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方法文章

用于基于气相色谱-质谱法（GC-MS）代谢组学分析的 Drosophila 幼虫样品制备

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DOI：

10.3791/57847

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2018年6月6日

 , 
1Department of Biology, Indiana University

本文内容

摘要

本方案描述了如何制备用于基于气相色谱-质谱法（GC-MS）进行代谢组学分析的黑腹果蝇（Drosophila）幼虫。

摘要

代谢组学领域的最新进展已确立果蝇 黑腹果蝇 作为研究动物代谢的强有力遗传模型。通过结合海量的 果蝇 能够检测大范围中间代谢的遗传工具，代谢组学方法可以揭示饮食、基因型、生活史事件和环境线索之间的复杂相互作用。此外，代谢组学研究还能发现新的酶促机制，并揭示看似无关的代谢通路之间先前未知的联系。为了促进该技术在更广泛群体中的应用 果蝇 群落，本文提供了一种详细的实验方案，描述了如何制备 果蝇 用于基于气相色谱-质谱法（GC-MS）的代谢组学分析的幼虫样品。本方案包含幼虫样品采集、代谢物提取、化学衍生化及GC-MS分析的详细描述。成功实施本方案可使使用者测定包括氨基酸、糖类以及参与糖酵解和三羧酸（TCA）循环的有机酸在内的小分子极性代谢物的相对丰度。

引言

果蝇 黑腹果蝇 已成为研究调控中间代谢分子机制的理想体系。大多数代谢途径在物种间是保守的。 果蝇 以及人类中具有重要作用，但关键的营养感应器和生长调节因子（如胰岛素、Tor 和 myc）在果蝇中也同样具有活性1,2因此， 黑腹果蝇 可用于研究从糖尿病、肥胖到神经退行性疾病和癌症等人类疾病的代谢基础。在这方面， 果蝇 幼虫发育为研究一种称为有氧糖酵解（即瓦伯格效应）的代谢程序提供了理想框架。正如许多肿瘤利用有氧糖酵解将碳水化合物转化为生物大分子一样，幼虫发育过程中也采用这一代谢途径 果蝇 幼虫激活有氧糖酵解以促进发育生长3,4,5幼虫与肿瘤代谢之间的这些相似性确立了 果蝇 作为研究有氧糖酵解调控机制的关键模型 体内.

尽管果蝇已成为研究代谢的常用模式生物，但大多数 Drosophila 研究依赖于专门用于检测单一代谢物（如海藻糖、甘油三酯或ATP）的方法3。由于每种代谢物的检测都需要特定的实验方案，基于检测方法的研究往往耗时耗力、成本高昂，并且偏向于那些可通过商业试剂盒检测的化合物。代谢组学领域的进展为克服这些局限提供了有效途径，为研究 Drosophila 代谢提供了更高效且无偏倚的方法。与基于检测的方法不同，一次代谢组学分析即可同时测定数百种小分子代谢物，从而全面了解生物体的代谢状态6,7。该技术显著拓展了 Drosophila 代谢研究的范围，代表了这一新兴领域的发展方向8。

代谢组学研究主要采用三种技术：(i) 核磁共振（NMR），(ii) 液相色谱-质谱联用（LC-MS），以及 (iii) 气相色谱-质谱联用（GC-MS）9。每种方法各有优缺点，且这些技术均已成功应用于黑腹果蝇（Drosophila）代谢的研究。由于本实验室的研究重点是小分子极性代谢物，我们主要采用基于GC-MS的方法。GC-MS为使用者提供了多项优势，包括高重复性、良好的峰分辨率、高灵敏度，以及标准电子轰击（EI）质谱数据库的可用性，从而能够快速鉴定所发现的代谢特征10,11。然而，GC-MS样品的制备过程较为复杂，需格外注意操作细节。样品必须以能够迅速终止代谢反应的方式进行收集、洗涤、称重并冷冻保存。此外，果蝇残体对常规的匀浆方法具有抗性，需使用珠磨法以确保代谢物的最佳提取效果。最后，用于GC-MS分析的样品在检测前必须经过化学衍生化处理12。尽管已有文献报道了上述所有步骤3,13,14，但仍缺乏一种可视化操作流程，以便初学者能够可重复地获得高质量数据。本文中，我们展示了如何制备用于基于GC-MS的代谢组学分析的黑腹果蝇（Drosophila）幼虫样品。该实验方案使研究者能够可重复地检测构成中心碳代谢的多种小分子极性代谢物。

