复制集方法: 一种高通量方法定量测量秀丽线虫寿命

Adam B. Cornwell; Jesse R. Llop; Peter Salzman; Juilee Thakar; Andrew V. Samuelson

doi:10.3791/57819

方法文章

复制集方法: 一种高通量方法定量测量秀丽线虫寿命

DOI：

10.3791/57819

⸱

2018年6月29日

Adam B. Cornwell¹ , Jesse R. Llop¹ , Peter Salzman²^,³ , Juilee Thakar⁴ , Andrew V. Samuelson¹

¹Department of Biomedical Genetics, University of Rochester Medical Center, ²Department of Biostatistics and Computational Biology, University of Rochester Medical Center, ³Non-Clinical Statistics, Bristol-Myers Squibb, ⁴Department of Microbiology and Immunology, University of Rochester Medical Center

本文内容

摘要

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在这里, 我们描述了复制集方法, 一种定量测量C. 线虫寿命/生存和 healthspan 的方法, 以高通量和健壮的方式, 从而允许筛选许多条件而不牺牲数据质量。该协议详细介绍了策略, 并提供了用于分析副本集数据的软件工具。

摘要

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复制集方法是一种以高通量方式定量测量秀丽线虫的寿命或存活的方法, 从而使单个调查人员能够在相同数量的时间内筛查更多的治疗或条件。没有数据质量损失的时间。这种方法需要在大多数实验室中发现的常见的设备与C. 线虫, 因此是简单的采用。该方法的中心是在每个观察点上对一个种群的独立样本进行化验, 而不是随着时间的推移与传统的纵向方法进行抽样。评分需要在多井板块的井中加入液体, 这会刺激C 线虫移动并促进量化 healthspan 的变化。复制集方法的其他主要好处包括减少琼脂表面暴露于空气中的污染物 (例如霉菌或真菌), 对动物的最小处理, 以及对零星错误评分的鲁棒性 (例如, 当动物仍然活着)。为了对副本集样式实验中的数据进行适当的分析和可视化, 还开发了一种自定义软件工具。该软件的当前功能包括绘制副本集和传统 (卡普兰) 实验的生存曲线, 以及副本集的统计分析。这里提供的协议描述了传统的实验方法和副本集方法, 以及对相应数据分析的概述。

引言

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在了解衰老的遗传基础方面, 最具变革性的技术进步之一是在¹线虫中发展基于喂养的 rna 干扰;在实验性地使用 rna 干扰之前, 许多衰老的表型不是遗传的。以喂养为基础的 rna 干扰是通过生产大肠杆菌中的 dsRNA 与内源c. 线虫mRNA: IPTG 诱导双向转录跨插入的任何c. 线虫cDNA 或一部分的在质粒²中打开阅读框架。当C. 线虫饲料在完整的大肠杆菌,由细菌产生的 dsRNA 通过 SID-2 跨膜蛋白³从流明传输到肠道细胞, 然后通过 SID-1⁴分布到其余的动物。在每个细胞内, 外源 dsRNA 由 Dicer 复合体处理成 siRNA, 通过互补基配对与成熟的 mRNA 相互作用, 创建一个新的 siRNA-mRNA 双工。这种双工是由 RISC 复合体和劈裂的, 从而降解内源 mRNA⁵。因此, 仅仅改变质粒的插入, 你就可以使几乎任何基因在线虫基因组中的功能失效。这一发现导致了几个大的基于喂食的 rna 干扰库的创建--转化的大肠杆菌种群的集合, 可以结合起来以达到约86% 已知的C. 线虫基....

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方案

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1. 传统的线虫寿命评分方法

试剂的制备
1. 通过基于喂养的 rna 识别基因进行灭活。购买已转换的 HT115大肠杆菌²的股票, 其中含有对利益的 rna 克隆。另外, 亚克隆的基因 cDNA 的 multicloning 的 L4440 质粒的网站。
  注: HT115 是一种 RNase III. 型大肠杆菌菌株, IPTG 诱导 T7 聚合酶活性, 用于防止细菌中 dsRNA 的降解。对于不使用基于喂养的 rna 干扰的寿命研究, 可以使用标准 NGM 板上的 HT115 或 OP50大肠杆菌.
2. 为每个测试条件准备 3–6 (或更多) 6 厘米的 rna 干扰板 (配方的补充文件 3 )。在细菌播种4摄氏度前, 将 rna 干扰盘贮存到几个月。
3. 一夜之间生长转化为大肠杆菌(16–20 h, 37 °c 震动孵化器在 180–220 RPM)。
  注: HT115大肠杆菌生长在 LB 与氨苄西林 (50 毫克/毫升)。标准 OP50大肠杆菌是不耐药性的, 并在没有氨苄西林的情况下生长。区域性体积取决于板块的 #, 但通常介于8到100毫升的磅之间,....

