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复制集方法：一种高通量定量测定秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）寿命的实验技术

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DOI：

10.3791/57819

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2018年6月29日

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1Department of Biomedical Genetics, University of Rochester Medical Center, 2Department of Biostatistics and Computational Biology, University of Rochester Medical Center, 3Non-Clinical Statistics, Bristol-Myers Squibb, 4Department of Microbiology and Immunology, University of Rochester Medical Center

本文内容

摘要

本文介绍了复制集（Replica Set）方法，这是一种以高通量且稳健的方式定量测量秀丽隐杆线虫（C. elegans）寿命/存活率及健康寿命的技术，从而能够在不牺牲数据质量的前提下筛选多种实验条件。本实验方案详细阐述了该方法的实施策略，并提供了一套用于分析复制集数据的软件工具。

摘要

复制集方法是一种用于定量测量寿命或存活率的方法 秀丽隐杆线虫 以高通量方式处理线虫，从而使单个研究人员在相同时间内能够筛选更多处理条件或实验组，且不损失数据质量。该方法仅需大多数从事线虫研究的实验室中常见的设备 秀丽隐杆线虫 因此易于采用。该方法的核心在于，在每个观察时间点检测群体中的独立样本，而非像传统纵向方法那样对同一样本进行长时间追踪。评分过程包括向多孔板的孔中加入液体，以刺激 秀丽隐杆线虫 以促进移动并便于量化健康寿命的变化。复制平板法的其他主要优点包括减少了琼脂表面暴露于空气污染物的机会（例如 霉菌或真菌污染）、对动物操作最少化，以及对偶发性评分错误（例如将仍存活的动物误判为死亡）具有较强容错性。为了适当地分析和可视化复制集（Replica Set）实验的数据，还开发了一款定制软件工具。该软件目前的功能包括绘制复制集实验和传统（Kaplan-Meier）实验的生存曲线，以及对复制集数据进行统计分析。本文提供的实验方案描述了传统的实验方法和复制集方法，并概述了相应的数据分析流程。

引言

理解衰老遗传基础最具变革性的技术进步之一是基于喂食的RNAi技术的发展 秀丽隐杆线虫1；在RNAi技术应用于实验之前，许多衰老表型在遗传学上难以进行研究。基于喂食的RNAi技术是通过在体内产生dsRNA实现的 E. coli 与之匹配的 内源性 秀丽隐杆线虫 mRNA：IPTG 诱导跨越任一插入片段的双向转录 秀丽隐杆线虫 cDNA 或质粒中的开放阅读框片段2。当 秀丽隐杆线虫 以完整的为食 大肠杆菌， 细菌产生的dsRNA通过SID-2跨膜蛋白从肠腔转运至肠细胞内3，然后通过SID-1在动物体内其余部分进行分布4在每个细胞内，外源性dsRNA被Dicer复合物加工成siRNA，siRNA通过碱基互补配对与成熟的mRNA结合，形成新的siRNA-mRNA双链。该双链被RISC复合物识别并切割，从而导致内源性mRNA降解5因此，只需更换质粒中的插入片段，即可使几乎任何基因的功能失活 秀丽隐杆线虫 基因组。这一发现促成了多个基于喂食的RNAi文库的建立——这些文库是转化后的 E. coli 可组合使用的品系，能够覆盖已知基因型的大约86% 秀丽隐杆线虫 基因6,7.

随着基于摄食的RNA干扰（RNAi）技术的发展，对秀丽隐杆线虫（C. elegans）进行的大规模筛选已发现了超过900个在失活后能够改变寿命的基因（这些基因与RNAi表型的关联信息已被收录于WormBase数据库中），我们将这些基因称为“衰老相关基因”（gerogenes）。其中大多数衰老相关基因在寿命调控中的作用，仅通过少数几项具有里程碑意义的研究，借助基于摄食的RNAi技术便得以揭示（详见图1A和补充文件1）。在某些情况下，这些衰老相关基因的鉴定仅依赖于在单个或少数几个时间点测量存活率，因而无法对RNAi处理引起的寿命变化提供可量化的评估。而在另一些情况下，这些基因的寿命变化已被定量分析，同时还评估了其他与年龄相关的表型。例如，我们先前鉴定出159个基因，它们对于胰岛素/IGF-1信号通路减弱的动物维持正常寿命及延长寿命均是必需的，并对其健康寿命（healthspan）的变化进行了量化。其中，有103个基因的失活会导致早衰表型，因为其缺失引发了一种或多种早衰迹象8。