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方案

1. 卵的收集

  1. 收集所需基因型的成年雄性和处女雌性个体，分别置于含标准Bloomington培养基的食物管中，单独饲养3–5天。
  2. 将50只 virgin 雌蝇和25只雄蝇转移至新的培养瓶中，设置适当的杂交组合。
    注意：每种基因型应至少设立六次独立交配。每次交配仅收集一个样本（即从六次独立交配中收集六个样本）。
  3. 制备糖蜜产卵帽。
    1. 将115 mL糖蜜与29 g琼脂混合于700 mL H22 L 烧瓶中的 O。
    2. 在电热板上将糖蜜琼脂混合物煮沸。
    3. 冷却至 70 °C。
    4. 加入25 mL酸混合液（将20 mL 85%磷酸和209 mL丙酸溶于1 L H₂O中）2O；储存于棕色瓶中）和10 mL 10%对羟基苯甲酸甲酯的95%乙醇溶液。
    5. 将糖蜜琼脂倒入 35 × 10 mm 培养皿的盖子和底部部分2 组织培养皿
      注意：在倾注糖蜜琼脂平板前，务必确保35 x 10 mm培养皿的皿盖和/或皿底2 平板紧密贴合于瓶口 果蝇 储备瓶（见步骤1.6）。根据所用培养板的品牌不同，底部可能无法使用。
  4. 通过将蒸馏水加入活性干酵母（5 g 酵母/7 mL 水）制备新鲜酵母糊，搅拌至形成均匀糊状物，能够轻松涂布于固体表面即（花生酱的稠度）。
  5. 在糖蜜产卵帽表面涂抹约1.5 g酵母糊。
  6. 在塑料6盎司容器的相对两侧各戳四个通气孔 果蝇 使用22 G针头将储存瓶中的溶液取出。
  7. 将新交配的果蝇从培养瓶转移到培养瓶中。
    注意：可使用 CO₂ 麻醉或人工麻醉（如冰浴）的方法转移果蝇。2 作为临时麻醉剂，或通过将瓶盖顶部置于瓶口，并用力将瓶底敲击实验台面。
  8. 迅速将带有酵母糊的糖蜜产卵帽放在表面，并插入一个管口内 果蝇 储备瓶。使用实验室胶带将产卵帽固定到位。
    注意：若果蝇在转移前已麻醉，应将瓶子水平放置于实验台面上，直至所有果蝇完全恢复活动能力。待果蝇完全能够活动后，将瓶子放入培养箱中，并使糖蜜产卵盖位于培养瓶底部。
  9. 前两天每天至少更换一次糖蜜产卵帽：将原种瓶倒置，轻敲瓶底以松动内容物，将旧的产卵帽取下并丢弃，立即在瓶口换上新的产卵帽。
    注意：此步骤可确保雌性个体未滞留卵子，从而获得同步化的群体样本。
  10. 第3天后，将一个新的产卵帽放入原种瓶中，2小时后更换并丢弃。4小时后移除并更换第二个产卵帽。在该产卵帽底部标记日期、时间和基因型。
    注意：在此4小时窗口期内收集的卵将用于分析。此同步步骤对于分析特定发育阶段至关重要。以此方式收集卵可连续进行数天。
  11. 将产卵帽插入60 × 15 mm培养皿中2 培养皿放入设定好所需温度和湿度的培养箱中。
  12. 每天检查产卵盖，观察是否存在饥饿、种群密度过高或污染问题。
    注意：幼虫必须能够获得充足的食物，以确保持续发育。如有需要，可在表面涂抹新鲜的酵母糊 全部 用于实验的产卵帽。此外，若幼虫种群密度过高，幼虫会开始从培养板中爬出。这些样本不应用于代谢组学分析，因为高密度及爬行过程中经历的间歇性饥饿会导致数据不一致。建议每板使用约80–100只中期二龄幼虫（L2）或40–50只中期三龄幼虫（L3）。若样本明显受到细菌或真菌污染，应予以弃用。

