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方法文章

哺乳动物Bestrophin离子通道的表达与纯化

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DOI：

10.3791/57832

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2018年8月2日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Pharmacology and Physiology, University of Rochester, School of Medicine and Dentistry

本文内容

摘要

离子通道的纯化通常具有挑战性，但一旦成功，就有可能使其得以 体外 对通道功能与结构的研究。在此，我们描述了表达与纯化哺乳动物 bestrophin 蛋白（一类 Ca²⁺ 激活的氯离子通道）的逐步操作步骤。2+-激活的 Cl- 通道

摘要

人类基因组编码四种立妥宾同源蛋白，即 BEST1、BEST2、BEST3 和 BEST4。BEST1 由 BEST1 基因，是一种钙2+-激活的 Cl- 通道（CaCC），主要在视网膜色素上皮（RPE）中表达。BEST1的生理与病理意义体现在已有超过200种不同的突变被发现于该基因。 BEST1 基因已被遗传学研究证实与至少五种视网膜变性疾病相关，例如Best卵黄样黄斑营养不良（Best病）。因此，在单分子水平上理解bestrophin通道的生物物理特性具有重要意义。然而，获得纯化的哺乳动物离子通道蛋白通常是一项具有挑战性的任务。本文报道了一种利用BacMam杆状病毒基因转导系统表达哺乳动物bestrophin蛋白，并通过亲和层析和尺寸排阻层析进行纯化的方法。所获得的纯化蛋白可用于后续的功能与结构分析，例如脂双层膜中的电生理记录和晶体学研究。重要的是，该技术流程可被推广用于研究其他离子通道的功能与结构。

引言

Bestrophin 是一类在从细菌到人类等多种物种中均保守存在的离子通道1。在人类中，位于染色体 11q12.3 的 BEST1 基因编码一种主要在眼部视网膜色素上皮（RPE）细胞的基底外侧膜上表达的膜蛋白 Bestrophin-1（BEST1）2,3,4。BEST1 由 585 个氨基酸组成，其中前约 350 个氨基酸在不同物种间高度保守，并包含其跨膜区域，该蛋白在人类中作为钙激活氯离子通道（CaCC）发挥作用1,5,6。此外，鸡和Klebsiella pneumoniae中的 BEST1 同源蛋白均以同源五聚体形式发挥功能7,8，提示其在进化过程中具有高度保守性。

在人类中，已有超过200种突变被发现位于 BEST1 基因已临床关联到一组称为bestrophinopathies的视网膜变性疾病1,9目前已报道五种特定的Bestrophinopathy，包括Best病、成人发病型卵黄样视网膜营养不良、常染色体显性遗传性玻璃体视网膜脉络膜病变、常染色体隐性遗传性Bestrophinopathy以及视网膜色素变性3,4,10,11,12,13,14这些疾病可导致视力下降甚至失明，目前尚无有效治疗方法。为了开发治疗手段并实现潜在的个体化医疗，深入理解这些疾病的发病机制至关重要。 BEST1 致病性突变影响 BEST1 通道的功能与结构15为此，研究人员需要 获得纯化的bestrophin（野生型和/或突变型）通道并进行 体外 分析5,8.

第一个关键步骤是在哺乳动物细胞中表达来自高等物种的Bestrophin通道。由于杆状病毒转导HEK293-F细胞（即BacMam系统）是一种高效表达膜蛋白的异源表达方法16,17，本实验方案采用一种优化的BacMam载体（pEG BacMam），以实现目标蛋白的高效表达18，此处的目标蛋白为哺乳动物Bestrophin同源物。该载体已被用于表达多种膜蛋白，包括G蛋白偶联受体、核受体以及其他离子通道18。此外，已有证据表明，利用该系统表达的蛋白适用于晶体学研究18。在HEK293-F细胞中实现高水平表达后，可通过层析技术纯化蛋白；具体而言，对于Bestrophin蛋白，可采用亲和层析和尺寸排阻层析两种方法。

一旦该方案针对一种Bestrophin通道蛋白优化完成，即可分别通过平面脂双层技术和X射线晶体学方法，对纯化的蛋白进行功能和结构分析5,8。总体而言，这些技术为Bestrophin及其他离子通道的功能与结构研究提供了一个强大的研究流程。

