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藤壶 Balanus improvisus 作为海洋模式生物——培养与基因表达

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DOI：

10.3791/57825

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2018年8月8日

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1Department of Marine Sciences, University of Gothenburg, 2Department of Chemistry and Molecular Biology, University of Gothenburg, 3IVL Swedish Environmental Research Institute

本文内容

摘要

藤壶Balanus (Amphibalanus) improvisus是研究渗透压调节和防污性能的模式生物。然而，其自然的季节性繁殖导致藤壶幼虫（cyprid larvae）的供应不可预测。本文介绍了一种全年培养B. improvisus的实验方案，包括幼虫的生产。同时展示了利用人工培养的藤壶进行基因表达研究的方法。

摘要

藤壶是海洋甲壳类动物，成体固着生活，幼体为自由游动的浮游幼虫。藤壶 Balanus (Amphibalanus) improvisus 因其对低盐度具有极强的耐受性，作为研究渗透调节机制的模型尤为相关。它也被广泛用作附着生物学研究的模型，特别是在防污研究中。然而，自然的季节性繁殖导致用于研究的大眼幼虫供应不可预测。本文提供了一种全年培养的方案 B. improvisus 已开发出该方法，并详细阐述了生产流程中的所有步骤（即，成体在面板上的培养、藤壶幼虫的采集与培育，以及成体和幼虫的饲料投喂）。该描述还提供了故障排除的指导，并讨论了关键参数例如，污染物的去除、高质量饲料的制备、所需人力以及优质海水的重要性）。每个培养批次最多可收获约12,000个无节幼体，每周可完成四个批次，因此每周最多可生产近50,000条幼体。所采用的培养方法 B. improvisus 在很大程度上也可能适用于其他具有自由游泳幼虫的海洋无脊椎动物。本文提供了从成体中分离多种组织以及制备高质量RNA以进行基因表达研究的实验方案。同时描述了如何利用培养的成体和人工培育的藤壶幼体，在多种实验设计中研究基因表达与外界因素之间的关系。通过研究Na⁺/K⁺-ATP酶在不同盐度条件下基因表达的变化，展示了利用培养藤壶进行基因表达研究的应用实例。+/+ ATP酶和水通道蛋白。

引言

藤壶是一类海洋甲壳动物，成体固着生活，幼体则自由游泳，属于浮游生物。在约1200种藤壶中，大多数栖息于浅海区域，许多种类常暴露于低盐度环境中。其中一种，即海湾藤壶Balanus (Amphibalanus) improvisus（B. improvisus），几乎能耐受淡水环境，查尔斯·达尔文曾在乌拉圭拉普拉塔河河口的一条小溪中发现并描述过该物种1。由于其对低盐度具有极强的耐受能力，B. improvisus成为研究渗透压调节机制的特别重要模型2,3。该物种偏好半咸水环境，但可在盐度低至约1.6 psu、高至40 psu的水域中生存4。它是唯一能在半咸水的波罗的海中生存的藤壶物种。B. improvisus被认为起源于美洲东海岸，但由于船舶运输导致其扩散，如今已遍布全球5。它是一种主要的污损生物，常见于岩石、码头和船体表面，因此对于理解海洋和半咸水环境中构筑物表面生物污损的机制具有普遍研究意义6,7。

与其他大多数藤壶类似，B. improvisus 为雌雄同体，通过异体受精进行繁殖；其繁殖过程依赖邻近个体之间利用伸长的阴茎进行交配，并完成体内受精。繁殖期主要集中在每年5月至9月。B. improvisus 具有七个浮游幼虫阶段（包括六个无节幼虫阶段，随后为一个藤壶幼体阶段8）。受精卵孵化后形成可自由游动的无节幼虫，在水体中摄食并持续生活数周，随后蜕变为不摄食的藤壶幼体。藤壶幼体通过多种环境信号寻找适宜的附着位点，之后变态为固着生活的幼年藤壶9。该物种可在实验室条件下培养，在海洋中的寿命为1–2年（实验室培养条件下可达2–3年）。通常情况下，B. improvisus 的壳体直径可达10 mm（最大约20 mm），最大高度约为6 mm（在密集生长条件下可能更高）。该物种可通过其光滑的钙质均匀外壳（白色或灰白色）、壳板基部呈放射状纹路的钙质结构以及侧板的形态特征进行鉴定1,10。

藤壶 B. improvisus 作为研究渗透压调节的模式生物具有多项优势，尤其适用于分子与生理机制、生态互作以及进化后果等方面的研究。它也被广泛用于附着生物学的研究，特别是在防污研究及相关机制探讨中具有重要价值7,11,12,13。然而，其自然季节性产卵导致无节幼体的供应不可预测，限制了相关研究的开展。因此，能够在全年范围内完成该藤壶整个生命周期的人工培养，对于开展多种类型的分子与机制研究具有重要意义。此外，该物种广泛分布于全球的海水和半咸水水域，便于结合野外调查与实验研究。通过可控繁殖还可获得谱系明确的家系，用于长期培养14，而数月一代的世代周期也为长期的实验进化研究提供了可能。目前已有该物种的基因组草图和多个转录组数据，这些资源已被用于克隆多个基因（例如，在渗透压调节中具有重要作用的基因）2,3。

本实验方案的目的是描述如何建立并维持藤壶的培养体系 B. improvisus 全年用于对该生物的成体或幼虫进行基因表达研究。Rittschof 等15 简要描述了一种从无节幼体释放到大眼幼体附着阶段的藤壶培养方法，适用于该物种 Balanus amphitrite该方案已针对全年持续培养进行了优化 B. improvisus 在瑞典Tjärnö海洋研究实验室进行，并概述了生产流程中所有步骤的详细描述，包括藤壶幼虫的培育与养殖，以及成体和幼虫的饲料投喂。有关完整流程的概述，请参见 图1. 以一些常见的实验设置为例说明了该培养系统的使用，并在钠离子功能基因组学研究中进行了图示说明+/+ ATP酶和水通道蛋白，阐明其在渗透调节中的可能功能2,3有时需要检测特定组织中的基因表达，本文将介绍藤壶解剖的一些基本操作。在具备充足优质海水的条件下，藤壶的培养 B. improvisus以及可能的许多其他物种，均有望在全球范围内的海洋实验室中实现。