尽管某些衰老相关基因已与100多项研究相关联（例如 daf-16、daf-2、sir-2.1），超过400个衰老相关基因的引用次数为10次或更少（图1B，以及 补充文件 2因此，尽管全面的基于喂养的RNAi筛选已发现并初步表征了数百个假定的衰老相关基因（gerogenes），但这些基因在寿命调控中的具体功能，以及它们编码产物之间的遗传相互关系仍缺乏深入研究。对衰老相关表型进行完整的纵向分析是揭示衰老相关基因之间遗传相互作用的前提。例如 上位性相互作用，合成致死相互作用 等等）。要更深入地了解衰老相关基因之间的遗传相互关系，需要一种高通量的定量方法，同时充分利用基于喂食的RNA干扰技术的优势。

衰老最常用的替代指标是寿命。测量寿命的传统方法 秀丽隐杆线虫 死亡率监测在小规模种群样本中随时间追踪个体动物的死亡情况。通过随时间推移对相对少量的动物进行定期观察，使用铂金丝或睫毛轻轻触碰，以运动反应作为存活的指标图 2A）。该方法已被广泛使用，因其可直接、简便地测量平均寿命和最大寿命。然而，这种传统方法耗时较长且通量相对较低，限制了在受控条件下可同时测量的动物数量和实验条件数目。最近的一项模拟研究发现，许多 秀丽隐杆线虫 寿命研究未检测足够数量的动物，因此无法可靠地检测不同条件之间的微小差异9此外，这种传统方法需要在一段时间内反复操作同一批动物，这可能引入污染，并可能损伤或杀死因衰老而日益脆弱的动物。

我们开发了一种用于测量 C. elegans 寿命的替代性"重复组"方法。具体而言，将大量年龄同步且基因型一致的动物群体划分为若干个小群体（即重复组）。生成足够数量的重复样本，以覆盖实验计划中的每个时间点。在每个观察时间点，对其中一个重复组进行评分，记录存活、死亡及删失动物的数量，随后丢弃该重复组中的所有动物。因此，在整个群体预期寿命期间，定期对一系列独立的亚群体进行取样（图2B）。采用重复组方法可避免对动物的反复触碰，也避免了反复暴露于潜在环境污染物的风险。每个时间点的存活状态评估完全独立于其他任何观察，从而最大限度地减少了操作干扰，并使通量至少提高了一个数量级。该方法使我们能够同时定量分析数百个RNAi克隆对寿命的影响8,10。

本文介绍了进行的详细方案 秀丽隐杆线虫 通过复制平板法和传统评分方法测定寿命 秀丽隐杆线虫 寿命。我们证明了这两种方法获得的结果相似。我们开发了软件，以协助对通过任一方法生成的寿命数据进行图形化分析，该软件我们依据 GPL V3 许可证免费提供（见 材料清单). "WormLife" 使用 R 语言编写11，包含用于绘制数据的图形用户界面（GUI），已在 Mac OS 和 Linux 系统中进行测试。最后，我们比较并分析了每种方法的局限性，并强调了在选择用于测量定量变化的方法时需考虑的其他因素 秀丽隐杆线虫 寿命

