用于基于气相色谱-质谱法（GC-MS）代谢组学分析的 Drosophila 幼虫样品制备

摘要

本方案描述了如何制备用于基于气相色谱-质谱法（GC-MS）进行代谢组学分析的黑腹果蝇（Drosophila）幼虫。

摘要

代谢组学领域的最新进展已确立果蝇 黑腹果蝇 作为研究动物代谢的强有力遗传模型。通过结合海量的 果蝇 能够检测大范围中间代谢的遗传工具，代谢组学方法可以揭示饮食、基因型、生活史事件和环境线索之间的复杂相互作用。此外，代谢组学研究还能发现新的酶促机制，并揭示看似无关的代谢通路之间先前未知的联系。为了促进该技术在更广泛群体中的应用 果蝇 群落，本文提供了一种详细的实验方案，描述了如何制备 果蝇 用于基于气相色谱-质谱法（GC-MS）的代谢组学分析的幼虫样品。本方案包含幼虫样品采集、代谢物提取、化学衍生化及GC-MS分析的详细描述。成功实施本方案可使使用者测定包括氨基酸、糖类以及参与糖酵解和三羧酸（TCA）循环的有机酸在内的小分子极性代谢物的相对丰度。

引言

果蝇 黑腹果蝇 已成为研究调控中间代谢分子机制的理想体系。大多数代谢途径在物种间是保守的。 果蝇 以及人类中具有重要作用，但关键的营养感应器和生长调节因子（如胰岛素、Tor 和 myc）在果蝇中也同样具有活性^1,2因此， 黑腹果蝇 可用于研究从糖尿病、肥胖到神经退行性疾病和癌症等人类疾病的代谢基础。在这方面， 果蝇 幼虫发育为研究一种称为有氧糖酵解（即瓦伯格效应）的代谢程序提供了理想框架。正如许多肿瘤利用有氧糖酵解将碳水化合物转化为生物大分子一样，幼虫发育过程中也采用这一代谢途径 果蝇 幼虫激活有氧糖酵解以促进发育生长^3,4,5幼虫与肿瘤代谢之间的这些相似性确立了 果蝇 作为研究有氧糖酵解调控机制的关键模型 体内.

尽管果蝇已成为研究代谢的常用模式生物，但大多数 Drosophila 研究依赖于专门用于检测单一代谢物（如海藻糖、甘油三酯或ATP）的方法³。由于每种代谢物的检测都需要特定的....

方案

1. 卵的收集

1. 收集所需基因型的成年雄性和处女雌性个体，分别置于含标准Bloomington培养基的食物管中，单独饲养3–5天。
2. 将50只 virgin 雌蝇和25只雄蝇转移至新的培养瓶中，设置适当的杂交组合。
   注意：每种基因型应至少设立六次独立交配。每次交配仅收集一个样本（即从六次独立交配中收集六个样本）。
3. 制备糖蜜产卵帽。
   1. 将115 mL糖蜜与29 g琼脂混合于700 mL H₂2 L 烧瓶中的 O。
   2. 在电热板上将糖蜜琼脂混合物煮沸。
   3. 冷却至 70 °C。
   4. 加入25 mL酸混合液（将20 mL 85%磷酸和209 mL丙酸溶于1 L H₂O中）₂O；储存于棕色瓶中）和10 mL 10%对羟基苯甲酸甲酯的95%乙醇溶液。
   5. 将糖蜜琼脂倒入 35 × 10 mm 培养皿的盖子和底部部分² 组织培养皿
      注意：在倾注糖蜜琼脂平板前，务必确保35 x 10 mm培养皿的皿盖和/或皿底² 平板紧密贴合于瓶口 果蝇 储备瓶（见步骤1.6）。根据所用培养板的品牌不同，底部可能无法使用。
4. 通过将蒸馏水加入活性干酵母（5 g 酵母/7 mL 水）制备新鲜酵母糊，....

结果

缺乏乳酸脱氢酶（dLDH）活性的 dLDH突变体⁴及其基因型匹配的对照组在中期L2幼虫阶段被收集，并按照上述方案进行处理。与对照组相比，突变体幼虫在乳酸、丙酮酸和L-2-羟基戊二酸水平上表现出显著变化⁴。采用安捷伦GC6890-5973i质谱系统获取谱图。本方案生成的GC-MS谱图示例如图1所示。谱图中存在多个明显特征峰，以及一个显著的海藻糖峰，该峰通常在幼虫样品中为最大峰，且通常处于过饱和状态（图1A、B）。阴性对照样品的单个谱图如图1C所示。尽管阴性对照样品中仍存在多个可见峰，但与 图1A、B所示的实验样品相比，其峰强度和峰数量均明显减少。这些峰主要来源.......

讨论

代谢组学为全面分析构成中间代谢的代谢反应提供了无与伦比的机会。然而，该技术具有高度敏感性，其数据易受遗传背景、发育信号以及多种环境胁迫的影响，包括温度、湿度、种群密度和营养可利用性等。因此，高质量且可重复的代谢组学分析要求在高度受控的条件下采集样本。尽管已有若干综述强调了这一点^3,8,23，本文则提供了一种用于采集幼虫的逐步操作方法，旨在确保实验的可重复性。

代谢组学分析中最常见的变异来源是样本采集后未能有效淬灭或终止代谢反应。在此方面，样本在液氮中冷冻后代谢将停止，而当样本在-20 °C的甲醇中均质化时，代谢酶会被破坏。假设操作者在甲醇提取前特别注意保持样本处于冷冻状态，则本方案的设计可确保由此过程生成的代谢组学数据能够准确反映幼虫代谢的真实情况。如果操作者发现数据变异程度不可接受，应重新审视样本采集和代谢物提取方案，并特别注意确保：（1）代谢反应被迅速淬灭（步骤2.9–4.2）；（2）样本在9.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
未加硫黑糖糖蜜	Good Food, INC
果蝇培养基琼脂 II 型	Genesee Scientific	66-103
吡啶	EMD Millipore	PX2012-7
甲氧胺盐酸盐（MOX）	MP Biomedicals, LLC	155405
含 1% 三甲基氯硅烷的 MSTFA	Sigma	69478
Fleischmann’s 活性干酵母	AB Mauri Food Inc	2192
6 oz 果蝇培养瓶	Genesee Scientific	32-130
软组织匀浆混合管（2 mL 管）	Omni International	SKU:19-627
小瓶插件，250 µL 去活化玻璃，带聚合物底脚	Agilent	5181-8872
琥珀酸-2,2,3,3-d4	Sigma	293075
真空离心浓缩仪（SpeedVac）	Thermo	SC210A
正磷酸	Fisher Scientific	A242-1
丙酸	Sigma	P5561
对羟基苯甲酸甲酯	Genesee Scientific	20-258
珠式破碎仪（Bead Ruptor）	Omni International	SKU:19-040E
ThermoMixer F1.5 恒温混匀仪	Eppendorf	5384000012
MultiTherm 摇床，配备 24 × 12 mm 模块	Benchmark Scientific	H5000
甲醇	Sigma	34860
1.5 mL 离心管	Eppendorf	22364111
Falcon 35 × 10 mm 组织培养皿	Corning Incorporated	353001
气相色谱柱（GC column）	Phenomex	ZB-5MSi