方案

1. 野外采集成体藤壶以建立新的亲本群体

  1. 部署热塑性（聚甲基丙烯酸甲酯）透明面板（110 × 110 × 1.5 mm）3在 ≈ 1–3米水深的平静水域，以从野外采集成体藤壶。使用可容纳多个面板的框架（图2A) 在每块板的顶部两个角上钻两个直径为6 mm的孔，并使用扎带将板固定在架子上，使板在水中垂直悬挂。
    1. 当藤壶附着（表现为板上出现微小的白色硬点）后，至少将板放置2–3周，以确保藤壶生长至足够大小（5 mm），从而可在转移至实验室时避免干燥或损伤。
  2. 当附着板上布满已附着的个体时，将其移入实验室 B. improvisus 达到一定大小的 ca0.5 毫米直径。
    注意：成体在野外生长至5 mm所需时间高度依赖于食物供应和温度。通常情况下，在Tjärnö海洋研究实验室（58.87°N）夏季条件下约需3周时间。 °N，11.14 °E）通常情况下，新亲本用的板通常在6月下旬投放，并于8月底回收。
  3. 在将附着板引入培养设施之前，需清除板上的其他生物。尤其重要的是要移除其他种类的藤壶。请注意，在培养过程中应定期清洁附着板以去除污染物种，这将显著提高亲本的存活率。
  4. 将面板垂直立于聚乙烯托盘（400 × 400 × 20 mm）内带有铣削凹槽的支架中3) (图2C 和 2E支架上的凹槽间距为15 mm。
  5. 为准备培养盘，在每个培养盘的底部制作一个进水口，在顶部对侧制作一个出水口。将每个培养盘的进水口连接至一个100 L的储水罐，储水罐内盛有约30 L海水，并以20℃的开放海水作为进水。 °C，以允许以一定速率进行流水交换 ca2 L/min
    注意：最多可将8个托盘连接至一个100 L的储液罐。
  6. 将100 L储水箱连接至温度控制的海水（20 °C) (例如， 由热泵通过与流入的海水进行热交换提供。
    注意：藤壶 B. improvisus 可在全海水盐度（30–35 psu）下生长和繁殖；然而，将盐度降低至 ca通过向100 L储水箱中添加淡水将盐度调节至25 psu，可提高培养系统中幼虫的产出量。

2. 从培养的藤壶幼体开始新世代成体

  1. 使用无毒、防水胶带将5块热塑性面板粘合在一起，制成顶部开口的立方体结构。
  2. 将立方体放入一个小托盘中（以防泄漏），并加入海水（25 psu）。将水保持在室温（ca. 20 °C). 在立方体顶部加入约 200 只藤壶幼体。
  3. 每天用 100 mL 的饵料喂养幼体 Skeletonema marinoi 每隔一天（见步骤5）在立方体中进行。
    注意：幼体藤壶在摄食方面可能存在困难 Artemia salina （参见步骤3），因为它们体积较大，刚附着的藤壶难以吞食。
  4. 每周换水一次。
  5. 两周后，当板上已有足够数量、直径至少为5毫米的稳定幼体时，拆开立方体结构，将带有幼体的板移至具有流水海水的托盘中，随后开始投喂藤壶 A. salina 无节幼体

3. 作为成体藤壶饲料的卤虫（Artemia salina）无节幼体的培养

  1. 建立一种培养系统用于 A. salina 使用一个1.5 L的塑料瓶，将瓶底切除，并将瓶子倒置固定在支架上，从侧面进行照明。将瓶口连接带有夹子的硅胶管，并将其连接至通气泵。图2D).
  2. 为了孵化卵，加入约15 mL干燥的休眠卵 卤虫 至 1 L 海水中。
    注意： 卤虫 卵在24–48小时后孵化为无节幼虫。如需延迟孵化， A. salina 无节幼体例如在周末期间，可以关闭灯光以略微降低温度。
  3. 收获 卤虫 无节幼体，关闭通气，并用铝箔（或类似物）遮盖瓶的上部 例如，一个罐头）。将瓶子下部 illumination 10 分钟。孵化 卤虫 无节幼体会向光游动。未孵化的休眠卵会沉至底部，而休眠卵的外壳则会漂浮在水面。
  4. 打开底部的夹子。收集中间组分，其中含有密集的游动无节幼体。
    注意：每天（除周末外）取1 L浓缩培养液 卤虫 将无节幼体悬液手动加入连接成体藤壶培养托盘的100 L储水箱中。避免使用空囊壳进行喂食，因为它们不提供营养，且主要会导致需要更频繁地清洁培养系统。