2. 幼虫样本采集

  1. 将幼虫培养至所需发育阶段。若需收集三龄幼虫（L3），应在二龄至三龄蜕皮期（L2–L3 molt）对样本进行再同步化。通常可采用一种已有文献描述的方法，以前气门作为发育标志点来实现再同步化15。或者，也可利用sgs3报告基因对中期三龄幼虫进行同步化16。
    注意：在此方面，我们发现中期二龄幼虫（约在产卵后60小时）最适合大多数分析，因为此阶段幼虫发育仍相对同步，精心收集的样本具有充足食物以发育至此时间点，且每份样本中的个体数量易于管理（见下文）。对于三龄幼虫，额外的同步化步骤是必要的，因为在三龄发育期间发生的多次蜕皮激素脉冲会对代谢产生显著影响，从而在未同步的群体中引入实验假象。
  2. 使用解剖针轻轻将酵母膏从琼脂表面剥离，并将其转移至新的糖蜜琼脂盖上。
    注意：大多数幼虫会在糖蜜琼脂与酵母膏的交界处取食。
  3. 使用小型画笔从新暴露的糖蜜琼脂表面收集幼虫，并将其放入置于冰上的1.5 mL离心管中。
    注意：各发育阶段适宜的样本量如下：50只一龄幼虫（L1）；25只中期二龄幼虫（mid-L2）；20只早期三龄幼虫（early L3）；15只中期或晚期三龄幼虫（mid-L3或late L3）。
  4. 在收集大量样本的过程中，应分小批次（每次四至六个样本）进行洗涤和冷冻（步骤2.3至2.8）。幼虫放入离心管后必须在20分钟内完成冷冻。
    注意：我们推荐使用Eppendorf 1.5 mL Flex管，因为其他类型的管子可能会影响步骤3中的样品转移。样品必须收集在微量离心管中，切勿使用步骤3.1中所述的珠磨管。陶瓷珠会残留NaCl洗涤液，导致质量测量不准确，并将污染物引入样品中。
  5. 向离心管中加入1 mL预冷的0.9% NaCl溶液，盖紧管盖，垂直反复翻转以充分洗涤幼虫。
  6. 将离心管放回冰上静置约30秒。在此期间，幼虫会沉降至管底，而酵母则保持悬浮状态。待所有幼虫形成松散沉淀后，用1 mL移液器吸除NaCl溶液。
  7. 重复步骤2.4和步骤2.5两次，或直至最后一次洗涤液澄清。
    注意：若收集的样本中含有过多酵母，则可能需要增加洗涤步骤。
  8. 在4 °C条件下，以2,000 × g离心1分钟。
  9. 使用200 µL移液器彻底去除所有残留液体。
  10. 立即用液氮速冻样品。
    注意：本实验流程可在该步骤暂停。样品可在-80 °C条件下保存最长3个月。

3. 将样品转移至珠管

  1. 必须将每个幼虫样品从1.5 mL离心管转移至含有1.4 mm陶瓷珠的2 mL螺口管中。在进行此转移步骤前，使用耐乙醇标记笔在2 mL螺口珠管的侧面做好标记（步骤4.4中管盖上的标记会被破坏）。
  2. 使用可精确称量至0.01 mg的分析天平，对已标记的珠管进行去皮称重。
  3. 若幼虫样品储存在-80 °C条件下，在转移前需先将样品管置于液氮中冷冻。
  4. 使用长镊子从液氮杜瓦瓶中取出1.5 mL样品管。
  5. 佩戴腈手套，抓取冷冻的管子，倒置后迅速将管盖用力撞击台面，以使冷冻的样品团脱落。立即将样品团倒入已去皮的2 mL螺口珠管中。若样品团未能脱落，请将管子重新放回液氮中，重复操作。
    注意：并非所有离心管中的幼虫样品团都能顺利脱落。若使用非推荐型号的离心管，应在采集用于分析的样品前，预先确认样品团是否可被有效脱落。
  6. 迅速称量幼虫样品团与珠管的总质量，并立即将样品管放回液氮中。幼虫样品团的质量将用于标准化代谢组学数据。
    注意：本方案可在该步骤暂停。样品可在-80 °C条件下保存最多3个月。