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方案

1. 传统 C. elegans 寿命评分方法

  1. 试剂的准备
    1. 确定通过饲喂法RNAi进行失活的基因。购买转化后的HT115菌株库存 E. coli2 含有目标基因的RNAi克隆。或者，将目标基因的cDNA亚克隆至L4440质粒的多克隆位点。
      注：HT115 是一种 RNase III 缺陷型 E. coli 具有IPTG可诱导的T7聚合酶活性的菌株，用于防止细菌内dsRNA的降解。对于不使用饲喂法RNAi的寿命研究，可使用HT115或OP50 E. coli 在标准NGM平板上可以使用.
    2. 每个测试条件准备 3–6 个（或更多）6 cm RNAi 平板（补充文件 3 用于配方）。RNAi 平板储存于 4 °C，在接种细菌前可保存数月。
    3. 培养转化后的 E. coli 过夜（16–20 小时，37 °C 摇床培养箱，转速为 180–220 RPM。
      注意： HT115 E. coli 在含氨苄青霉素（50 mg/mL）的LB培养基中培养。标准OP50 E. coli 不具有抗生素抗性，培养时不添加氨苄青霉素。培养体积取决于平板数量，通常为 8 至 100 mL 的 LB 培养基，具体根据实验设计而定。
      1. 通过离心（3,000 x g）浓缩细菌 g 在台式离心机中离心15–20分钟。吸除上清液，并将沉淀物重悬于起始体积的1/10体积中（即 在含氨苄青霉素的LB培养基中扩增HT115（或不含氨苄青霉素的LB培养基用于标准OP50），扩增10倍体积。
      2. 分装 200 µ向每个6 cm培养皿中加入L体积的浓缩10倍细菌。每种测试条件准备3–4个重复样本，并额外准备2个备用培养皿，以备污染时使用。制备培养皿时，应使用颜色编码或其他类似的编码系统对培养皿进行标记，使进行表型评分的实验人员对实验条件保持盲态。确保记录下编码信息。
      3. 在洁净环境中（如超净台）将敞口培养板放置至所有液体被吸收，或将加盖的培养板在实验台上过夜晾干。干燥过程中需监测培养板，确保琼脂表面干燥且未过度干燥。
        注意：平板过度干燥会导致琼脂开裂，从而引起 秀丽隐杆线虫 钻入琼脂。湿润的琼脂表面也有助于促进钻入行为。
    4. 将干燥的平板置于线虫盒中，在室温下放置过夜（最长24小时），以诱导dsRNA的产生。在室温放置1天后，将平板储存于4℃ °C下保存最多2周，置于密封的自封袋中（以防止培养皿干燥）。使用前，先将培养皿连同自封袋一起恢复至室温，以避免冷凝水引入空气中的真菌污染物。
  2. 同步化 秀丽隐杆线虫 经次氯酸盐处理
    注意：参见 补充文件 3 用于 M9 和次氯酸钠溶液的配制方法。
    1. 用M9缓冲液收集处于产卵期的成虫，使用带塞的玻璃移液管转移至两个15 mL离心管中。
    2. 以约2,000 rpm离心30秒。检查管底是否有线虫沉淀。吸除上清液。用M9溶液洗涤两次，每次均重复离心和吸除操作。
    3. 重悬 C. elegans 在 4 mL M9 中加入 2 mL 次氯酸盐溶液。立即涡旋震荡约 3 分钟，并周期性剧烈摇晃。3 分钟后，在解剖显微镜下观察是否有卵云出现。若 3 分钟后仍未释放出卵，再额外涡旋震荡 10–20 秒。
      注意：次氯酸盐处理时间至关重要。存活下来的为成年雌虫体内的卵。大约 3 分钟后，成年雌虫破裂，卵被释放出来。然而，若卵释放后在次氯酸盐溶液中停留时间过长，则会导致卵死亡。反之，若成年雌虫在次氯酸盐溶液中处理时间不足，则无法释放卵。
    4. 用 M9 溶液快速洗涤两次，步骤同 2.1.2。