4. 藤壶幼虫的收集与培育

  1. 用淡水轻轻喷洒带有成年藤壶的面板进行清洗，必要时使用软毛牙刷清除藤壶壳体和面板上的附着物。同时，用热水（75 °C）清洗托盘（无藤壶）和管道。
  2. 将一个由90 µm浮游生物网固定在截短的PVC管末端（直径16 cm，高15 cm）制成的筛网放入带有溢流口的聚乙烯托盘（30 x 20 x 10 cm3）中，过夜收集B. improvisus幼虫（图2C）。
    注：筛网置于藤壶面板托盘出水口正下方，用于接收流出的水并过滤出无节幼虫。幼虫被截留在筛网中，而海水则从托盘的小溢流口排出。该小托盘可确保筛网始终不会干燥。
  3. 将一个30 L的桶置于大型水浴中，使用水族箱加热棒将温度维持在26 °C（图2E）。通过系统通入空气实现充氧和搅拌。
  4. 向桶中加入20 L过滤海水（0.2 µm；25 psu）。再加入1 L由两种硅藻S. marinoi和C. gracilis按60/40比例混合的微藻液（见步骤5），使桶中硅藻的初始密度约为5 × 104 个/mL。
    注：藤壶无节幼虫具有正趋光性。所用桶为不透明白色塑料材质，配有可透光的盖子。冬季期间，实验室内在白天（8:00–17:00）保持照明，夜间保持黑暗；夏季期间，白天大部分时间有自然光照入室内。
  5. 将收集到的B. improvisus无节幼虫转移至结晶皿（300 mL；直径90 mm；高50 mm）中。
  6. 从侧面照射结晶皿，吸引幼虫向光源聚集。用移液器收集靠近入射光一侧聚集的藤壶无节幼虫，并转移至另一结晶皿中。去除残留的Artemia幼虫。
  7. 将B. improvisus无节幼虫转移至含有1 L过滤海水的烧杯中。
  8. 轻轻搅拌烧杯使幼虫均匀悬浮，然后从烧杯不同位置取五个1 mL样品进行计数。将每个样品转移至微孔板中，在体视显微镜下进行观察。分别统计五个样品中的无节幼虫数量，并求和。
  9. 将总数乘以200（1,000 mL/5 mL），估算烧杯中幼虫的总数量（以千为单位）。若烧杯中幼虫密度过高，需稀释至每升最多14,000条幼虫（通常控制在11,000–12,000条/L范围内）。
  10. 向一个桶中加入1 L的B. improvisus无节幼虫，即每桶加入约11,000–12,000条幼虫。
    注：切勿加入过多无节幼虫，否则会导致食物相对不足，从而增加幼虫死亡率。
  11. 3天后，用90 µm筛网收集藤壶无节幼虫。随后用75 °C的淡水清洗桶体，重新注入过滤海水，添加等量的新鲜硅藻饵料（与初始添加量相同），最后将幼虫重新加入桶中。约6天（±1天）后开始出现大眼幼虫（cyprid）。
  12. 首先用90 µm筛网收集大眼幼虫（结构同上文第4.2点所述）。然后将未蜕皮的藤壶无节幼虫与大眼幼虫通过叠加筛网分离：上方为320 µm筛网，下方为160 µm筛网。B. improvisus无节幼虫将被截留在320 µm筛网中，而大眼幼虫则通过至160 µm筛网中。
    注：大眼幼虫可在黑暗条件下置于结晶皿中，于10 °C保存备用，最长可达ca. 6天。但储存可能影响幼虫的质量和行为表现，因此在比较不同处理的实验中，应尽量使用同一批次且储存时间相近的幼虫，以避免混杂效应16。

5. 藤壶无节幼虫饲料用微藻的培养

注意：微藻在三种不同类型的培养体系中进行培养：（i）保种培养，用于长期维持将用于扩大培养接种的藻种；（ii）起始培养，是扩大培养的第一步；以及（iii）生产培养，即大规模生产大量微藻，用作藤壶的饵料。

  1. 从藻类与原生动物培养中心（Culture Collection of Algae and Protozoa，CCAP）订购硅藻物种，用于喂养藤壶无节幼虫。这两种物种 Skeletonema marinoi （CCAP 菌株 1077/5）和 简单海链藻 变种 细长的 （CCAP 菌株 1085/3）均能获得良好的饲喂效果。
  2. 使用标称孔径为0.2的筒式过滤系统过滤所有用于藻类培养的海水 µm. （过滤后的海水也用于孵化） A. salina 卵以及藤壶无节幼虫的培养。对藻类培养所用的过滤海水进行高压灭菌（105 ℃） °C，5 分钟）。
  3. 使用经高压灭菌的海水配制微藻培养基，加入含无机营养盐、微量元素和维生素的Guillard's f/2溶液（参见Guillard 1975）17 有关详细配方）。此外，制备硅酸盐溶液（Na2SiO3），但需将其与f/2营养强化剂分开，以防止产生固体沉淀。
    ​注意：浓缩营养液和硅酸盐储备液的浓度配制为每升海水中各添加1 mL。
  4. 将用于藻类培养的所有设备在120℃下高压灭菌 °C 下 20 分钟。将含 1 mL f/2 培养基强化液和 1 mL 硅酸盐溶液的螺口试管进行高压灭菌。待灭菌后的玻璃器皿和液体冷却至室温后，将强化液和硅酸盐溶液加入海水中。
  5. 在带螺旋盖的40 mL试管中培养微藻种群。
    1. 用约30 mL的富集海水填充试管。使用无菌巴斯德移液管，取约1 mL保存2周的原代培养物接种。然后盖上螺旋盖，但不要拧紧，以允许一定程度的气体交换。如有条件，应在层流柜中进行接种，以降低污染风险。
      注意：建立藻类保种培养的目的是实现藻种的长期保存，并作为起始培养的接种源。保种培养每两周重新接种一次。
    2. 将新种群培养物暴露于强度为的白光下 ca. 25–50 µ摩尔-2s-1 （采用16小时光照-8小时黑暗的光暗循环）。将旧的原代培养物转移至低光照强度环境下作为备份。弃用所有已培养2周的原代培养物。
  6. 为扩大藻类生产培养规模，从保藏培养物中接种起始培养物，并在500 mL锥形瓶中进行培养。
    1. 将4个锥形瓶、移液管和棉塞与300 mL过滤（0.2 μm）海水一同高压灭菌 µm) 海水，以及4支含有0.3 mL f/2营养强化液和4支含有硅酸盐溶液的试管。将f/2营养强化液和硅酸盐溶液冷却至室温，加入锥形瓶中。接种 ca2周龄的原代培养物1 mL。
      注意：准备2个烧瓶 S. marinoi 和 2 个 C. simplex.
    2. 将烧瓶置于光照强度为50的摇床上 µ摩尔 m-2s-1当起始培养物中藻类种群密度达到较高水平（呈黄褐色）时，即可作为接种物用于生产培养，为藤壶幼虫提供食物。
  7. 在带有硅胶塞的4 L聚碳酸酯瓶中培养生产用藻液，硅胶塞上钻有两个孔并插入玻璃管。
    1. 将一根延伸至瓶底的玻璃管连接到空气泵 通过 一根带有0.2的硅胶管 µm 空气过滤器。确保第二根玻璃管末端刚好位于硅胶塞下方，并填充棉花，以允许注入的空气排出。
    2. 每周用过滤海水填充四个4 L瓶，并与瓶塞一同高压灭菌。此外，将4支含有4 mL f/2营养强化液和硅酸盐溶液的试管一同高压灭菌。
    3. 冷却后，向瓶中加入f/2营养液和硅酸盐溶液，然后接种三角烧瓶中启动培养物体积的一半。
    4. 将四个4 L的瓶子置于50–100的光照强度下 µ摩尔 分子-2s-1.
    5. 收获培养物后 ca1 周；此时密度已足够用于喂养藤壶无节幼虫。
      注意：生产培养的生命周期约为2周，这意味着任何时候都有8个活跃的生产瓶。

