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方法文章

原位杂交技术用于石蜡包埋的成年珊瑚样品

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DOI：

10.3791/57853

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2018年8月31日

1Department of Marine Biology and Ecology, University of Miami, Rosenstiel School of Marine and Atmospheric Sciences

本文内容

摘要

本实验方案的目的是对已包埋于石蜡中并切片至载玻片上的成年珊瑚样品进行原位杂交。这是一种定性方法，用于在石蜡包埋的组织中可视化RNA反义探针的空间表达情况。

摘要

珊瑚是重要的海洋无脊椎动物，对整体海洋健康以及人类健康具有关键作用。然而，由于人类活动导致的海洋温度上升和海洋酸化等影响，珊瑚正面临日益严重的威胁。为应对这些挑战，细胞与分子生物学的进展已被证明在诊断珊瑚健康状况方面至关重要。改良一些常用于人类医学的技术，可显著提升研究人员治疗和拯救珊瑚的能力。为此，本文提出了一项方案 原位 杂交技术主要用于人类医学和进化发育生物学，现已针对处于胁迫状态的成年珊瑚进行了适应性改良以供应用。

该方法旨在对包埋于石蜡中并切片至载玻片上的成年珊瑚组织进行RNA探针的空间表达可视化。本方法重点包括石蜡去除与样本复水、样本预处理以确保其通透性、杂交前孵育、RNA探针杂交以及RNA探针的信号检测。当研究非模式生物中特定基因的表达定位时，该方法具有强大优势，且本实验方案可轻松适用于其他非模式生物。然而，该方法存在一定局限性：主要为定性分析，因为信号强度可能因显色步骤所用时间及探针浓度的不同而变化。此外，实验需要极大的耐心，因整个流程可能耗时长达5天（在许多情况下甚至更长），具体时长取决于所用探针。最后，非特异性背景染色较为常见，但这一局限可通过优化条件予以克服。

引言

珊瑚是关键的生态系统构建者，对海洋生物多样性以及人类健康具有重要意义1,2,3。由于气候变化和其他人为压力因素的影响，珊瑚正面临威胁，许多珊瑚物种已被列为极危物种。因此，迫切需要细胞和分子工具来诊断处于胁迫状态下的珊瑚。此外，目前对基因在成体珊瑚组织中的表达位置了解甚少，因而也难以明确这些基因的功能。为解决这一问题，我们改进了原位杂交（in situ hybridization, ISH）技术——该技术常用于人类医学和进化发育生物学——使其适用于成体珊瑚的石蜡包埋组织样本。当该技术应用于经历过热胁迫等应激事件的成体珊瑚时，效果尤为显著。然而，该技术也可广泛应用于珊瑚的不同组织类型和生活阶段，并不仅限于遭受热胁迫的珊瑚4,6,7。此外，只要具备cDNA序列信息，该技术也可用于任何后生动物的组织或细胞。

该方法旨在对已保存并包埋于石蜡中、切片至载玻片上的成年珊瑚组织内的RNA探针进行可视化观察。此方法是一种强大的诊断工具，可用于在成年珊瑚组织中显示核酸的存在。该技术最初为医学诊断而开发，现已成为发育生物学和进化发育生物学等领域中广泛使用的技术8,9,10。当基因组和转录组序列数据可用但基因的空间表达模式尚不明确时，原位杂交（ISH）尤其成为非模式系统中的关键方法。在非模式系统的诊断研究中，该技术具有重要意义，因为它能够指示出哪些细胞和组织表达特定目的基因，从而有助于实现更精准的治疗策略8,9,10,11,12。最后，该技术为定性方法，若与定量基因表达数据结合使用，其分析能力将更为强大11。

本文所述方法适用于已设计好地高辛（DIG）标记的RNA探针（正义与反义探针）并准备对样本进行原位杂交的研究人员。实施本方法时，每种待测探针需准备两片连续的石蜡包埋珊瑚组织切片，一片用于正义探针，另一片用于反义探针。正义探针作为对照，用于指示非特异性结合。若在正义探针中观察到染色信号，则表明反义探针对目标RNA不具特异性。探针可针对任何表达的基因进行设计。在本方案中，所用示例基因此前已被发现可在珊瑚受热胁迫期间表达：FBJ小鼠骨肉瘤病毒癌基因同源物B（Fos-B）、激活蛋白（AP1）以及肿瘤坏死因子受体41（TNFR 41）11。相较于放射性探针，使用DIG标记的RNA探针进行原位杂交更具安全性10，因此更受青睐。此外，该技术灵敏度高，适用范围广泛，不仅可用于受热胁迫的成体珊瑚，还可应用于多种组织和胚胎样本13,14,15,16。