    5. 重悬 秀丽隐杆线虫 将卵沉淀重悬于3 mL M9溶液中，转移至新的15 mL离心管。在3 mL M9溶液中于20℃旋转孵育过夜，使胚胎孵化 °C.
    6. 计算每单位体积的L1期动物（或胚胎）密度 µL 通过加入 10 µ在6 cm培养皿中，将L1溶液重复3次，计数L1期幼虫数量，以计算每份L1的平均数量/µL.
      注意：L1 期动物会随时间沉降，因此 L1 溶液应定期混匀。
    7. 每块平板接种 50 条 L1 期动物。将平板倒置，用橡皮筋固定，放入塑料线虫盒中。将盒子密封于大号自封袋中，转移至 20 °C °C 恒温培养箱
  3. 通过添加5-氟-2'-脱氧尿苷（FUdR）抑制子代产生
    1. 将动物培养至20℃下的L4阶段 °C. 检查同步化的动物在接种后约 40 小时是否已发育至 L4 期（步骤 2.1.7）。
      注意：秀丽隐杆线虫 发育时间会因温度不同而有所差异12 且对于尚未表征生长速率的突变体动物，其生长速率必须通过实验进行测定。
      1. 加入 160 µ向每个含有 L4 期动物的 6 cm 培养皿中加入 L 的 50× FUdR。
        注意：必须在 L4 阶段添加 FUdR。为方便起见，可通过将 1 g FUdR 溶解于 10 mL 超纯 H2O. 使用0.2 μm滤器对储备液FUdR进行过滤除菌 µm 滤膜和 10 cc 注射器。将约 1 mL 原液分装至无菌的 1.5 mL 离心管中。于 -20 冻存 °C.
    2. 检查培养皿中是否存在雄性 秀丽隐杆线虫 移除所有雄性个体。
      注意： 寿命通常针对雌雄同体而非雄性进行测量。即使存在FUdR，交配过的雌雄同体其寿命也短于未交配的个体。13雄性个体比雌雄同体个体更小且更细，可通过其特有的钩状尾部轻松识别。14.
    3. 将盒子放回拉链袋中。放回20 °C 培养箱
  4. 评估存活率
    1. 每天使用铂金丝或睫毛轻轻触碰线虫头部以评估存活率。将无法移动的个体记为死亡，并从培养皿中移除。图 2A记录每个观察时间点每种条件下观察到的死亡数量。
      注意：为降低评分偏倚的风险，实验人员在评分过程中必须对实验条件保持盲态，且不得参考此前时间点的结果。
    2. 将发生破裂、因其他明显发育缺陷死亡或爬到培养皿侧壁的线虫剔除：在每次观察时间点移除这些个体，并记录其数量，以便在统计分析中予以考虑。此外，若发现雄性个体，也应将其移除并记录观察到的数量。
    3. 从第1.4.1步开始每天重复，直至无动物存活。
      注意：若菌苔的 E. coli 如果菌落显著减少或平板上开始出现真菌生长，将所有剩余的线虫转移至含有相应RNAi和FUdR的新平板中。
  5. 数据分析——作图与统计
    1. 输入或打开使用非参数 Kaplan-Meier 估计法支持生存分析的软件中的记录观测数据15 和log-rank检验16 （参见 补充文件 3）。务必包含删失动物。如果观察到雄性个体，则不将其纳入。
      注意： 不同软件中的数据格式可能有所差异，但一种常见格式是将每只被观察的个体动物记录在单独的一行中。动物被观察到死亡时的实验时间点即为“事件”时间；若数据经过删失（censored），则“事件”时间为该动物被删失的时间点。通常会设有字段或复选框用于标记删失的观察数据。
    2. 绘制 Kaplan-Meier 生存曲线。若检测了多个条件，为提高可读性，单张图中选择少于六个条件。
      1. 检查数据中明显可见的问题——缺失的观察值、不符合预期的对照结果 等等。 — 并在统计分析前解决这些问题。
    3. 使用软件中的对数秩检验功能进行成对的统计比较。确保将所有关于删失结果处理方式的可选设置正确配置为适用于右删失数据。