6. 利用藤壶设计实验研究

  1. 将带有幼体或成体藤壶的板片置于受控的水族箱中，在相同条件下进行培养。这称为共同花园实验，可用于研究局部适应性或表型可塑性。18，或研究基因表达在外部因素影响下的变化（例如盐度、温度或pH值
    ​注意：也可以直接使用从野外采集到面板上的藤壶。使用实验室培育个体的一个优势是在使用下一代后代时可以避免母体效应。
    1. 在选定的时间间隔内使藤壶暴露于特定环境条件下，随后收获成体例如用于基因表达研究）2.
  2. 用于研究基因表达的藤壶幼虫实验3将藤壶幼虫置于受控的水族箱中，在相同条件下培养幼虫。
    1. 在指定时间后，使用筛网过滤收集藤壶幼体（如步骤4.7所述），并根据以下方案提取RNA（步骤8）。

7. 藤壶的解剖

  1. 在进行解剖和DNA取样前及处理每个个体之间，均需清洁实验操作区域，包括所有解剖工具。操作台面使用含氯消毒剂清洁（镊子则使用96%乙醇）。
    注意：预先准备好含有固定液（乙醇或RNA稳定溶液）的已标记试管。
  2. 选择体型较大且短期禁食的个体（解剖前2天停止喂食）。使用牙刷清洁藤壶外壳，以最大程度降低其他物种（例如细菌、藻类）污染的风险，并用水冲洗干净。
    ​注意：解剖前对个体进行短期禁食的目的是避免DNA污染（例如肠道内的卤虫Artemia卵囊）。
  3. 将单个藤壶放置在平整的表面上，可附着于面板上，也可置于培养皿中。从成体中解剖相应组织。根据研究目的不同，藤壶的解剖方法有多种。
    1. 解剖方法A：尽快固定整个藤壶。
      1. 使用解剖刀将整个藤壶从面板上取下，将刀片插入藤壶下方并贴近面板表面。
        注意：大多数情况下，该操作可使基板几乎保持完整，从而不影响藤壶内部结构。
      2. 用镊子小心地从一侧敲裂外壳（图3），以便固定液更容易进入壳内。
        注意：若将藤壶放入试管前完全不破坏外壳，可能导致固定过程变慢，并影响后续DNA质量。
      3. 将破损的藤壶放入含有RNA保存液或乙醇的试管中。在溶液中至少固定24小时。固定完成后，可将动物从固定液中取出，置于解剖托盘上。随后可将刚毛肢（cirri）、外套膜（mantle）和躯体（soma）相互分离，并分别放入不同的试管中，用于后续DNA或RNA提取。
        注意：需注意观察藤壶内部是否存在带有受精卵的卵片层。若存在，应在进行DNA提取前将其移除，以避免样本中出现多个基因型。
    2. 解剖方法B：在固定前先将藤壶从壳中取出。
      ​注意：由于外套膜附着在钙质壳内侧，该方法可能无法始终成功采集到外套膜组织。但此法可用于快速获取个体的DNA样本。
      1. 使用解剖镊子小心地移除背板（tergal）和侧板（scutal）（图3），将镊子尖端插入背板与侧板之间，夹住一块壳板后轻轻拉出。
      2. 用镊子夹住刚毛肢，将藤壶整体垂直拉出，并直接放入96%乙醇或RNA稳定溶液中进行固定。
        注意：有时外套膜也会同时被取出，表现为一层带有深色色素的薄层上皮组织（在B. improvisus中可见）。若未同时取出，可用解剖刀从壳内侧刮下外套膜，随后放入乙醇或RNA稳定溶液中。
        注意：背板和侧板（如保持完整）可干燥保存，因其对物种鉴定具有重要价值10。若对物种存在疑问，建议在开始解剖前先对整个藤壶进行拍照记录。

8. 用于定量 PCR 的 RNA 提取

  1. 将用于RNA提取的成体放入RNA稳定溶液中，在4℃下孵育过夜（最长24小时） °C，然后于 -80 保存 °C.
    注意：藤壶的金星幼虫优先采用干冻法，在无RNA later的情况下直接于-80℃冷冻 °C，将样品放入冻存管中，随后将冻存管短暂浸入液氮（30秒），然后于-80℃保存 °C.
  2. 在提取RNA时，将藤壶置于冰上解冻，并保持其完整或解剖分离出所需组织（见步骤7）。
    注意：由于个体之间具有较高的遗传多样性（≈ 编码区存在3–5%的变异；Alm Rosenblad 等，未发表数据）建议汇集多个成体个体，以尽量减少后续qPCR步骤中个体间的序列变异影响。
  3. 用于RNA提取，加入350 µ将RNA提取试剂盒提供的裂解缓冲液加入含有2.8 mm陶瓷珠的匀浆管中。
    注意：与超声处理相比，陶瓷珠能获得更高的RNA得率代表性结果).
  4. 取一只成年藤壶（整体或组织）或用镊子收集至少20只大眼幼虫，放入匀浆管中。
  5. 直接使用珠磨机进行破碎和匀浆。
  6. 将含有样品和珠子的匀浆管放入珠磨机架中，以4.0 m/s的频率振荡20秒。将样品置于冰上冷却1分钟。重复此步骤2次。
  7. 根据市售RNA提取试剂盒的说明书制备RNA。
    注意：在使用RNA提取方法之前，应进行风险评估（包括阅读安全数据表），以识别可能存在的危险化学品，并确定是否需要使用通风橱及其他防护装备，包括手套例如，添加 β在RNA提取过程中向裂解缓冲液中添加β-巯基乙醇应在通风橱内进行。
  8. 定量 RNA。制备工作液，并将标准品和样品加至总体积为 200 µL. 涡旋混匀2–3秒，孵育2分钟。将试管插入荧光计中并读取数据。
  9. 使用分光光度计检测RNA样本是否存在蛋白质污染，并使用自动化电泳系统检测其RNA完整性代表性结果).
    注意：为获得高质量的样品，建议RNA的260/280 nm比值为2–2.2，DNA比值约为1.8。较低的数值表明存在蛋白质污染，需优化提取流程。

