离子通道的纯化通常具有挑战性，但一旦成功，就有可能使其得以 体外 对通道功能与结构的研究。在此，我们描述了表达与纯化哺乳动物 bestrophin 蛋白（一类 Ca²⁺ 激活的氯离子通道）的逐步操作步骤。2+-激活的 Cl- 通道
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本文内容
摘要
摘要
人类基因组编码四种立妥宾同源蛋白，即 BEST1、BEST2、BEST3 和 BEST4。BEST1 由 BEST1 基因，是一种钙2+-激活的 Cl- 通道（CaCC），主要在视网膜色素上皮（RPE）中表达。BEST1的生理与病理意义体现在已有超过200种不同的突变被发现于该基因。 BEST1 基因已被遗传学研究证实与至少五种视网膜变性疾病相关，例如Best卵黄样黄斑营养不良（Best病）。因此，在单分子水平上理解bestrophin通道的生物物理特性具有重要意义。然而，获得纯化的哺乳动物离子通道蛋白通常是一项具有挑战性的任务。本文报道了一种利用BacMam杆状病毒基因转导系统表达哺乳动物bestrophin蛋白，并通过亲和层析和尺寸排阻层析进行纯化的方法。所获得的纯化蛋白可用于后续的功能与结构分析，例如脂双层膜中的电生理记录和晶体学研究。重要的是，该技术流程可被推广用于研究其他离子通道的功能与结构。
引言
Bestrophin 是一类在从细菌到人类等多种物种中均保守存在的离子通道1。在人类中，位于染色体 11q12.3 的 BEST1 基因编码一种主要在眼部视网膜色素上皮（RPE）细胞的基底外侧膜上表达的膜蛋白 Bestrophin-1（BEST1）2,3,4。BEST1 由 585 个氨基酸组成，其中前约 350 个氨基酸在不同物种间高度保守，并包含其跨膜区域，该蛋白在人类中作为钙激活氯离子通道（CaCC）发挥作用1,5,6。此外，鸡和Klebsiella pneumoniae中的 BEST1 同源蛋白均以同源五聚体形式发挥功能7,8，提示其在进化过程中具有高度保守性。
在人类中，已有超过200种突变被发现位于 BEST1 基因已临床关联到一组称为bestrophinopathies的视网膜....
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方案
1. 生成BacMam表达型杆状病毒
- 将目标哺乳动物Bestrophin蛋白的编码序列插入pEG BacMam载体18，载体中包含烟草蚀纹病毒（Tobacco Etch Virus, TEV）蛋白酶识别序列，并在蛋白C端连接GFP-10x His标签。
- 将表达质粒瞬时转染至贴壁生长的HEK293细胞中19,20,21,22,23。在荧光显微镜下使用10X或20X物镜、488 nm激发光源和510 nm发射滤光片观察GFP融合蛋白的表达情况（图1A）。
注意：通常采用基于聚合物的转染方法，每35 mm培养皿使用1 μg质粒DNA。 - 按照先前所述方法在Sf9昆虫细胞中制备杆状病毒16,17。
注意：用于感染HEK293-F细胞以进行蛋白表达的第3代（P3）病毒可在4 °C保存1个月。 - 通过....
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结果
在瞬时转染的贴壁HEK293细胞中观察到的荧光强度（图1A）可良好反映悬浮培养的HEK293-F细胞中目标蛋白的表达水平（图1B）。若目标蛋白在瞬时转染后的HEK293细胞中表达不佳或定位异常，建议考虑优化表达载体（例如，调整GFP标签的位置，或对目标蛋白引入突变或截短）。可通过小规模HEK293-F悬浮培养（例如，25 mL培养体系）优化蛋白表达条件，其中感染复数（MOI）和培养温度在以往经验中被证明最为关键。
成功的纯化在尺寸排阻色谱中表现为在预期洗脱体积处出现单一主峰（图2A），并在变性SDS-PAGE凝胶上表现为单一显著条带（图2B）。如果在尺寸排阻色谱中出现多个峰，应分别.......
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讨论
本方案描述了一种用于表达和纯化哺乳动物Bestrophin离子通道的有效流程，可用于后续的in vitro分析。虽然尺寸排阻色谱需要使用FPLC设备，但亲和层析的所有步骤（包括结合、洗涤和洗脱）仅需使用注射泵即可完成。当使用注射泵将溶液（置于注射器中）推过层析柱时，必须在弹簧一侧进行支撑，以避免将气泡压入柱中。如果亲和层析后所得蛋白的纯度已满足后续实验要求，则可省略尺寸排阻色谱步骤，从而可能完全无需使用FPLC设备。
由于从pBacMam质粒构建杆状病毒需要约2周时间，为提高效率，可先通过收获瞬时转染的HEK293细胞，对性质良好的蛋白质同源物进行初步筛选（例如来自一个60 mm培养皿）并检测目的蛋白（GFP标记）在去垢剂中的行为（例如， DDM）结合荧光检测尺寸排阻色谱法（FSEC）18,24最有效的方法是关注在转染的HEK293细胞中表现出强荧光，且在FSEC中具有良好单分散性和稳定性的蛋白构建体。
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本项目由美国国立卫生研究院（NIH）资助，资助编号为 EY025290、GM127652，以及罗切斯特大学启动资金支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| HEPES | 菲舍尔科技 | AC327265000 | |
| NaCl | 菲舍尔科技 | AC446212500 | |
| 甘油 | 菲舍尔科技 | G33-500 | |
| 咪唑 | 菲舍尔科技 | AC301870010 | |
| MgCl2 | 菲舍尔科技 | AC197530010 | |
| TCEP | 菲舍尔科技 | AA4058704 | |
| 抑肽酶 | 菲舍尔科技 | AAJ63039MA | |
| 亮抑蛋白酶肽 | 菲舍尔科技 | AAJ61188MB | |
| 胃蛋白酶抑制剂A | 菲舍尔科技 | AAJ20037MB | |
| 苯甲基磺酰氟 | 菲舍尔科技 | AC215740050 | |
| DDM sol-grade | Anatrace | D310S | |
| DDM anagrade | Anatrace | D310 | |
| Sf-900 II SFM | 赛默飞世尔科技 | 10902179 | |
| FreeStyle培养基 | 赛默飞世尔科技 | 12338018 | |
| NanoDrop分光光度计 | 赛默飞世尔科技 | ND-2000 | |
| 高压均质机 | Avestin | Emulsiflex-C5 | |
| HisTrap柱 | GE | 17-5248-01 | |
| Superdex-200柱 | GE | 28990944 | |
| AKTA Pure | GE | 29018224 | |
| Ultra-15离心过滤装置 | 密理博 | UFC910024 | |
| Ultra-4离心过滤装置 | 密理博 | UFC810024 | |
| Ultra-0.5离心过滤装置 | 密理博 | UFC505024 | |
| Optima XE-90超速离心机 | 贝克曼库尔特 | A94471 | |
| Mini-PROTEAN Tetra电泳槽 | 伯乐 | 1658004 | |
| Mini-PROTEAN预制胶 | 伯乐 | 4561084 | |
| T100梯度PCR仪 | 伯乐 | 1861096 | |
| PolyJet转染试剂 | SignaGen | SL100688 | |
| pEG BacMam载体 | 来自Vollum研究所Gouaux实验室 |
参考文献
- Hartzell, H. C., Qu, Z., Yu, K., Xiao, Q., Chien, L. T. Molecular physiology of bestrophins: multifunctional membrane proteins linked to best disease and other retinopathies. Physiological Review. 88 (2), 639-672 (2008).
- Marmorstein, A. D., et al.
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重印与许可