2. 用于评分 C. elegans 寿命的复制集方法

注意： 传统方法每个条件需要 3–6 个培养皿（见上文 1.1.2 节），而 Replica Set 方法则需要更多培养皿（见下文步骤 2.2.2）。传统方法在整个实验过程中持续观察同一培养皿中的线虫（图 2A）。相比之下，Replica Set 方法中每个线虫仅被评分一次：在实验开始时设置大量相同的重复样本，以便在每个时间点（每次试验）分别对一个重复样本进行评分（图 2B）。

  1. 文库构建。
    注意：此处提供了有关处理RNAi克隆的额外细节，因为Replica Set方案适用于同时对大量RNAi克隆进行评分，并可扩展至每次实验超过100个克隆。RNAi克隆集合以甘油菌种形式保存，置于96孔板中。Replica Set实验使用24孔板，每个孔对应一种不同的测试条件，可能代表一组RNAi克隆、不同的化学处理、动物品系等。
    1. 组装RNAi克隆文库子库的布局，需满足以下条件：
      1. 确保在96孔板中，A1孔为不含载体的阴性对照。
      2. 每24个孔中随机插入一个额外的空载体对照。
      3. 将96孔板分为24孔一组的区块，使每个24孔板中均随机插入一个阴性对照图 2C).
      4. 在每组24孔中随机插入一个阳性对照图2C).
        注意：阳性对照取决于具体的实验问题。例如，在研究一组能够延长寿命的RNAi克隆时， daf-2(RNAi) 常被纳入考量。相反，在观察寿命缩短时， daf-16(RNAi) 经常使用。 
  2. 复制集的制备
    注意： 所需重复次数等于最少时间点数量图 2B。必须知道 事后 实验开始前应测量寿命的时长，以及评分频率（例如 一项持续40天、每隔一天进行评分的复制集实验，要求在实验开始时为每种条件至少准备20个复制集。建议额外准备约5个备用复制集（见下文2.2.2和2.2.2.3）。
    1. 为制备RNAi亚文库的新鲜印迹，接种200 µ每孔 600 μL LB+Amp，采用 96 孔板格式 µL 培养皿）使用 96 孔板复制器通过以下步骤：
      1. 将96针板复制器依次浸入50%次氯酸钠溶液和超纯水中进行灭菌2O 和乙醇。在漂白和乙醇步骤中，保持金属针浸没至少 30 秒。  乙醇浸泡后，迅速灼烧尖端。重复一次。
        注意： 务必彻底冲洗掉所有次氯酸钠，且不要将针头长时间暴露于次氯酸钠中，因为次氯酸钠会腐蚀不锈钢针头。
      2. 小心取下冷冻的96孔甘油保存文库板上的粘性封口膜，将已灭菌的平板复制器的针头轻轻但牢固地插入仍处于冷冻状态的甘油保存孔中进行研磨。接种200 µL LB + Amp 培养基中培养，并用透气膜密封接种后的平板。在室温下过夜培养。
      3. 按照步骤2.1.1对平板复制器进行灭菌，仔细去除液体培养板在过夜培养后的密封膜，将复制器针头浸入其中。将针头以均匀压力接触一个矩形LB amp+tet琼脂平板，通过轻微的圆形动作将细菌从针头转移到平板上，确保相邻菌斑之间留有足够间距。在37℃下让菌落在琼脂平板上过夜生长 °C. See 补充文件 3 用于制备LB + Amp/Tet平板。
      4. 使用前，将琼脂平板置于 4 °倒置 C 型（盖子朝下），用石蜡膜包裹。
        注意：将菌落平板盖子朝上存放会导致冷凝水造成RNAi克隆的交叉污染！菌落 E. coli 可在 4 ℃ 保存 2–8 周 °C，具体取决于特定的RNAi克隆，因为不同RNAi克隆在IPTG诱导产生dsRNA后维持效应的时间长短不一。对于小规模的RNAi克隆集合，应通过RT-qPCR实验确定RNAi效率，以确认基因敲低效果。 
    2. 计算一次实验试验所需的最少 24 孔板数量：（每套复制组的板数）×（预计的时间点数量）。应额外准备若干套复制组，以应对污染等操作问题。图 2B).
      注意：RNAi 克隆的总数决定了每个时间点制作一组复制所需的 24 孔板的数量（图 2C).
      1. 准备24孔板，步骤同1.1.2（补充文件 3 （配方见相关说明）。制备平板时进行标记，使用颜色代码或其他类似的编码方案，以确保进行检测评分的实验人员对实验条件保持盲态。
      2. 为每10个副本接种一组1.5 mL LB + Amp培养物（见2.2.2）。使用平板复制器（如2.1.3所述）以及2.1.4中的细菌菌落，在96孔深孔板中接种培养物。图2C， 左侧）。用透气膜密封，37 ℃培养 20 小时（ °C）振荡条件下。
      3. 接种 120 µ使用带可调枪头间距的6通道多道移液器，将过夜培养物的L加至每块平板图2C， 右侧）。将平板在超净台中敞口干燥，直至所有液体被吸收，避免过度干燥。将平板在室温下存放过夜。
  3. 同步化 秀丽隐杆线虫 使用次氯酸盐处理
    1. 计算实验所需的最少动物数量：所需最小 L1 期幼虫数 = (每孔 15–20 只动物)(每板 24 孔)(每套复孔板 X 板)(Y 套复孔板)。
      注意： 复制集方法所需的线虫数量多于传统方法。一个长满产卵成虫的10 cm培养皿可提供20,000–50,000条L1期幼虫，具体数量取决于产卵成虫的密度。同样，二十个6 cm培养皿可获得约30,000条L1期幼虫。建议准备的卵液数量应为所需最小动物数量的两倍。若准备用的群体已发生饥饿，需重新喂食或转移至新培养皿，并在有食物条件下连续传代至少三代后再进行实验。17,18务必冻存剩余的L1幼虫。
    2. 按照步骤 1.2 至 1.2.6 进行操作  与传统方法一样，获得同步化的L1期动物。使用6孔可调间距移液器和试剂储液槽，将15–20条L1期动物接种至每孔中，操作方式类似于1.2.7步骤。定期混匀L1动物悬液，以防止动物沉降。
  4. 通过添加5-氟-2'-脱氧尿苷（FUdR）抑制子代产生
    1. 执行步骤 1.3.1。  制备无菌的50倍浓缩FUdR储备液（见步骤1.3.1.1）。
    2. 当动物达到 L4 期时，加入 25 µ使用六通道可调间距移液器向24孔板的每个孔中加入L的50倍浓缩FUDR。
  5. 评估存活率
    1. 取出一组重复平板，用M9溶液浸润各孔，记录每孔中的总动物数，然后用线虫挑取工具轻轻触碰不移动动物的头部图 2B动物无法移动则记为死亡。记录后弃去已评分的培养板。每日记录存活率。
      注意：  破裂、出现明显形态缺陷、发育失败或爬到孔壁侧边的动物应予以删失处理，即从死亡数和总数中均予以排除。
      1. 在每个时间点，将每孔中被删失的动物数量与其他数值分开记录。
      2. 不要对无食物或受污染的孔进行评分例如 真菌或黏液）；此类孔视为删失。若所有动物均表现出形态学或发育缺陷，该孔也应视为删失。记录此RNAi克隆/孔在该时间点的删失事件。
      3. 完成一个重复组平板的评分后，将其丢弃。此后每天继续评分一个新的重复组，直至所有孔中的线虫全部死亡。为降低评分偏倚的风险，实验人员在评分过程中必须对实验条件保持盲态，且不得参考此前时间点的评分结果。
      4. 若某孔中所有线虫在特定时间点均已死亡，则在当天评分后，检查该孔中所有线虫是否已在连续两个时间点被评分为死亡。若是，则后续时间点无需再对该孔进行存活性评分。
      5. 进行额外的独立实验重复。将连续实验重复的结果与之前实验重复的结果分别记录，并注明实验重复次数。