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方案

1. 生成BacMam表达型杆状病毒

  1. 将目标哺乳动物Bestrophin蛋白的编码序列插入pEG BacMam载体18，载体中包含烟草蚀纹病毒（Tobacco Etch Virus, TEV）蛋白酶识别序列，并在蛋白C端连接GFP-10x His标签。
  2. 将表达质粒瞬时转染至贴壁生长的HEK293细胞中19,20,21,22,23。在荧光显微镜下使用10X或20X物镜、488 nm激发光源和510 nm发射滤光片观察GFP融合蛋白的表达情况（图1A）。
    注意：通常采用基于聚合物的转染方法，每35 mm培养皿使用1 μg质粒DNA。
  3. 按照先前所述方法在Sf9昆虫细胞中制备杆状病毒16,17。
    注意：用于感染HEK293-F细胞以进行蛋白表达的第3代（P3）病毒可在4 °C保存1个月。
  4. 通过噬斑形成实验测定P3病毒的滴度（感染单位）16,17。
    注意：由于目标蛋白带有GFP标签，一种更快的检测感染单位的方法是用系列稀释的病毒液感染Sf9细胞，48小时后计数荧光阳性细胞的数量。

2. 蛋白质表达

  1. 将 HEK293-F 细胞维持在 HEK293-F 表达培养基中，以悬浮培养方式在 37 °C、含 8% CO2 的湿润培养箱中培养。使用比培养液体积大 2-2.5 倍的一次性培养瓶，并在旋转平台上以 135 rpm 转速摇动培养。
    注意：建议在细胞传代数为 5 至 30 之间时进行感染操作，且所有操作应在细胞培养超净台内进行。
  2. 病毒感染前 24 小时，向 15 μL 细胞培养液中加入 15 μL 台盼蓝（Trypan blue），在显微镜下使用血细胞计数板检测细胞密度和活率。将细胞稀释至 0.6 x 106 个细胞/mL，并分别接种于两个 2 L 培养瓶中，每瓶加入 500 mL 预热至 37 °C 的培养基。
    注意：死细胞会被台盼蓝染成蓝色。理想的细胞活率应 >95%。
  3. 感染当天，检测细胞密度和活率（步骤 2.2）。
    注意：高细胞活率（>95%）对于实现高效的病毒感染和蛋白表达至关重要。预期细胞密度约为 ~1.0 x 106 个细胞/mL（由 2 x 500 mL 的 0.6 x 106 个细胞/mL 培养物过夜生长而来），总细胞数约为 ~1.0 x 109 个。
  4. 以感染复数（MOI）为 5 的条件将 P3 杆状病毒加入细胞中。为确定所需病毒接种量，请使用以下公式计算：
    体积计算公式：(MOI) * 总细胞数 / 感染单位；接种物制备示意图
  5. 将细胞置于含 8% CO2 的湿润 37 °C 培养箱中，在旋转平台上以 135 rpm 持续振荡培养 24 小时。
  6. 向细胞培养物中添加 10 mM 丁酸钠，并继续培养 48 小时。
    注意：对于某些蛋白，在添加丁酸钠后将培养温度降至 30 °C 可能有助于提高表达水平和稳定性。
  7. 在荧光显微镜下，使用 10X 或 20X 放大倍数、488 nm 激发光源和 510 nm 发射滤光片，观察绿色细胞的比例和荧光强度，该指标直接反映目标蛋白（bestrophin-GFP-10xHis）的表达产量（图 1B）。
    注意：绿色细胞比例计算公式为：100 x（绿色细胞数 / 总细胞数）。显微镜下观察到强烈的绿色荧光表明蛋白表达水平良好。
  8. 在 4 °C 条件下以 1,000 x g 离心 20 分钟收集细胞。弃去上清液，用磷酸盐缓冲液（PBS）重悬细胞沉淀，终体积约为 80 mL。将细胞悬液分装至两个 50 mL 圆锥形离心管中，在 4 °C 下以 1,000 x g 离心 20 分钟。将细胞沉淀在 -80 °C 下保存。