4. 样品提取

  1. 将样品管置于 -20 °C 的台式冷却器中。
  2. 向每根管中加入 0.8 mL 预冷（-20 °C）的含 2 µg/mL 丁二酸-d4 的 90% 甲醇。将样品放回 -20 °C 台式冷却器中。
    注意：丁二酸-d4 作为内标物。仅使用 HPLC 级 H2O 和甲醇。由于甲醇及其他有机溶剂具有挥发性，使用空气置换移液器难以准确量取，因此建议在本步骤及后续所有步骤中使用正置换移液器。
  3. 通过向一个空珠管中加入 0.8 mL 预冷（-20 °C）的含 2 µg/mL 丁二酸-d4 的 90% 甲醇，设置一个阴性对照。
  4. 在 4 °C 温控室内，使用珠磨均质器以 6.45 m/s 的速度均质样品 30 秒。
    注意：未能快速且完全地均质幼虫沉淀是代谢组学分析中常见的变异来源。仅使用能够在 30 秒内彻底破坏冷冻幼虫组织的均质器。
  5. 将均质后的样品管放回 -20 °C 台式冷却器，并在 -20 °C 冰箱中孵育至少 1 小时。
  6. 在 4 °C 条件下，以 20,000 × g 或最大转速离心 5 分钟，以去除产生的沉淀物。
  7. 将 600 µL 上清液转移至新的 1.5 mL 微量离心管中。操作时勿扰动沉淀物。若在吸取上清液过程中沉淀物松动，请将所有上清液重新返回原管，并重复步骤 4.6。
  8. 将样品管放入真空离心浓缩仪中。密封离心机前，确保所有管盖均已打开。在室温下干燥样品，直至完全去除溶剂（此步骤通常需要约 16 小时）。
    注意：如有需要，可在本步骤暂停实验流程。干燥后的样品可保存于 -80 °C。

5. 化学衍生化

  1. 如果干燥样品储存在 -80 °C，请将未打开的样品管放入真空离心机中干燥 30 分钟。此步骤必须在打开样品管之前进行。
    注意：此步骤可去除从冰箱中取出后在微量离心管外壁上凝结的水分。本实验步骤对 H2O 极其敏感，必须采取额外预防措施，确保所有试剂尽可能干燥。
  2. 配制 40 mg/mL 甲氧胺盐酸盐（MOX）的无水吡啶溶液。仅使用无水吡啶。将 MOX 和吡啶存放于干燥器中，并每日新鲜配制 MOX 溶液。
    警告：MOX 和吡啶具有毒性。请在通风橱内配制该溶液。
    1. 使用热风枪干燥一支 1 mL 玻璃注射器。
    2. 将注射器针头插入无水吡啶瓶中，吸取 1 mL 吡啶，并加入含有 40 mg MOX 的微量离心管中。
    3. 用氩气冲洗无水吡啶瓶。密封后放回干燥器中保存。
    4. 将微量离心管置于 35 °C、600 rpm 条件下的温控混匀仪中孵育 10 分钟，使 MOX 完全溶解于吡啶中。
  3. 向干燥样品中加入 40 µL 的 40 mg/mL MOX 无水吡啶溶液。
  4. 涡旋振荡 10 秒，短暂离心（10,000 ×g，20 秒）。
  5. 在温控混匀仪中，30 °C、600 rpm 条件下孵育 1 小时。
  6. 以 20,000 × g 或最大转速离心 5 分钟，去除颗粒物质。
  7. 将 25 µL 上清液转移至含有 250 µL 去活化玻璃微量插入件的自动进样小瓶中。
  8. 加入 40 µL 含 1% TMCS 的 N-甲基-N-三甲基硅基三氟乙酰胺（MSTFA）。
    警告：MSTFA 具有毒性。请在通风橱内操作。
    注意：如有条件，可使用 Gerstel 自动进样器完成此步骤。
  9. 为自动进样小瓶加盖，并使用压盖工具密封。
  10. 将样品在 37 °C 下振荡孵育 1 小时（250 rpm）。
  11. 按先前所述方法3配制脂肪酸甲酯标准品（FAMES）溶液。在进样前立即使用机器人自动进样器向自动进样小瓶中加入 3 µL FAMES。
    注意：FAMEs 用于校正保留时间漂移并检测仪器性能。若无机器人自动进样器，可在步骤 5.8 中加入 FAMEs。

6. 气相色谱-质谱检测

注意：在大多数情况下，用户需在质谱分析核心实验室的协助下完成此步骤。本方案设计用于配备5 m保护柱的30 m气相色谱柱。

  1. 随机化样品顺序。
  2. 准备气相色谱-质谱联用仪（GC-MS）。
    1. 将氦气载气流速设置为 1 mL/min。
    2. 将进样口温度设置为 250 °C。
    3. 编程气相色谱仪执行以下温度梯度：
      1. 初始温度为 95 °C，保持 1 分钟。
      2. 以 40 °C/min 的速率升温至 110 °C，保持 2 分钟。
      3. 以 5 °C/min 的升温速率升至 250 °C。
      4. 以 25 °C/min 的速率升温至 330 °C，最终保持 4 分钟。
    4. 设置溶剂延迟时间为 3.5 分钟。
      注意：可根据具体的 GC-MS 系统调整该时间。此步骤的目的是防止 MSTFA 和 MOX 损害检测器。
  3. 将 1 µL 衍生化后的样品注入 GC-MS（分流比为 10:1）。
    注意：如果峰强度过低，可注入 2 µL 样品。样品的进样顺序应随机化。
  4. 在全扫描模式下运行质谱仪，质量扫描范围为 50–500 m/z。