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结果

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在任何新的方法的发展中, 新方法概括从以前的方法中接受的结果, 并符合领域内的标准势在必行。我们以前的经验表明, 复制集和传统的测定C. 线虫寿命的方法产生类似的结果²⁰。野生型线虫(N2) 维持在20摄氏度通常生活在20和25天之间, 我们观察到的传统 (图 4A, 黑线) 和副本集方法 (图 4B, 黑色)。因此, 这两种方法都合理地近似野生型寿命。同样重要的是, 一个新的方法有决心准确地量化测试条件和统计能力之间的变化, 以检测重大变化。在我们之前的研究中, 我们发现, 转录因子的 c-myc 家族是C. 线虫长寿的决定因素。mml-1和mxl-2编码的同系物哺乳动物蒙多 A/碳水化合物反应元素结合蛋白 (ChREBP) 和 Mlx 分别。在线虫和哺乳动物中, 这些 c-myc.......

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讨论

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传统和副本集方法都需要对年代衰老动物进行同步处理。我们包括一种方法, 使动物使用次氯酸钠治疗妊娠成人, 只有受精卵与妊娠成人生存治疗。这些胚胎孵化在液体悬浮和发育停止在第一幼虫阶段 (L1)。在将 L1 动物播种到食物上后 (如大肠杆菌表达 dsRNA 的基因), 动物恢复发育。用次氯酸盐治疗妊娠 L1 动物, 可以使残留的非种子选手 L1 动物在液氮或-80 摄氏度冷藏库中无限期地冷冻储存。这样, 在实验设置时, 每个应变的样本都被保留下来, 为将来的研究和提高重现性创造了宝贵的资源。然而, 虽然次氯酸钠治疗妊娠成年动物是一种常见的方式获得同步动物的衰老研究²², L1 逮捕是一个饥饿的反应。因此, 一些实验室倾向于允许孵化发生在盘子上, 或完全放弃次氯酸盐治疗, 并允许一些怀孕的成年人产卵几个小时 (即鸡蛋躺)。在后一种情况下, 父母被删除, 后代的寿命被遵循。据我们所知, 在 M9 的动物, 在盘子上孵化, 或从卵产卵的后代之间, 没有明显的寿命差异。然而, 鉴于营养可用性的变化与寿命的变化密切相关, 在这些同步方法之间, 特定的.......

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披露

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作者声明他们没有竞争的财政利益。

致谢

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本手稿所描述的这项工作的经费由下列机构提供: 教务长大学院长办公室和医学院和牙科院长办公室, 通过卫生科学中心进行计算创新 (HSCCI);埃里森医学基金会新学者老龄化研究 (AG-NS-0681-10) 资助者在研究设计、数据收集和分析、决定出版或编写手稿方面没有任何作用。

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材料

本文使用的材料清单
姓名	公司	目录编号	评论
IPTG（异丙基 β-D-1-噻半乳糖吡喃糖苷）	Gold Bio	12481C100
FuDR（5-氟-2'-脱氧尿嘧啶）	Alfa Aesar	L16497
24 孔培养板	Greiner Bio-One	#662102
Retangular 未处理单孔板，128x86mm	Thermo-Fisher	242811
600 µL 96 孔板	Greiner Bio-One	#786261
2mL 96 孔板	Greiner Bio-One	#780286
透气板密封	VWR	60941-086
96 针板复制器	Nunc	250520
细菌蛋白胨	VWR	90000-368
细菌琼脂	Affymetrix/USB	10906
HT115 细菌中的秀丽隐杆线虫 RNAi 克隆文库 - Ahringer	来源生物科学	秀丽隐杆线虫 RNAi 集合（Ahringer）	另见 Kamath 等人，Nature 2003。
HT115 细菌中的秀丽隐杆线虫 RNAi 克隆文库 - Vidal	Source Bioscience	秀丽隐杆线虫 ORF-RNAi 资源（Vidal）	另见 Rual 等人，基因组研究 2004 年。这个库也可以从 Dharmacon 获得。
WormLife- 用于复制集存活分析的软件	Samuelson Lab	N/A	https://github.com/samuelsonlab-urmc/wormlife
L4440 空载体质粒	Addgene	1654	https://www.addgene.org/1654/
Wormbase			http://www.wormbase.org/
绿洲			https://sbi.postech.ac.kr/oasis2/
Graphpad 棱镜			https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/

参考文献

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Timmons, L., Fire, A. Specific interference by ingested dsRNA [10]. Nature. 395 (6705), 854(1998).
Kamath, R. S., Martinez-Campos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stran....

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