9. 基因表达：cDNA 合成与 qPCR

  1. 在制备qPCR用的cDNA之前，用DNase处理所获得的RNA，以去除残留的DNA。
    1. 通过在制备cDNA时加入RNA样本但不加逆转录酶，检测是否存在基因组DNA污染。若在未加逆转录酶的情况下制备的cDNA中仍能扩增出目标基因的PCR产物，则表明RNA样本中存在DNA污染。
      注意：对于用于RNA测序（采用下一代测序技术进行RNA-seq）的样品，DNase处理步骤的重要性较低。特别是对于RNA含量较低的样品，可省略DNase步骤，以避免在操作过程中损失过多RNA。
  2. 使用经DNase处理的RNA进行cDNA合成，所用RNA量应在商用cDNA合成试剂盒规定的范围内，但通常至少使用50 ng。
  3. 设计qPCR引物时，应使其退火至目标基因序列在个体间高度保守的区域，同时尽量降低引物与基因旁系同源物（paralogs）之间的序列相似性。有关Na⁺/K⁺-ATP酶和水通道蛋白基因表达研究中所用特异性引物对的详细信息，请参见相应的已发表文献。+/ K+ ATP酶3 和水通道蛋白2 (图5).
    注意：此目的可使用来自数百个藤壶幼体或数个成体的RNA-seq测序数据。
  4. 为用于表达水平标准化的基因设计引物（例如，肌动蛋白）。用于肌动蛋白扩增且效果良好的引物序列为：上游引物：5'-CATCAAGATCAAGATCATCGC-3'，下游引物：5'-ATCTGCTGGAAGGTGGAC-3'。
    注：肌动蛋白（actin）是一种常用的对照基因，但其他基因也已被建议作为参考基因，并在藤壶中进行了测试。19除肌动蛋白外，还测试了RPL8、36B4、EF1和NADHd1作为参考基因的适用性3结论表明，体部、蔓足、成体和大眼幼体之间的各个参考基因表达水平没有显著差异。
  5. 通过向含有 SYBR Green、dNTP、聚合酶和 0.3 μM 引物的反应体系中逐步增加 cDNA 用量（通常为 0.25–50 ng），优化所设计引物的退火温度。 µ每对正向和反向引物各 M。
  6. 按照以下条件运行 qPCR 实验：初始变性温度为 95 °C，变性步骤 95 °C，20 秒，退火温度 55–63 °C，20 秒，以及 72 ℃ 的延伸反应 °C，30秒。总共进行40个PCR循环。
    注意：引物效率应介于90–105%之间，计算公式为 E = (10^(-1/斜率)-1) × 100，其中斜率为绘制cDNA浓度的对数值与其循环阈值（Ct值）关系曲线时所得直线的斜率。
  7. 使用适量的cDNA（通常为1–10 ng），按照步骤3中所述的PCR方案并采用确定的最佳退火温度进行qPCR。
    注意：仅针对表达量极低的基因才使用较高量的 cDNA。

结果

通过所述的B. improvisus成体藤壶培养方法，每周最多可产生四批无节幼体。几乎每晚都可收集无节幼体，但这需要更多人力和基础设施（当亲本群体中藤壶数量较多时，培养系统会持续释放幼体）。幼体生产的一个额外限制因素似乎是高质量饵料的供应，尤其是关于硅藻Skeletonema的供应。每个培养批次最多可获得约12,000只无节幼体，因此每周最多可培养50,000只无节幼体。然而，某些周产生的幼体数量可能减少至十分之一。单个成体每天最多可产生7,000只幼体14，这意味着每个批次由1–2只成体释放幼体。在一周内，约70–90%的收集到的无节幼体将发育为大眼幼体（每周最多可获得约30,000只大眼幼体），可用于附着实验和分子研究。

需要强调的是，不同批次的藤壶幼体特征存在差异，且总体而言，这些差异幅度较大 之间 批次多于 在……之内 批次之间存在差异。例如，在附着实验中，不同批次的附着成功率在30%至70%之间波动。这很可能是由于不同采样时期释放幼虫的成体个体之间存在遗传差异所致。当然，若希望对实验结果做出更具普遍性的结论，建议重复实验（生物学重复）应包含多个批次的无节幼虫。批次间的变异对实验设计提出了要求，在基因表达研究中应设置适当的对照并进行标准化处理。然而，即使在实施了多种统计学标准化方法以显著降低批次间差异后，批次效应通常仍会有所体现（未发表数据）。

根据所提供的实验方案，仅需20个藤壶无节幼体即可获得平均约500 ng的高质量RNA，且不受藤壶附着发育阶段的影响（表1）。RNA质量通常通过18S与28S峰之间的比值来评估（两个峰的预期位置见图4）。然而，对于藤壶及许多其他节肢动物而言，在分析过程中经加热处理后，28S rRNA会发生断裂，并与18S峰共同迁移20。因此，在此类藤壶的分析中，理论上仅出现单一的rRNA峰。从该检测结果（图4）可以明显看出，使用陶瓷珠进行匀浆所获得的RNA完整性最高，因此是首选方法。所获得的RNA在数量和质量上均足以构建高质量的测序文库，平均每个样本可产生约7000万条读长（具体读长数量当然取决于测序过程中的多重测序水平）。此外，该RNA量也足以用于大量基因的cDNA合成及qPCR表达分析。

