复制集方法：一种高通量定量测定秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）寿命的实验技术

摘要

本文介绍了复制集（Replica Set）方法，这是一种以高通量且稳健的方式定量测量秀丽隐杆线虫（C. elegans）寿命/存活率及健康寿命的技术，从而能够在不牺牲数据质量的前提下筛选多种实验条件。本实验方案详细阐述了该方法的实施策略，并提供了一套用于分析复制集数据的软件工具。

摘要

复制集方法是一种用于定量测量寿命或存活率的方法 秀丽隐杆线虫 以高通量方式处理线虫，从而使单个研究人员在相同时间内能够筛选更多处理条件或实验组，且不损失数据质量。该方法仅需大多数从事线虫研究的实验室中常见的设备 秀丽隐杆线虫 因此易于采用。该方法的核心在于，在每个观察时间点检测群体中的独立样本，而非像传统纵向方法那样对同一样本进行长时间追踪。评分过程包括向多孔板的孔中加入液体，以刺激 秀丽隐杆线虫 以促进移动并便于量化健康寿命的变化。复制平板法的其他主要优点包括减少了琼脂表面暴露于空气污染物的机会（例如 霉菌或真菌污染）、对动物操作最少化，以及对偶发性评分错误（例如将仍存活的动物误判为死亡）具有较强容错性。为了适当地分析和可视化复制集（Replica Set）实验的数据，还开发了一款定制软件工具。该软件目前的功能包括绘制复制集实验和传统（Kaplan-Meier）实验的生存曲线，以及对复制集数据进行统计分析。本文提供的实验方案描述了传统的实验方法和复制集方法，并概述了相应的数据分析流程。

引言

理解衰老遗传基础最具变革性的技术进步之一是基于喂食的RNAi技术的发展 秀丽隐杆线虫¹；在RNAi技术应用于实验之前，许多衰老表型在遗传学上难以进行研究。基于喂食的RNAi技术是通过在体内产生dsRNA实现的 E. coli 与之匹配的 内源性 秀丽隐杆线虫 mRNA：IPTG 诱导跨越任一插入片段的双向转录 秀丽隐杆线虫 cDNA 或质粒中的开放阅读框片段²。当 秀丽隐杆线虫 以完整的为食 大肠杆菌， 细菌产生的dsRNA通过SID-2跨膜蛋白从肠腔转运至肠细胞内³，然后通过SID-1在动物体内其余部分进行分布⁴在每个细胞内，外源性dsRNA被Dicer复合物加工成siRNA，siRNA通过碱基互补配对与成熟的mRNA结合，形成新的siRNA-mRNA双链。该双链被RISC复合物识别并切割，从而导致内源性mRNA降解⁵因此，只需更换质粒中的插入片段，即可使几乎任何基因的功能失活 秀丽隐杆线虫 基因组。这一发现促成了多个基于喂食的RNAi文库的建立——这些文库是转化后的 E. coli 可组合使用的品系，能够覆盖已知基因型的大约86% ....

方案

1. 传统 C. elegans 寿命评分方法

1. 试剂的准备
   1. 确定通过饲喂法RNAi进行失活的基因。购买转化后的HT115菌株库存 E. coli² 含有目标基因的RNAi克隆。或者，将目标基因的cDNA亚克隆至L4440质粒的多克隆位点。
      注：HT115 是一种 RNase III 缺陷型 E. coli 具有IPTG可诱导的T7聚合酶活性的菌株，用于防止细菌内dsRNA的降解。对于不使用饲喂法RNAi的寿命研究，可使用HT115或OP50 E. coli 在标准NGM平板上可以使用.
   2. 每个测试条件准备 3–6 个（或更多）6 cm RNAi 平板（补充文件 3 用于配方）。RNAi 平板储存于 4 °C，在接种细菌前可保存数月。
   3. 培养转化后的 E. coli 过夜（16–20 小时，37 °C 摇床培养箱，转速为 180–220 RPM。
      注意： HT115 E. coli 在含氨苄青霉素（50 mg/mL）的LB培养基中培养。标准OP50 E. coli 不具有抗生素抗性，培养时不添加氨苄青霉素。....

结果

在任何新方法的开发过程中，必须确保该新方法能够重现以往方法所获得的公认结果，并达到领域内的标准。我们此前已通过实验表明，Replica Set 方法与传统的检测方法在测定结果上具有可比性 C. elegans 寿命产生相似的结果²⁰野生型 C. elegans (N2) 在以下条件下培养： 20 °C 通常存活20至25天，我们在传统方法中均观察到了这一现象（图 4A，黑线）和复制集方法（图 4B，黑色）。因此，这两种方法均能合理地近似野生型寿命。此外，一种新方法必须具备足够的分辨率以准确量化不同测试条件之间的变化，并具有足够的统计功效来检测出显著差异。在我们之前的研究中，我们发现Myc转录因子家族是决定因素 C. elegans 寿命 mml-1 和 mxl-2 编码 C. elegans 分别是哺.......

讨论

传统方法和复制集方法均需要同步时间老化动物。我们介绍一种利用次氯酸盐处理怀卵成虫以实现动物同步的方法，其中只有受精卵随怀卵成虫在处理中存活。这些胚胎在液体悬浮中孵化，并在第一幼虫期（L1）发育停滞。将L1期动物接种至食物上后例如 E. coli 通过表达目标基因的双链RNA（dsRNA），动物恢复发育。采用次氯酸盐处理 gravid 成虫以同步L1期动物的优势在于，剩余未接种的L1期动物可长期冷冻保存于液氮或-80 °C冰箱中。通过这种方式，可保留实验设置时每种品系的样本，为后续研究提供宝贵资源，并提高实验的可重复性。然而，尽管对gravid成虫进行次氯酸盐处理是获得同步化动物常用于衰老研究的方法²²，L1期停滞是一种饥饿应答。因此，一些实验室倾向于让孵化过程直接在培养板上进行，或者完全省去次氯酸盐处理步骤，而是让少数几条性成熟的成虫在培养板上产卵数小时（即 产卵）。在后一种情况下，移除亲本并追踪子代的寿命。据我们所知，目前尚未报道在M9中同步、在培养板上孵化或通过产卵获得的子代动物之间存在明显的寿命差异。然而，由于营养可利用性的变化与.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷）	Gold Bio	12481C100
FuDR（5-氟-2'-脱氧尿苷）	Alfa Aesar	L16497
24孔培养板	Greiner Bio-One	#662102
矩形未处理单孔板，128×86 mm	Thermo-Fisher	242811
600 µL 96孔板	Greiner Bio-One	#786261
2 mL 96孔板	Greiner Bio-One	#780286
透气性板封膜	VWR	60941-086
96针平板复制器	Nunc	250520
蛋白胨	VWR	90000-368
细菌琼脂	Affymetrix/USB	10906
HT115细菌中的秀丽隐杆线虫RNAi克隆文库—Ahringer	Source Bioscience	C. elegans RNAi Collection (Ahringer)	另见 Kamath 等，Nature 2003。
HT115细菌中的秀丽隐杆线虫RNAi克隆文库—Vidal	Source Bioscience	C. elegans ORF-RNAi Resource (Vidal)	另见 Rual 等，Genome Research 2004。该文库亦可从 Dharmacon 获得。
WormLife—用于复制组生存分析的软件	Samuelson 实验室	N/A	https://github.com/samuelsonlab-urmc/wormlife
L4440 空载体质粒	Addgene	1654	https://www.addgene.org/1654/
Wormbase			http://www.wormbase.org/
OASIS			https://sbi.postech.ac.kr/oasis2/
Graphpad Prism			https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/