原位杂交技术用于石蜡包埋的成年珊瑚样品

摘要

本实验方案的目的是对已包埋于石蜡中并切片至载玻片上的成年珊瑚样品进行原位杂交。这是一种定性方法，用于在石蜡包埋的组织中可视化RNA反义探针的空间表达情况。

摘要

珊瑚是重要的海洋无脊椎动物，对整体海洋健康以及人类健康具有关键作用。然而，由于人类活动导致的海洋温度上升和海洋酸化等影响，珊瑚正面临日益严重的威胁。为应对这些挑战，细胞与分子生物学的进展已被证明在诊断珊瑚健康状况方面至关重要。改良一些常用于人类医学的技术，可显著提升研究人员治疗和拯救珊瑚的能力。为此，本文提出了一项方案 原位 杂交技术主要用于人类医学和进化发育生物学，现已针对处于胁迫状态的成年珊瑚进行了适应性改良以供应用。

该方法旨在对包埋于石蜡中并切片至载玻片上的成年珊瑚组织进行RNA探针的空间表达可视化。本方法重点包括石蜡去除与样本复水、样本预处理以确保其通透性、杂交前孵育、RNA探针杂交以及RNA探针的信号检测。当研究非模式生物中特定基因的表达定位时，该方法具有强大优势，且本实验方案可轻松适用于其他非模式生物。然而，该方法存在一定局限性：主要为定性分析，因为信号强度可能因显色步骤所用时间及探针浓度的不同而变化。此外，实验需要极大的耐心，因整个流程可能耗时长达5天（在许多情况下甚至更长），具体时长取决于所用探针。最后，非特异性背景染色较为常见，但这一局限可通过优化条件予以克服。

引言

珊瑚是关键的生态系统构建者，对海洋生物多样性以及人类健康具有重要意义^1,2,3。由于气候变化和其他人为压力因素的影响，珊瑚正面临威胁，许多珊瑚物种已被列为极危物种。因此，迫切需要细胞和分子工具来诊断处于胁迫状态下的珊瑚。此外，目前对基因在成体珊瑚组织中的表达位置了解甚少，因而也难以明确这些基因的功能。为解决这一问题，我们改进了原位杂交（in situ hybridization, ISH）技术——该技术常用于人类医学和进化发育生物学——使其适用于成体珊瑚的石蜡包埋组织样本。当该技术应用于经历过热胁迫等应激事件的成体珊瑚时，效果尤为显著。然而，该技术也可广泛应用于珊瑚的不同组织类型和生活阶段，并不仅限于遭受热胁迫的珊瑚^4,6,7。此外，只要具备cDNA序列信息，该技术也可用于任何后生动物的组织或细胞。

该方法旨在对已保存并包埋于石蜡中、切片至载玻片上的成年珊瑚组织内的RNA探针进行可视化观察。此方法是一种强大的诊断工具，可用于在成年珊瑚组织中显示核酸的存在。该技术最初为医学诊断而开发，现已成....

方案

1. 脱蜡

注意：以下步骤需在通风橱内进行。

1. 在通风橱中，使用玻璃 Coplin 染色缸，以 100% 二甲苯对石蜡包埋的切片进行脱蜡，持续 10 分钟。请勿使用塑料 Coplin 染色缸，因为二甲苯会溶解塑料。使用前需将 Coplin 染色缸在高压灭菌器中灭菌。
2. 准备四个无菌玻璃 Coplin 染色缸，分别装入以下溶液：100% 乙醇、80% 乙醇、70% 乙醇和 60% 乙醇。使用无 RNase 水稀释乙醇。
   1. 将切片转移至装有 100% 乙醇的无菌玻璃 Coplin 染色缸中，浸泡 10 分钟。10 分钟后，倒掉染色缸中的乙醇，更换为新的 100% 乙醇，再次浸泡切片 10 分钟。
   2. 将切片转移至装有 80% 乙醇的无菌玻璃 Coplin 染色缸中，浸泡 1 分钟。
   3. 将切片转移至装有 70% 乙醇的无菌玻璃 Coplin 染色缸中，浸泡 1 分钟。
   4. 将切片转移至装有 60% 乙醇的无菌玻璃 Coplin 染色缸中，浸泡 1 分钟。

2. RNA探针杂交用切片的预处理

1. 除非另有说明，以下所有洗涤步骤均在室温下进行。室温洗涤时，将样本置于轨道摇床上以低速振荡。使用可容纳最多五张载玻片的无菌载玻片邮寄盒（slide mailer....