7. 数据分析

  1. 采用靶向或非靶向方法分析代谢组学数据。靶向分析专注于测量一组特定代谢物的丰度，例如下文所述的乳酸测定。相比之下，非靶向分析则采用无偏方法，识别在两组样本之间发生显著变化的任何代谢特征。
    注意：本实验室主要使用免费程序 MetAlign17 和 MetaboAnalyst18,19 进行数据分析。由于对质量控制、归一化和数据处理步骤进行充分描述已超出本文范围，建议读者参考更详细的数据处理方案20,21,22。此外，有关该分析所需步骤的流程图可参见其他文献8。

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结果

缺乏乳酸脱氢酶（dLDH）活性的 dLDH突变体4及其基因型匹配的对照组在中期L2幼虫阶段被收集，并按照上述方案进行处理。与对照组相比，突变体幼虫在乳酸、丙酮酸和L-2-羟基戊二酸水平上表现出显著变化4。采用安捷伦GC6890-5973i质谱系统获取谱图。本方案生成的GC-MS谱图示例如图1所示。谱图中存在多个明显特征峰，以及一个显著的海藻糖峰，该峰通常在幼虫样品中为最大峰，且通常处于过饱和状态（图1A、B）。阴性对照样品的单个谱图如图1C所示。尽管阴性对照样品中仍存在多个可见峰，但与 图1A、B所示的实验样品相比，其峰强度和峰数量均明显减少。这些峰主要来源...

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讨论

代谢组学为全面分析构成中间代谢的代谢反应提供了无与伦比的机会。然而，该技术具有高度敏感性，其数据易受遗传背景、发育信号以及多种环境胁迫的影响，包括温度、湿度、种群密度和营养可利用性等。因此，高质量且可重复的代谢组学分析要求在高度受控的条件下采集样本。尽管已有若干综述强调了这一点3,8,23，本文则提供了一种用于采集幼虫的逐步操作方法，旨在确保实验的可重复性。

代谢组学分析中最常见的变异来源是样本采集后未能有效淬灭或终止代谢反应。在此方面，样本在液氮中冷冻后代谢将停止，而当样本在-20 °C的甲醇中均质化时，代谢酶会被破坏。假设操作者在甲醇提取前特别注意保持样本处于冷冻状态，则本方案的设计可确保由此过程生成的代谢组学数据能够准确反映幼虫代谢的真实情况。如果操作者发现数据变异程度不可接受，应重新审视样本采集和代谢物提取方案，并特别注意确保：（1）代谢反应被迅速淬灭（步骤2.9–4.2）；（2）样本在9...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

感谢印第安纳大学质谱中心和犹他大学代谢组学核心设施的成员在优化本方案过程中提供的帮助。J.M.T. 的研究由美国国立卫生研究院下属国家普通医学科学研究所资助，资助编号为 R35GM119557。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
未加硫黑糖糖蜜Good Food, INC
果蝇培养基琼脂 II 型Genesee Scientific66-103
吡啶EMD MilliporePX2012-7
甲氧胺盐酸盐（MOX）MP Biomedicals, LLC155405
含 1% 三甲基氯硅烷的 MSTFASigma69478
Fleischmann’s 活性干酵母AB Mauri Food Inc2192
6 oz 果蝇培养瓶Genesee Scientific32-130
软组织匀浆混合管（2 mL 管） Omni InternationalSKU:19-627
小瓶插件，250 µL 去活化玻璃，带聚合物底脚Agilent5181-8872
琥珀酸-2,2,3,3-d4Sigma293075
真空离心浓缩仪（SpeedVac）Thermo SC210A
正磷酸Fisher ScientificA242-1
丙酸SigmaP5561
对羟基苯甲酸甲酯Genesee Scientific20-258
珠式破碎仪（Bead Ruptor）Omni InternationalSKU:19-040E
ThermoMixer F1.5 恒温混匀仪Eppendorf5384000012
MultiTherm 摇床，配备 24 × 12 mm 模块Benchmark ScientificH5000
甲醇Sigma34860
1.5 mL 离心管Eppendorf22364111
Falcon 35 × 10 mm 组织培养皿Corning Incorporated353001
气相色谱柱（GC column）PhenomexZB-5MSi

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