图5展示了对水通道蛋白及Na+/K+ ATP酶（NAK1）剪接变体进行qPCR分析的结果，其中研究了环境信号变化所引发的表达改变2,3。对NAK1长型和短型剪接变体的相对表达水平进行比较，结果显示在低盐度条件下，长型NAK1 mRNA的表达量是短型NAK的两倍（图5A）。因此，数据表明在低盐度环境下，可变剪接使得长型成为主要形式。在水通道蛋白方面，两个负责水分转运的旁系同源基因AQP1和AQP2表现出差异性表达（图5B）。特别是在外套膜组织中，AQP1在较低盐度下显著下调，而AQP2则无此现象。相反，AQP2在体部组织中于较低盐度下表现出轻微的表达上调。这些发现为研究圆纹藤壶（B. improvisus）不同离子转运蛋白和水通道蛋白在渗透调节中的功能作用奠定了基础。

海洋生命周期过程示意图；DNA/RNA取样；无节幼体、藤壶幼体培养，附着实验。
图1：成年个体培养全过程及用于基因表达研究的RNA提取概述。 为启动新培养，将附有成体/幼体的面板固定于框架上，并在海中1-3米深度处进行部署。数周后，将带有成体/幼体的面板垂直置于实验室托盘的支架中。每个托盘可容纳约40块成体面板。每块面板约有100个成体，每个托盘共培养约4,000个成体个体。成体藤壶以 卤虫 可全年保存。从托盘中每周收集数次无节幼体。 通过 通过筛网过滤。收集的无节幼体被转移至保持在 26 °C 在水浴中饲养并投喂微藻。无节幼体培育至蜕变为不摄食的腺介幼体，通过过滤收集。可通过腺介幼体在新面板上附着定居，在实验室中建立新的附着面板，用于全年培养体系的更新，或用于特定实验设计以改变外部条件。实验结束时或在特定时间点，从幼体/成体中提取RNA。 请点击此处以查看此图的放大版本。

用于海洋科学实验的水生装置，包含围隔、沉降和水过滤系统。
图2：培养过程中一些关键步骤的图像。 (A此图像显示了用于从野外采集新种群样本的带孔板框架。B) 该图像显示了带有成年藤壶的面板 B. improvisus 置于托盘中的架子上，板件之间相距约2 cm。C) 该图片显示了左侧带有藤壶板和饲喂罐的托盘。每个托盘均设有出口，用于放置筛网以收集无节幼虫。D此图像展示了产物的生成过程 卤虫 为成体藤壶提供食物。E此图像显示了在设定为恒温水浴中的桶内培养无节幼体的过程 26 °C. 请点击此处以查看此图的放大版本。

藤壶解剖结构示意图；标注有壳顶板、躯干部、刚毛，用于教学研究。
图3成年藤壶初始解剖步骤描述：将身体从外壳中取出。 (A用镊子轻轻从开孔处插入，夹住一片鳃盖板，轻柔地将其拉出，以暴露动物体。B) 通过抓住触手下方的体部来拉出动物体。C) 该图展示了藤壶的整体解剖结构。当藤壶身体被抽出时，外套膜及可能已受精的卵（位于卵巢内）仍保留在壳腔中。关于藤壶解剖结构的说明（更详细的描述参见 Anderson）9：藤壶的壁板向内倾斜，共同形成一个类似火山锥的结构。其开口处为 aperture（ aperture ），由两片楯板覆盖，这两片楯板构成一扇可开闭 aperture 的门，称为 operculum（ operculum ）。藤壶通常具有一块钙质的基板，通过胶状物质牢固地附着在基底上；然而，某些藤壶种类则缺乏这种钙质基板例如, S. balanoides）。藤壶由深色色素的外套膜（即壳瓣）分泌出外骨骼。外套膜为双层结构，其外表面发生钙化而变得坚硬，而内表面未钙化，因而具有柔韧性。在壳口内部，蔓足（cirri）处于收缩状态，这些是藤壶用于悬浮摄食的胸部附肢。卵巢位于藤壶基部附近，而精巢则分布于躯干部。本图引自 Panova 等21 并已获得施普林格出版社的出版许可。 请点击此处以查看此图的放大版本。

荧光分析；时间依赖性强度图；44秒处出现发射峰。
图4：通过毛细管凝胶电泳测定rRNA完整性。 RNA通过两种不同的匀浆方法制备：（A）超声处理和（B）陶瓷珠。y轴的单位FU代表荧光单位。请点击此处查看该图的放大版本。

柱状图；盐度和pCO2对NKA-L1数据的影响；躯干、触手和外套膜中水通道蛋白的表达；统计显著性。
图5：B. improvisus 中与渗透调节相关基因的两项不同研究的基因表达结果。（A）该图显示了通过qPCR检测的Na+/K+ ATP酶基因NAK1剪接变体在不同盐度和pCO2水平下的差异表达情况3。在低盐处理条件下，长亚型（NAK1-L）的表达量显著高于短亚型（ANOVA，P < 0.001）。（B）该图显示了B. improvisus成体在不同盐度暴露期间水通道蛋白（aquaporin）的表达情况2。采用qPCR方法测定水通道蛋白相对于肌动蛋白（actin）的表达水平。成体个体分别在3种不同盐度（3、20和33 PSU）下孵育14天。RNA提取时，分离成体的躯干、触手和外套膜组织。两图中的误差线均表示标准差。** 和 *** 分别表示显著性水平（ANOVA），对应P值为0.01和0.001。本图经Lind et al.2,3修改后使用，并已获得PLoS ONE许可转载。请点击此处查看该图的放大版本。

附着阶段总RNA量（ng）
自由游泳阶段512
探索阶段：近距离搜索518
附着的藤壶幼体550
新变态的幼体832

表1：RNA得率。 本表显示了使用RNA提取试剂盒从在附着过程不同阶段采集的藤壶幼虫（20只为一组）中提取的RNA数量。

讨论

瑞典塔尔诺海洋研究实验室（Tjärnö Marine Research Laboratory）的藤壶培养系统已持续运行20多年，被用于多个不同研究领域的研究。近年来，已有超过30篇科学论文利用该培养系统发表，研究领域包括防污技术13,22、流体动力学23、化学生态学24、气候变化16、进化生物学5以及分子生物学2。