3. 蛋白质纯化

  1. 将含有细胞沉淀的锥形管置于室温搅拌水浴中孵育10-15分钟，使其解冻。用2倍（w/v）体积的缓冲液A重悬细胞表1) (例如， 10 g 细胞沉淀加入 20 mL 缓冲液（含蛋白酶抑制剂 Aprotinin、Leupeptin、Pepstatin A 和 phenylmethylsulfonyl fluoride，终浓度为 0.1–1.0 mM）。充分吹打混匀，以获得均一的细胞悬液。
  2. 使用高压均质机裂解细胞。将细胞悬液以7-10 MPa压力通过均质机，共处理3-4次，以实现完全均质化。每次处理间隔将细胞裂解液置于冰上冷却2-3分钟。
  3. 加入去垢剂 [例如， 2% w/v 溶级 n-十二烷基-β-D-麦芽糖吡喃糖苷（DDM）加入细胞裂解液中，4 °C 条件下振荡孵育 1 小时 20 °C 提取膜蛋白。
    注意：每种目标蛋白所需的去垢剂类型均需优化18,24.
  4. 在超速离心机中以 150,000 x g 离心 4 °C 1小时。
    注意：以下所有步骤均在 4 °C.
  5. 收集澄清的细胞裂解液，并使其流过5 mL His Trap Ni柱2+-NTA 亲和柱，预先用缓冲液 A 平衡表1).
    注意：离心后，澄清的细胞裂解液将位于底部沉淀与上层浑浊层之间。使用10 mL移液管小心吸取澄清裂解液，最后几毫升时换用1 mL移液器。避免接触沉淀，以免堵塞Ni2+ 柱层析；然而，少量上层物质残留无妨，或可通过过滤去除 1.5 μm 过滤器
  6. 用 25 mL 缓冲液 B 和随后的 40 mL 缓冲液 C 洗涤层析柱（表 2 和 3（分别）。
    注意：此处适合暂停操作，因为完整的纯化过程可能需要长达12小时，且蛋白质在连接柱子的条件下可保持过夜稳定。
  7. 将层析柱连接至快速蛋白液相色谱（FPLC）系统，并用13 mL缓冲液D洗脱柱上的蛋白表3）并进行分级分离。根据紫外吸收读数收集富含蛋白质的组分。
    注意: FPLC 条件如下：每管收集体积为 1.0 mL，预柱压力警报值设定为 0.3 MPa，流速为 0.5 mL/min。
  8. 使用微量分光光度计测定洗脱的蛋白质产物浓度，在280 nm处读取吸光度。
  9. （可选）为去除GFP-10xHis标签，按1:1的质量比加入TEV蛋白酶，并于 4 °C 30分钟
    注意：标签可能会影响纯化通道的功能或结构，也可能不会。根据步骤3.7–3.8中收集的蛋白体积和浓度计算TEV蛋白酶的用量。例如，若收集到10 mL洗脱产物，浓度为0.1 mg/mL，则总蛋白质量为10 × 0.1 = 1 mg，消化反应中将使用1 mg的TEV蛋白酶。
  10. 使用 15 mL 超滤离心管（50 或 100 kDa）在 4,000 × g 条件下离心浓缩蛋白 4 °C 至终体积400-500 μL （适用于FPLC上2 mL样品上样环）。
    注意：浓缩所需的离心时间取决于蛋白质的浓度和大小。为避免过度浓缩导致蛋白质沉淀，首次离心10分钟，然后观察剩余体积，并据此估算下一次离心所需时间例如， 2–5 分钟），依此类推，直至达到最终体积。每次离心间进行移液，以分散蛋白，使蛋白被拉至滤膜底部。
  11. 将浓缩后的蛋白质转移至新的1.5 mL离心管中，并去除浓缩产物中的任何沉淀或气泡。离心处理，转速为 >12,000 × g，5–10 分钟，于 4 °C 将上清液收集至新的1.5 mL离心管中。
  12. 使用1 mL注射器和圆头针将最终产物上样至FPLC系统，进行凝胶过滤色谱分析，所用凝胶过滤柱已预先用缓冲液E平衡（表5).
    注意: FPLC 条件如下：每管收集体积为 0.5 mL，预柱压力警报设定为 2.50 MPa，流经体积设定为 30 mL 缓冲液 E (表5，流速设定为0.5 mL/min。
  13. 请注意，性质良好的蛋白质会呈现为单个峰图2A）并收集对应于该峰的蛋白组分图2A).
  14. 使用 4 mL 或 0.5 mL 离心滤膜装置（截留分子量与步骤 3.10 相同）浓缩蛋白，在 4,000 x g 条件下离心 4 °C 5-的最终浓度10 μg/μL使用分光光度计检测最终产物的浓度（步骤 3.8）。
    注意：离心时间可能有所不同，因为最终产物体积在不同纯化实验中可能存在差异。通常离心时间为10-20分钟。建议在两次离心之间使用移液器轻轻吹打，以重新分散聚集在滤膜底部的蛋白质。
  15. 将浓缩的蛋白质转移至新的1.5 mL离心管中。通过离心去除任何沉淀，离心条件为 >12,000 × g，5–10 分钟，4 ℃ 4 °C. 将上清液转移至新的1.5 mL离心管中。制备 10 μL 用于在 -80 °C 下储存的等分试样80 °C 并保存一份2-5 μL 取少量等分试样，在4-15%梯度SDS-PAGE凝胶上以9 V/cm电压电泳运行（图2B).
  16. 通过质谱法确认纯化蛋白的身份8.
    注意： 体外 分别可通过平面脂双层和X射线晶体学对纯化蛋白的功能和结构进行分析5,8.