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方案

1. 脱蜡

注意：以下步骤需在通风橱内进行。

  1. 在通风橱中，使用玻璃 Coplin 染色缸，以 100% 二甲苯对石蜡包埋的切片进行脱蜡，持续 10 分钟。请勿使用塑料 Coplin 染色缸，因为二甲苯会溶解塑料。使用前需将 Coplin 染色缸在高压灭菌器中灭菌。
  2. 准备四个无菌玻璃 Coplin 染色缸，分别装入以下溶液：100% 乙醇、80% 乙醇、70% 乙醇和 60% 乙醇。使用无 RNase 水稀释乙醇。
    1. 将切片转移至装有 100% 乙醇的无菌玻璃 Coplin 染色缸中，浸泡 10 分钟。10 分钟后，倒掉染色缸中的乙醇，更换为新的 100% 乙醇，再次浸泡切片 10 分钟。
    2. 将切片转移至装有 80% 乙醇的无菌玻璃 Coplin 染色缸中，浸泡 1 分钟。
    3. 将切片转移至装有 70% 乙醇的无菌玻璃 Coplin 染色缸中，浸泡 1 分钟。
    4. 将切片转移至装有 60% 乙醇的无菌玻璃 Coplin 染色缸中，浸泡 1 分钟。

2. RNA探针杂交用切片的预处理

  1. 除非另有说明，以下所有洗涤步骤均在室温下进行。室温洗涤时，将样本置于轨道摇床上以低速振荡。使用可容纳最多五张载玻片的无菌载玻片邮寄盒（slide mailer）进行载玻片的洗涤。
  2. 将载玻片转移至含有18 mL 1×磷酸盐缓冲液（PBS）的无菌载玻片邮寄盒中，在室温下洗涤5分钟。
  3. 倒掉1× PBS溶液，并立即用蛋白酶K处理载玻片上的组织，以促进探针渗透。向载玻片邮寄盒中加入约18 mL蛋白酶K溶液（工作液浓度见表1），在37 °C孵育15分钟。此步骤中不可振荡。
    1. 在载玻片孵育期间，配制预杂交缓冲液（Prehybe Buffer）。将Prehybe Buffer置于沸水浴中加热10分钟，随后在冰浴中冷却5分钟。Prehybe Buffer的配方见表1。
    2. 通过倾倒去除蛋白酶K溶液，立即向载玻片邮寄盒中加入18 mL 0.2%甘氨酸-PBS溶液，以终止蛋白酶K的消化反应。室温静置5分钟。
    3. 倒掉0.2%甘氨酸-PBS溶液，向每个载玻片邮寄盒中加入18 mL 2×柠檬酸钠-氯化钠（SSC）溶液。在室温下以100–150 rpm振荡洗涤10分钟。

3. RNA探针杂交前的玻片预杂交

  1. 当载玻片用 2x SSC 洗涤时，取一个新的无菌载玻片邮寄盒，向其中加入约 18 mL 预杂交缓冲液（Prehybe Buffer），并将载玻片邮寄盒放入杂交炉中，在杂交温度下孵育。
    注意：杂交温度取决于所使用的探针，通常在 50–60 °C 之间。
  2. 2x SSC 洗涤完成后，倒出 2x SSC，将载玻片转移至杂交炉中的载玻片邮寄盒内的预杂交缓冲液（Prehybe Buffer）中，孵育 1 小时。