为避免选择出更适应实验室环境的个体（这些个体可能无法代表野生种群），建议每年从野外重新采集新的亲本群体。此外，每年更新培养种群也是一种良好的操作规范，因为在正常情况下，成体每年的死亡率约为 50 - 80%。然而，如果研究目的是建立近交系或开展实验进化研究，则应仅使用实验室培育的家系。

在Tjärnö海洋研究实验室的板面上采集 B. improvisus 的适宜时间为6月至8月，因为此时海水中存在充足的藤壶幼体。应每周检查板面，观察藤壶附着的开始时间，并人工清除板面上除 B. improvisus 以外的其他附着物种（例如，贻贝、海鞘、苔藓动物、水螅体、纽形动物/管栖蠕虫以及其他藤壶物种）（例如，使用牙刷）。在Tjärnö周边区域，存在三种浅水藤壶物种（B. improvisus、Semibalanus balanoides 和 Balanus crenatus）。然而，在7月至8月期间，B. improvisus 是光滑硬质表面最主要的附着优势种。S. balanoides 的附着期主要在早春，且更偏好天然基质（例如，石块）。B. crenatus 在夏季可能以较低数量出现在板面上。

从培养的藤壶幼体（cyprids）开始培育新的成年藤壶种群也是可行的，这在已建立具有特定性状的特定谱系或进行实验进化研究时尤为重要。启动新一代成年藤壶最便捷的方法是在实验室中将藤壶幼体诱导沉降于热塑性板材上。这些附着了新生藤壶幼体的板材亦可用于实验处理或野外暴露实验。在紧急情况下，也可使用从附近地点采集的带有成年藤壶的石块例如，以蒂厄尔诺海洋研究实验室所在的伊德弗约登为例） B. improvisus 很常见。这些已建立的成虫与图中所示成虫的处理方式相同，即放入托盘中并提供食物饲养 通过 流过系统。流动池也可用于建立带有藤壶的实验组25这些是侧边带有浮游生物网的流通式小室，浮游生物网表面不利于藤壶幼体附着，仅以面板作为幼虫的附着表面。

建立包含所有生活阶段的长期有效藤壶培养体系涉及多个关键步骤。B. improvisus 的培养方法在很大程度上可能也适用于其他具有自由游动、摄食浮游幼虫的海洋无脊椎动物。某些物种的培养流程已有详尽描述（例如，蓝贻贝和多种牡蛎）26，而对于其他海洋无脊椎动物，能够覆盖其整个生命周期的长期培养体系实例仍较少。对藤壶（B. amphitrite）进行培养的最早成功尝试之一由 Rittschof et al.15 完成。在筹建藤壶培养设施之前，必须具备长期的资金支持和人力资源。维持这种全年连续的藤壶培养体系至少需要一名人员投入半职工作。未来在生产流程的部分环节（主要是微藻培养）可能存在一定程度的自动化潜力27。此外，成功实施培养的关键前提是能够获得大量高质量的海水。微藻、Artemia 和藤壶的培养过程本身不涉及特殊的生物安全操作。然而，若需测试某些防污物质或有毒化学品，则可能需要采取特殊防护措施。

培养板每周检查数次污染情况。培养所用的海水取自特约诺海洋研究实验室外科尔斯特峡湾40米深度处，通过泵抽取后，经两道砂滤器过滤，再进入实验室水循环系统。若不对海水进行过滤，培养中的污染会严重得多。定期清除培养板上的碎屑和其他无脊椎动物至关重要例如，匍匐状生长的水螅类生物以及通过野外海水供应进入系统的捕食性纽虫）。例如，即使培养物营养充足且整体状态良好，但若未产生幼体，问题可能在于存在抑制交配行为的纽虫。显然，瑞典塔尔诺海洋研究实验室（Tjärnö Marine Research Laboratory）培养系统中许多污染物具有瑞典西海岸特异性，而在其他地理区域，可能出现不同类型的污染生物，其危害程度也可能更为严重。在瑞典西海岸，板面上极少发现其他藤壶物种的污染。偶尔会出现 S. balanoides 已被发现，但这是一个非常微不足道的问题（最多仅一个 S. balanoides 污染物，10,000 B. improvisus 样品）。缺乏污染物种很可能取决于夏季建立新培养物时所采用的方案，此时幼虫来自 B. improvisus 占主导地位。此外，还明显富集了 B. improvisus 因为该物种对光滑表面具有选择性13.

必须清除死亡的成年藤壶。如果将空壳留在面板上，它们可能成为卤虫（Artemia）无节幼体以及多种污染物种的庇护所。此外，人们注意到死亡个体会影响邻近个体的健康状况，可能是在分解过程中释放了有毒化合物所致28。成年个体死亡的另一个后果是，部分个体会变得孤立，与其他成年个体距离过远而无法交配（尽管藤壶相对于其体型拥有动物界中最长的阴茎）。这些孤立的个体虽能存活，但无法产生幼虫。然而，这些孤立的成年个体可被轻柔地移除，且不损伤其基板，然后水平放置于其他个体附近，以促进交配。也可通过将带有单个成年个体的面板彼此靠近放置（但保持足够近的距离以实现异体受精）来进行交配。通过这种方式可建立遗传品系14。

制备高质量的饵料并几乎每天投喂对培养至关重要。即使数天不投喂，也可能导致幼体释放量下降。此前关于饵料成分的测试表明，硅藻对藤壶无节幼体的生长和存活至关重要。多种硅藻种类均可作为适宜的饵料，但无节幼体摄食可能需要较小或单生的细胞（直径小于10 µm）。实验已证实，S. marinoi、C. simplex 和 T. pseudonana 均适合作为 B. improvisus 无节幼体的饵料，且易于培养。此外，处于指数生长期的藻类通常具有更高的饵料质量。另有报道指出，硅藻对于建立高效的 B. amphitrite15 培养体系也至关重要。关于硅藻重要性的一种理论认为，它们具有独特的脂肪酸组成，尤其富含高度多不饱和的20:5脂肪酸29。已有研究表明，某些脂肪酸对牡蛎幼体的成功发育具有重要作用30。