3. 绘制数据图表

注意：采用复制集方法时，需通过曲线拟合来估算平均寿命和最大寿命。C. elegans 死亡率的评估参数符合logit曲线19。  由于大多数生存分析工具不支持logit曲线拟合，因此开发了一款新程序用于绘制logit曲线（适用于复制集方法）；该程序也支持Kaplan-Meier曲线（适用于传统方法）。

  1. 开始使用该软件。下载当前版本的发布压缩包（参见材料部分）。将压缩文件解压到一个文件夹中。有关其他安装说明，请参阅解压后文件夹中的“readme”文件。
  1. 启动绘图界面。找到 "code" 从zip文件解压出的文件夹中的目录例如  “/Users/UserName /Desktop/WormLife/code”
    1. 在 R 控制台中输入以下命令，并将路径替换为之前确定的文件夹路径。每输入一行后按回车键：1) setwd(“/Users/UserName/Desktop/WormLife/code”)，2) source(“plotGUI.R”)，3) openMain()。
    2. 等待界面在新窗口中加载，显示默认屏幕，如图所示 图 3A让 R 在后台运行。
  2. 将数据格式化为逗号分隔值（CSV）或制表符分隔值（TSV）文件。根据分析类型指定列及列名。预格式化的示例数据见补充文件4（Replica Set）和补充文件5（传统/Kaplan-Meier）。
    注意： 数据必须在以下内容中指定 "长" 格式， 即 每个菌株/处理组在每次试验的每个时间点对应一行数据。推荐使用 CSV 文件格式以确保不同平台间的最佳兼容性。
    1. 删除对应于被跳过或删失的观察值的行。检查是否存在缺失值或非数值，因为这些可能导致数据导入时出错。
    2. 对于传统的Kaplan-Meier分析方法，不要合并来自独立实验的数据，应分别绘制生存曲线。对于Replica Set分析，应合并多个实验的数据，然后使用相应软件进行分析。 "TrialView" 功能（参见 6.3.3.4）。
  3. 使用绘图界面
    1. 加载数据文件（"导入" 在 "文件" 菜单）使用对话框。要打开 ".csv" 文件，将下拉菜单中的文件类型更改为 ".csv" （默认为“.txt/.tsv”），导航至包含数据文件的文件夹。此处的文件为 Replica Set 示例数据补充文件 4).
      注意：当已有数据集打开时导入文件，将替换当前数据集。
    2. 选择要导入的文件以启动导入向导，该向导将引导完成识别所选文件的各列图 S1A 用于复制集）。如果输入数据对应于复制集实验，请选择 "Logit" 用于研究类型。
      注意：Replica Set（图 S1A）以及传统（Kaplan-Meier）（图 S1B).
    3. "绘制数据". 选择“添加曲线”以开始绘制数据。（一条曲线对应一组实验条件。软件提供了一些功能，可协助处理测试了多种条件的实验。）
      1. 绘制对照条件——以示例数据为例，N2（WT）与L4440（空载体）RNAi组合是合适的。选择 "添加行" 在……之下 "图表" 菜单以启动添加曲线向导：选择要绘制的条件以及表示该曲线的图形参数。
        1. 若要手动添加不同条件的曲线，请重复步骤 3.3.3.1 中的操作。
        2. 要更改某条线的颜色或绘图符号，请选择 "修改行" 在……之下 "图表菜单".
        3. 要移除某一行而不清除所有行，请选择 "删除行" 在……之下 "图表菜单".
        4. 要清除当前图表中的所有线条，请选择 "清晰线条" 在 "图表菜单".
        5. 要覆盖自动选择的 x 轴（时间）最大值，请使用 "设置 X 轴刻度" 在 "图表菜单".
          注意： 纵轴（存活比例）始终以20%为间隔显示100%（顶部）至0%（底部）。横轴始终以5为间隔显示。坐标轴标签未在图中绘制，以便在保存图像后灵活添加标签。
      2. 要保存当前显示的图表为 JPEG 格式图像，请使用 "保存图表" 选项 "文件菜单"；仅保存当前图表。
      3. 对于在同一实验中为多种不同条件创建单独的图表，该软件支持定义并绘制 "系列".
        注：在进行大规模实验时，采用系列设计概念可提高实验效率。