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结果

在瞬时转染的贴壁HEK293细胞中观察到的荧光强度（图1A）可良好反映悬浮培养的HEK293-F细胞中目标蛋白的表达水平（图1B）。若目标蛋白在瞬时转染后的HEK293细胞中表达不佳或定位异常，建议考虑优化表达载体（例如，调整GFP标签的位置，或对目标蛋白引入突变或截短）。可通过小规模HEK293-F悬浮培养（例如，25 mL培养体系）优化蛋白表达条件，其中感染复数（MOI）和培养温度在以往经验中被证明最为关键。

成功的纯化在尺寸排阻色谱中表现为在预期洗脱体积处出现单一主峰（图2A），并在变性SDS-PAGE凝胶上表现为单一显著条带（图2B）。如果在尺寸排阻色谱中出现多个峰，应分别...

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讨论

本方案描述了一种用于表达和纯化哺乳动物Bestrophin离子通道的有效流程，可用于后续的in vitro分析。虽然尺寸排阻色谱需要使用FPLC设备，但亲和层析的所有步骤（包括结合、洗涤和洗脱）仅需使用注射泵即可完成。当使用注射泵将溶液（置于注射器中）推过层析柱时，必须在弹簧一侧进行支撑，以避免将气泡压入柱中。如果亲和层析后所得蛋白的纯度已满足后续实验要求，则可省略尺寸排阻色谱步骤，从而可能完全无需使用FPLC设备。

由于从pBacMam质粒构建杆状病毒需要约2周时间，为提高效率，可先通过收获瞬时转染的HEK293细胞，对性质良好的蛋白质同源物进行初步筛选（例如来自一个60 mm培养皿）并检测目的蛋白（GFP标记）在去垢剂中的行为（例如， DDM）结合荧光检测尺寸排阻色谱法（FSEC）18,24最有效的方法是关注在转染的HEK293细胞中表现出强荧光，且在FSEC中具有良好单分散性和稳定性的蛋白构建体。

...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本项目由美国国立卫生研究院（NIH）资助，资助编号为 EY025290、GM127652，以及罗切斯特大学启动资金支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
HEPES菲舍尔科技AC327265000 
NaCl菲舍尔科技AC446212500
甘油菲舍尔科技G33-500
咪唑菲舍尔科技AC301870010
MgCl2菲舍尔科技AC197530010 
TCEP菲舍尔科技AA4058704 
抑肽酶菲舍尔科技AAJ63039MA
亮抑蛋白酶肽菲舍尔科技AAJ61188MB 
胃蛋白酶抑制剂A菲舍尔科技AAJ20037MB
苯甲基磺酰氟菲舍尔科技AC215740050
DDM sol-gradeAnatraceD310S
DDM anagradeAnatraceD310
Sf-900 II SFM赛默飞世尔科技10902179
FreeStyle培养基赛默飞世尔科技12338018
NanoDrop分光光度计赛默飞世尔科技ND-2000
高压均质机AvestinEmulsiflex-C5
HisTrap柱GE17-5248-01
Superdex-200柱GE28990944
AKTA PureGE29018224
Ultra-15离心过滤装置密理博UFC910024
Ultra-4离心过滤装置密理博UFC810024
Ultra-0.5离心过滤装置密理博UFC505024
Optima XE-90超速离心机贝克曼库尔特A94471
Mini-PROTEAN Tetra电泳槽伯乐1658004
Mini-PROTEAN预制胶伯乐4561084
T100梯度PCR仪伯乐1861096
PolyJet转染试剂SignaGenSL100688
pEG BacMam载体来自Vollum研究所Gouaux实验室

参考文献

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