多年来，藤壶养殖中从未出现过有害疾病。在许多商业无脊椎动物养殖中，如牡蛎和贻贝，疾病相当常见，且可能造成严重危害。在野生种群中也已报道过病毒的有害影响。1925年，法国的本土牡蛎被葡萄牙牡蛎Crassostrea angulata取代，但该物种在1970年左右因虹彩病毒而被彻底消灭31。近年来，全球范围内太平洋牡蛎Crassostrea gigas养殖中出现了大规模死亡事件，这似乎与牡蛎疱疹病毒1型有关32。迄今为止，尚未发表任何关于藤壶病原体、细菌或病毒的报告。然而，在正在进行的B. improvisus基因组项目中发现了病毒序列（Alm Rosenblad 等，未发表数据），但这些序列与疾病症状之间并无明显关联。此前曾向养殖体系中添加抗生素混合物以降低细菌感染风险；但目前该做法已被弃用，且至今未因此引发任何污染问题。

如果对海水进行加热（如上所述），过热可能是养殖生产过程中最严重的风险。当然，尽管可以使用传感器和适当的警报系统，但防止过热仍然具有挑战性。例如，向负责人发送电子邮件或短信）。过去此类事件曾导致培养物中成体大量死亡。这可能会造成严重损失，毁掉长期的时间和资金投入。特别是当已建立近交遗传系时，这种损失将是灾难性的。为确保这些品系的长期保存并防止意外丢失，有必要建立一种藤壶的冷冻保存方法。据报道，太平洋牡蛎的幼虫已被部分成功地冷冻并复苏33冷冻保存技术也是保护多种物种遗传资源的重要工具34即使来自无节幼体 B. amphitrite 据报道可在冷冻条件下存活35，发现20%的冷冻保存个体成功变态为藤壶幼体36然而，尽管冷冻保存对于细胞系的长期可持续性至关重要，但目前尚未被广泛应用；而这一技术对于维持选定细胞系而言确实必不可少，也是实现其稳定建立的关键步骤 B. improvisus 成为一个强大的海洋模型系统。

本文介绍了一种从成年个体中分离多种组织的实验方案 B. improvisus (即，纤毛、体部、外套膜和膜状基部物种内外套膜之间的软组织等。然而需要强调的是，其他组织也可被提取。例如 Tetraclita japonica formosana 已仔细分离并用于基因表达的RNA提取和RNA测序分析37. 此处所述的优化提取方案可从极少量起始材料中获得足量的高质量RNA用于测序。首先，将单个幼虫直接收集到匀浆管中，可最大限度减少在不同试管间转移过程中的样品损失。此外，在所测试的多种方法中，与超声处理或研杵匀浆相比，使用陶瓷珠进行匀浆在RNA得率和完整性方面均表现出最高效率。在设计基因表达或基因组学实验时，必须考虑到藤壶至少在遗传变异水平上存在较高的遗传多样性， B. improvisus藤壶在编码区的遗传多样性范围也达到3–5%（Alm Rosenblad） 等，未发表数据）。这自然对qPCR分析中引物的设计提出了特定要求，必须识别并选用更为保守的区域作为引物模板，以确保不同批次间基因表达结果的一致性。目标基因（如水通道蛋白和Na+/K+ ATP酶）的保守区域可通过分析从包含数百个个体的藤壶幼体群体获得的RNA-seq数据中的序列变异来确定。对于基因组分析，则需采集DNA。然而，从 B. improvisus 可能具有挑战性21.

总之，已建立的藤壶培养体系已被证明在多种实验研究中具有重要作用。特别是全年均可获得幼虫，使我们能够开展不受自然繁殖期限制的实验（对于B. improvisus，其自然繁殖期在夏季）。所获得的幼虫可用于开展多种实验研究，包括附着实验、行为学实验、特定基因的表达研究，以及全基因组转录组学研究。

披露

作者声明无任何利益冲突。

致谢

本研究由瑞典研究理事会（VR）资助项目（项目编号：2017-04559）以及欧盟资助项目SEAFRONT（资助对象：Anders Blomberg）提供支持。特别是，培养设施的建立多年来得到了以下资助机构向Per R. Jonsson提供的资助支持：瑞典战略研究基金会（SSF）通过“海洋科学与技术”项目，以及MISTRA通过“海洋涂料”项目。Kent Berntsson在培养设施初期建设阶段发挥了关键作用。培养设施的进一步建设资金还来自海洋进化生物学中心（www.cemeb.science.gu.se），该中心获得了瑞典研究理事会FORMAS和VR联合资助的林奈奖项目支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
聚甲基丙烯酸甲酯（Plexiglas）板Plastic produkter, Bromma, 瑞典透明玻璃
1.5 L PET 瓶
卤虫（Artemia）INVE 水产养殖公司，比利时我们测试过不同公司产品；这家确实是最好的
Skeletonema marinoi（CCAP 菌株 1077/5）CCAP（藻类与原生动物培养库）；苏格兰 菌株 1077/5
Chaetoceros simplex var. gracilis（CCAP 菌株 1085/3）CCAP（藻类与原生动物培养库）；苏格兰 菌株 1085/3
Millipore 滤筒式过滤系统Millipore 
标称孔径为 0.2 µm 的滤筒Millipore 滤筒型号 CWSS01S03适用于大体积液体的高容量过滤
聚碳酸酯瓶Nalgene可高压灭菌
RNA laterQiagen76106 用于保存 RNA 的固定溶液
TURBO DNA-free 试剂盒Invitrogen/Thermofisher Scientific  AM1907用于去除制备 RNA 中残留 DNA 的 DNase 试剂盒
iScript cDNA 合成试剂盒Biorad1708890cDNA 合成试剂盒
SYBR Green supermixBiorad1708880用于定量 PCR 的染料
RNeasy 小量试剂盒Qiagen74104用于成体或大量动附着幼虫（cyprids）的 RNA 提取
软组织匀浆用 CK14 型 2 ml 管PrecellysKT03961-1-003.2用于匀浆的陶瓷珠
RNeasy 微量试剂盒Qiagen74004用于少量动附着幼虫（cyprids）的 RNA 提取

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藤壶 Balanus improvisus 作为海洋模式生物——培养与基因表达
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