4. RNA探针的杂交

  1. 当载玻片在杂交炉中用预杂交缓冲液孵育时，准备杂交探针溶液。
    1. 用杂交缓冲液稀释每种探针（0.5 µL 探针加入 24.5 µL 杂交缓冲液）。
      注意：杂交缓冲液的配方见表1。探针制备及浓度示例可参见 Traylor-Knowles 等11。
    2. 将稀释后的探针置于 86–90 °C 的加热块上 12 分钟，然后在冰上冷却 1 分钟。
  2. 从杂交炉中取出载玻片盒，使用无菌镊子逐个取出载玻片。将载玻片平放在纸巾上，小心擦去组织样本周围的过量预杂交缓冲液。注意不要触碰样本，并迅速操作以防止组织样本干燥。
  3. 用PAP笔在组织周围画圈。用移液器加入 25 µL 稀释后的探针溶液，并用塑料盖玻片覆盖样本。
    1. 将样本放入湿盒中，湿盒底部加入 4x SSC + 50% 甲酰胺溶液。
    2. 待所有载玻片均加完探针后，将湿盒放入杂交炉中，在 50–60 °C 杂交温度下孵育至少 24 小时。孵育时间可根据探针浓度调整，但最少应为 24 小时。
  4. 与稀释探针过夜孵育后，从杂交炉中取出湿盒。
    1. 小心取下每张载玻片上的盖玻片，注意不要移位组织。用 1000 µL 移液器吸取 1000 µL 2x SSC 溶液，轻轻冲洗载玻片。
    2. 将载玻片放入含 18 mL 2x SSC 溶液的无菌载玻片盒中，在室温下孵育 5 分钟。倒出溶液，更换为 18 mL 新鲜 2x SSC 溶液。再次在室温下轻轻振荡孵育 5 分钟。
    3. 倒出 2x SSC 溶液，加入 18 mL 1x SSC 溶液，在室温下洗涤 5 分钟。倒出 1x SSC 溶液，更换为 18 mL 新鲜 1x SSC 溶液。再次在室温下轻轻振荡孵育 5 分钟。
    4. 倒出 1x SSC 溶液，加入 18 mL 0.5x SSC 溶液，在 42 °C 下静置洗涤 10 分钟（不振荡）。倒出 0.5x SSC 溶液，更换为 18 mL 新鲜 0.5x SSC 溶液。再次在 42 °C 下静置洗涤 10 分钟（不振荡）。

5. RNA 探针的可视化

注意：在显色过程中，将使用 BM 紫色试剂对探针进行可视化。但在该步骤之前，需要进行多次洗涤，以使样品准备好染色。

  1. 用不含 MgCl2 的碱性磷酸酶缓冲液（AP 缓冲液）18 mL 洗涤载玻片 1 分钟。倒出不含 MgCl2 的 AP 缓冲液，加入 18 mL 用马来酸缓冲液稀释的 1× Boehringer-Mannheim 封闭缓冲液。在室温下，于载玻片染色盒中轻轻振荡孵育至少 1 小时。
    注意：所用的 Boehringer-Mannheim 封闭缓冲液和马来酸缓冲液为预先配制并购买的 DIG 洗涤与封闭缓冲液套装（可商业获得）。
    1. 也可选择在 4 °C 下孵育过夜。更长的封闭时间可减少非特异性结合的出现。
  2. 配制 20 mL 稀释的 DIG 抗地高辛-AP Fab 片段（抗 DIG 抗体 = 2 µL 抗 DIG 抗体 + 20 mL 1× Boehringer-Mannheim 封闭缓冲液）。该体积足够用于一个塑料载玻片染色盒。若使用多个染色盒，则需配制更多此溶液。
  3. 将抗 DIG 抗体加入新的无菌载玻片染色盒中，然后将载玻片转移至含有抗 DIG 抗体溶液的染色盒内。在室温下轻轻振荡孵育 3 小时。
  4. 孵育后，倒出抗 DIG 抗体溶液，并在载玻片染色盒中用 18 mL 不含 MgCl2 的 AP 缓冲液轻轻振荡洗涤 5 分钟。
  5. 倒出不含 MgCl2 的 AP 缓冲液，加入 18 mL AP 缓冲液，轻轻振荡洗涤 5 分钟。5 分钟孵育后，倒出 AP 缓冲液，更换为 18 mL 新鲜 AP 缓冲液，再次轻轻振荡洗涤 5 分钟。
  6. 在避光条件下，倒出 AP 缓冲液，向载玻片染色盒中加入 18 mL BM purple 溶液。在室温避光孵育，每 ½ 小时检查一次紫色显色情况。显色反应时间因所用探针不同而异。
    注意：除使用 BM purple 显色外，也可使用 5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸盐（BCIP）和硝基蓝四氮唑（NBT）配制显色液。具体配制方法见表 1。
  7. 将载玻片转移至含有 18 mL Tris-EDTA（TE）缓冲液的新无菌载玻片染色盒中，在室温避光条件下孵育 5 分钟，以终止显色反应。
  8. 倒出 TE 缓冲液，向染色盒中加入 18 mL 无 RNase 水，在避光条件下洗涤 1 分钟。
  9. 将载玻片从水中取出，在组织边缘周围轻轻干燥。加入甘油封片剂，盖上盖玻片。将载玻片于 4 °C 保存，直至准备拍照。