        1. 若从空白图表工作区开始，添加与系列中所有图表保持一致的对照条件对应的曲线（参见 3.3.3.1）。
        2. 在“图形”菜单中使用“定义系列”来定义系列。选择与系列中第一条线对应的条件；仅能选择一个。为该线条选择图形参数（线条颜色和绘图符号），如 3.3.3.1 所述。
        3. 查看不同测试条件的图表。使用主图窗口两侧以及顶部菜单栏中的左右箭头按钮，切换不同条件下的“系列线”显示。图 3A- C).
          注意：如果所选的系列线与之前添加的对照/参考线条件相同，新线可能会重叠显示。
        4. 定义系列以启用其他特定功能（保存系列图表和试验视图——后者详见3.3.3.4）。定义系列后，从“文件”菜单中选择“保存系列图表”选项，将为该系列中每个图表生成单独的图像文件，并保存至新建的文件夹中。
      4. 试验视图——可视化 Replica Set 实验中独立试验的结果。如果一个或多个样本组进行了多次独立试验，应分别绘制各次独立试验的数据以及所有试验合并后的数据，以评估独立试验间的一致性（参见 图 3D).
        1. 按照 3.3.3.3 中所述设置系列。不同试验将针对每个“变化”样本组分别绘图，并与指定的参考/对照样本的相应试验进行对比显示。
        2. 要保存 TrialView 图像，请前往 "打印试验视图" 在“数据”菜单中；系列中的每个图表将输出为一张 JPEG 图像。
          注意：示例结果位于 图3D 适用于包含两次试验的情况。
    4. 复制集数据的中位寿命汇总表。通过直观检查曲线以确保数据拟合合理，然后选择 "摘要表" 在“数据”菜单中选择保存各样本类型中位寿命值（logit 曲线中 50% 存活率对应的时间）的表格选项.
  4. 通过复制集方法生成数据的统计评估
    1. 对于来自复制集实验的两组之间的统计分析，修改并运行随发布压缩文件提供的 R 脚本（参见“WormLife 统计分析模板脚本.R”）。
      注意：运行该脚本无需具备 R 语言使用经验。附加说明已包含在文件的注释中。该脚本可直接用于示例 Replica Set 数据的分析。用户生成的数据需采用适当格式（参见 补充文件 4）也可以被分析。
      1. 在 R（R GUI 或 RStudio）中打开脚本文件。
        注意：这将显示脚本内容但不会执行。
      2. 修改必要文件的路径，以匹配其在您计算机上的实际位置。
        注意：这些文件路径必须是 "完全合格" （即应包含完整的文件位置，包括文件夹）
        1. 修改路径（文件/文件夹位置） "wlDir" （目录所在位置） "数据文件" （待分析的 Replica Set 数据文件）， "补充文件" （如适用，运行比较的规格说明），以及 "outputPath" （结果文件将写入的位置）
      3. 设置列名称在 "指定数据文件中的列" 如果待分析文件中的列名与示例文件不同，请在相应部分进行设置。为每个参数指定一列。若研究中包含多个品系，但无RNAi（或其他处理），则在数据文件中包含一列，其条目为空或所有行相同例如 无处理 等等。).
      4. 设置 "补充文件" 参数。如果 "补充文件" 如果参数设置为 NA，则将运行所有可能的组间两两比较。
        注：组别由品系/基因型与处理方式的组合定义，二者连接后显示为“品系_处理”。对于包含多个组别的大规模研究，可提供一个指定比较项的 CSV 文件。参见示例文件“comps_rsm_example.csv”。
      5. 设置蒙特卡洛重采样的迭代次数"k.resamp"，默认值为 1,000。
        注意：当执行的迭代次数过少时，可能返回 P 值为 0；在此类情况下，应报告为“p <0.01”（如果 k.resamp = 100），或 "p <0.001" （如果 k.resamp = 1,000） 等等。
      6. 运行脚本： "源文本" RStudio 中的按钮（编辑窗口右上角）或 "源文档" 在 "编辑" R 图形用户界面中的菜单。（执行可能需要一些时间。）
      7. 当 R "繁忙" 指示器不再显示时，打开输出目录——其中将包含每次比较的结果表格（中位生存时间、p值、中位寿命变化百分比）。

