统计分析模板脚本"。R ")。
      注: 运行脚本时不需要精通 R。文件中的注释中还有其他文档。该脚本已准备好对示例副本集数据进行分析。用户生成的数据以适当的格式 (参见补充文件 4) 也可以分析。
      1. 以 r (r GUI 或 RStudio) 打开脚本文件。
         注意: 这将显示脚本而不运行它。
      2. 修改所需文件的位置以匹配计算机上的位置。
         注意: 这些文件路径必须是 "完全限定" (即应包括完整的文件位置, 包括文件夹)。
         1. 修改 "wlDir" (目录的位置) 的路径 (文件/文件夹位置)、"数据文件" (要分析的副本集数据文档)、"compFile" (要运行的比较规范 (如果适用) 和 "outputPath" (将写入结果文件的位置到)。
      3. 如果要分析的文件中的列名与示例文件不同, 请在 "指定数据文件中的列" 部分中设置列名。为每个参数指定一列。如果一项研究有多个菌株, 但没有任何干扰 (或其他处理) 包括数据文件中的列, 其中包含空白条目或所有行的相同 (例如"no_treatment"等)。
      4. 设置 "compFile" 参数。如果 "compFile" 参数设置为 NA, 则将运行组的所有可能的配对比较。
         注意: 组是由应变/基因型和治疗的组合定义的, 它们被串联并显示为 "strain_treatment"。对于具有许多组的更大的研究, 可以提供一个指定比较的 CSV 文件。请参阅示例文件 "comps_rsm_example. csv"。
      5. 设置蒙特卡罗重新取样的迭代次数 ("resamp", 缺省值为 1000)。
         注: 在执行太少迭代时返回5月0日的 P 值;在这种情况下, 报告 "p < 0.01" (如果 resamp = 100), 或 "p < 0.001" (如果 resamp = 1000), 则是适当的.
      6. 运行脚本: RStudio 中的 "源" 按钮 (编辑窗口的右上) 或 R GUI 中 "编辑" 菜单中的 "源文档"。(执行可能需要一段时间。
      7. 当 R "忙" 指示器不再显示时, 打开输出目录-将有一个表, 每个比较的结果 (中值存活率, p 值,% 中值寿命变化)。

结果

在任何新的方法的发展中, 新方法概括从以前的方法中接受的结果, 并符合领域内的标准势在必行。我们以前的经验表明, 复制集和传统的测定C. 线虫寿命的方法产生类似的结果²⁰。野生型线虫(N2) 维持在20摄氏度通常生活在20和25天之间, 我们观察到的传统 (图 4A, 黑线) 和副本集方法 (图 4B, 黑色)。因此, 这两种方法都合理地近似野生型寿命。同样重要的是, 一个新的方法有决心准确地量化测试条件和统计能力之间的变化, 以检测重大变化。在我们之前的研究中, 我们发现, 转录因子的 c-myc 家族是C. 线虫长寿的决定因素。mml-1和mxl-2编码的同系物哺乳动物蒙多 A/碳水化合物反应元素结合蛋白 (ChREBP) 和 Mlx 分别。在线虫和哺乳动物中, 这些 c-myc...

讨论

传统和副本集方法都需要对年代衰老动物进行同步处理。我们包括一种方法, 使动物使用次氯酸钠治疗妊娠成人, 只有受精卵与妊娠成人生存治疗。这些胚胎孵化在液体悬浮和发育停止在第一幼虫阶段 (L1)。在将 L1 动物播种到食物上后 (如大肠杆菌表达 dsRNA 的基因), 动物恢复发育。用次氯酸盐治疗妊娠 L1 动物, 可以使残留的非种子选手 L1 动物在液氮或-80 摄氏度冷藏库中无限期地冷冻储存。这样, 在实验设置时, 每个应变的样本都被保留下来, 为将来的研究和提高重现性创造了宝贵的资源。然而, 虽然次氯酸钠治疗妊娠成年动物是一种常见的方式获得同步动物的衰老研究²², L1 逮捕是一个饥饿的反应。因此, 一些实验室倾向于允许孵化发生在盘子上, 或完全放弃次氯酸盐治疗, 并允许一些怀孕的成年人产卵几个小时 (即鸡蛋躺)。在后一种情况下, 父母被删除, 后代的寿命被遵循。据我们所知, 在 M9 的动物, 在盘子上孵化, 或从卵产卵的后代之间, 没有明显的寿命差异。然而, 鉴于营养可用性的变化与寿命的变化密切相关, 在这些同步方法之间, 特定的...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
IPTG（异丙基 β-D-1-噻半乳糖吡喃糖苷）	Gold Bio	12481C100
FuDR（5-氟-2'-脱氧尿嘧啶）	Alfa Aesar	L16497
24 孔培养板	Greiner Bio-One	#662102
Retangular 未处理单孔板，128x86mm	Thermo-Fisher	242811
600 µL 96 孔板	Greiner Bio-One	#786261
2mL 96 孔板	Greiner Bio-One	#780286
透气板密封	VWR	60941-086
96 针板复制器	Nunc	250520
细菌蛋白胨	VWR	90000-368
细菌琼脂	Affymetrix/USB	10906
HT115 细菌中的秀丽隐杆线虫 RNAi 克隆文库 - Ahringer	来源 生物科学	秀丽隐杆线虫 RNAi 集合 （Ahringer）	另见 Kamath 等人，Nature 2003。
HT115 细菌中的秀丽隐杆线虫 RNAi 克隆文库 - Vidal	Source Bioscience	秀丽隐杆线虫 ORF-RNAi 资源 （Vidal）	另见 Rual 等人，基因组研究 2004 年。这个库也可以从 Dharmacon 获得。
WormLife- 用于复制集存活分析的软件	Samuelson Lab	N/A	https://github.com/samuelsonlab-urmc/wormlife
L4440 空载体质粒	Addgene	1654	https://www.addgene.org/1654/
Wormbase			http://www.wormbase.org/
绿洲			https://sbi.postech.ac.kr/oasis2/
Graphpad 棱镜			https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/