结果

完成本实验方案后，即可鉴定出表达目标RNA探针的细胞和组织。本方案的代表性结果针对AP-1、FosB和TNFR41。这些结果此前由Traylor-Knowles et al.¹¹发表，展示了成年珊瑚在热应激暴露后RNA探针的空间表达情况。图1中呈现了两种不同类型的染色示例。图1A为组织弥散性染色的实例，染色信号遍布整个组织，而不仅局限于特定细胞。在此例中，反义AP-1的表达可见于外皮层和口部胃皮层¹¹（图1A），染色呈弥散分布，未局限于某一特定细胞类型。对于此类染色，同时进行正义链对照实验尤为关键，因为部分结果可能源于非特异性染色。

第二类染色为细胞特异性染色，即.......

讨论

本方案所述方法已根据既往在医学及进化发育研究中的工作进行了修改^8,9,10,12,17本方案重点阐述了一种方法的细微之处 原位 使用地高辛标记的RNA反义探针对已保存并包埋于石蜡中的成年珊瑚进行杂交。该方法可轻松转移应用于其他同样经石蜡包埋的生物样本。此外，该方法还可用于珊瑚不同生活阶段的样本例如，幼虫）或细胞培养物中，但具体方案可能有所不同，因为这些类型的样本并非总是石蜡包埋的^5,6.

本实验方案中有多个关键步骤，包括蛋白酶K处理、探针杂交以及探针的显色反应。在蛋白酶K处理过程中，处理时间至关重要。若处理时.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Denhardt溶液	Affymetrix	70468 50 ML
Bioworld碱性磷酸酶缓冲液	Fisher	50-198-724
载玻片邮寄盒	Fisher	12-587-17B
Bioworld碱性磷酸酶缓冲液	Fisher	50-198-724
50 mL Falcon离心管	Fisher	14-959-49A
UltraPure鲑鱼精子DNA溶液	Invitrogen	15632-011
PBS - 磷酸盐缓冲盐水（10X），pH 7.4	Invitrogen	AM9625
UltraPure无DNase/RNase蒸馏水，10 × 500 mL	Invitrogen	10977-023
UltraPure无DNase/RNase蒸馏水，10 × 500 mL	Invitrogen	10977-023
UltraPure鲑鱼精子DNA溶液	Invitrogen	15632-011
Leica Biosystems白色尖端上部粘合载玻片	Leica Biosystems	3800080
PBS溶液，pH 7.4	Life Technologies	10010072
蛋白酶K，分子生物学级，2 mL	New England Biolabs	P8107S
Super Pap Pen液体阻断剂	Promega	22309
DIG抗地高辛-AP Fab片段	Roche	11093274910
BM Purple，100 mL	Roche	11442074001
DIG洗涤与封闭缓冲液套装	Roche	11585762001
NBT/BCIP	Roche	11681451001
甲醛溶液，500 mL规格	Sigma-Aldrich	252549-500ML
SSC缓冲液，20X浓度	Sigma-Aldrich	S6639-1L
乙酸酐	Sigma-Aldrich	320102-100ML
甲酰胺	Sigma-Aldrich	47670-250ML-F
三乙醇胺	Sigma-Aldrich	90279-100ML
来源于猪肠黏膜的肝素钠盐	Sigma-Aldrich	H3149-10KU
二甲苯，分析纯（ACS），用于组织学	VWR	MK866806
乙醇	VWR	EM-EX0276-4S
TE缓冲液	VWR	PAV6232
杂交炉	VWR	97005-252, 97005-254
旋转摇床	VWR	89032-088