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结果

在任何新方法的开发过程中，必须确保该新方法能够重现以往方法所获得的公认结果，并达到领域内的标准。我们此前已通过实验表明，Replica Set 方法与传统的检测方法在测定结果上具有可比性 C. elegans 寿命产生相似的结果20野生型 C. elegans (N2) 在以下条件下培养： 20 °C 通常存活20至25天，我们在传统方法中均观察到了这一现象（图 4A，黑线）和复制集方法（图 4B，黑色）。因此，这两种方法均能合理地近似野生型寿命。此外，一种新方法必须具备足够的分辨率以准确量化不同测试条件之间的变化，并具有足够的统计功效来检测出显著差异。在我们之前的研究中，我们发现Myc转录因子家族是决定因素 C. elegans 寿命 mml-1 和 mxl-2 编码 C. elegans 分别是哺...

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讨论

传统方法和复制集方法均需要同步时间老化动物。我们介绍一种利用次氯酸盐处理怀卵成虫以实现动物同步的方法，其中只有受精卵随怀卵成虫在处理中存活。这些胚胎在液体悬浮中孵化，并在第一幼虫期（L1）发育停滞。将L1期动物接种至食物上后例如 E. coli 通过表达目标基因的双链RNA（dsRNA），动物恢复发育。采用次氯酸盐处理 gravid 成虫以同步L1期动物的优势在于，剩余未接种的L1期动物可长期冷冻保存于液氮或-80 °C冰箱中。通过这种方式，可保留实验设置时每种品系的样本，为后续研究提供宝贵资源，并提高实验的可重复性。然而，尽管对gravid成虫进行次氯酸盐处理是获得同步化动物常用于衰老研究的方法22，L1期停滞是一种饥饿应答。因此，一些实验室倾向于让孵化过程直接在培养板上进行，或者完全省去次氯酸盐处理步骤，而是让少数几条性成熟的成虫在培养板上产卵数小时（即 产卵）。在后一种情况下，移除亲本并追踪子代的寿命。据我们所知，目前尚未报道在M9中同步、在培养板上孵化或通过产卵获得的子代动物之间存在明显的寿命差异。然而，由于营养可利用性的变化与...

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披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

本研究工作得到了以下机构的资助：罗切斯特大学教务长办公室及医学与牙科学院院长办公室，通过健康科学计算创新中心（HSCCI）提供；艾略特医学基金会老龄化新学者奖学金（AG-NS-0681-10）。资助机构在研究设计、数据收集与分析、发表决定以及稿件撰写过程中均未发挥任何作用。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷）Gold Bio12481C100
FuDR（5-氟-2'-脱氧尿苷）Alfa AesarL16497
24孔培养板Greiner Bio-One#662102
矩形未处理单孔板，128×86 mmThermo-Fisher242811
600 µL 96孔板Greiner Bio-One#786261
2 mL 96孔板Greiner Bio-One#780286
透气性板封膜VWR60941-086
96针平板复制器Nunc250520
蛋白胨VWR90000-368
细菌琼脂Affymetrix/USB10906
HT115细菌中的秀丽隐杆线虫RNAi克隆文库—AhringerSource BioscienceC. elegans RNAi Collection (Ahringer)另见 Kamath 等，Nature 2003。
HT115细菌中的秀丽隐杆线虫RNAi克隆文库—VidalSource BioscienceC. elegans ORF-RNAi Resource (Vidal)另见 Rual 等，Genome Research 2004。该文库亦可从 Dharmacon 获得。
WormLife—用于复制组生存分析的软件Samuelson 实验室N/Ahttps://github.com/samuelsonlab-urmc/wormlife
L4440 空载体质粒Addgene1654https://www.addgene.org/1654/
Wormbasehttp://www.wormbase.org/ 
OASIShttps://sbi.postech.ac.kr/oasis2/ 
Graphpad Prismhttps://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ 

参考文献

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RNA FUdR L1

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