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结果

完成本实验方案后，即可鉴定出表达目标RNA探针的细胞和组织。本方案的代表性结果针对AP-1、FosB和TNFR41。这些结果此前由Traylor-Knowles et al.11发表，展示了成年珊瑚在热应激暴露后RNA探针的空间表达情况。图1中呈现了两种不同类型的染色示例。图1A为组织弥散性染色的实例，染色信号遍布整个组织，而不仅局限于特定细胞。在此例中，反义AP-1的表达可见于外皮层和口部胃皮层11（图1A），染色呈弥散分布，未局限于某一特定细胞类型。对于此类染色，同时进行正义链对照实验尤为关键，因为部分结果可能源于非特异性染色。

第二类染色为细胞特异性染色，即...

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讨论

本方案所述方法已根据既往在医学及进化发育研究中的工作进行了修改8,9,10,12,17本方案重点阐述了一种方法的细微之处 原位 使用地高辛标记的RNA反义探针对已保存并包埋于石蜡中的成年珊瑚进行杂交。该方法可轻松转移应用于其他同样经石蜡包埋的生物样本。此外，该方法还可用于珊瑚不同生活阶段的样本例如，幼虫）或细胞培养物中，但具体方案可能有所不同，因为这些类型的样本并非总是石蜡包埋的5,6.

本实验方案中有多个关键步骤，包括蛋白酶K处理、探针杂交以及探针的显色反应。在蛋白酶K处理过程中，处理时间至关重要。若处理时...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作由美国国家科学基金会海洋科学博士后奖学金（资助号：OCE-1323652）和Burroughs Wellcome基金博士后丰富计划（资助号：1012629）资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Denhardt溶液Affymetrix70468 50 ML
Bioworld碱性磷酸酶缓冲液Fisher50-198-724
载玻片邮寄盒Fisher12-587-17B
Bioworld碱性磷酸酶缓冲液Fisher50-198-724
50 mL Falcon离心管Fisher14-959-49A
UltraPure鲑鱼精子DNA溶液Invitrogen15632-011
PBS - 磷酸盐缓冲盐水（10X），pH 7.4InvitrogenAM9625
UltraPure无DNase/RNase蒸馏水，10 × 500 mLInvitrogen10977-023
UltraPure无DNase/RNase蒸馏水，10 × 500 mLInvitrogen10977-023
UltraPure鲑鱼精子DNA溶液Invitrogen15632-011
Leica Biosystems白色尖端上部粘合载玻片Leica Biosystems3800080
PBS溶液，pH 7.4Life Technologies10010072
蛋白酶K，分子生物学级，2 mLNew England BiolabsP8107S
Super Pap Pen液体阻断剂Promega22309
DIG抗地高辛-AP Fab片段Roche11093274910
BM Purple，100 mLRoche11442074001
DIG洗涤与封闭缓冲液套装Roche11585762001
NBT/BCIPRoche11681451001
甲醛溶液，500 mL规格Sigma-Aldrich252549-500ML
SSC缓冲液，20X浓度Sigma-AldrichS6639-1L
乙酸酐Sigma-Aldrich320102-100ML
甲酰胺Sigma-Aldrich47670-250ML-F
三乙醇胺Sigma-Aldrich90279-100ML
来源于猪肠黏膜的肝素钠盐Sigma-AldrichH3149-10KU
二甲苯，分析纯（ACS），用于组织学VWRMK866806
乙醇VWREM-EX0276-4S
TE缓冲液VWRPAV6232
杂交炉VWR97005-252, 97005-254
旋转摇床VWR89032-088

参考文献

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