本文介绍了一种鉴定具有双链DNA基因组植物病毒的新方法。我们采用标准方法从感染的叶片中提取DNA和RNA，并进行高通量测序。生物信息学工具将测序结果组装成重叠群，识别代表病毒基因组的重叠群，并将这些基因组归类到相应的分类群中。
本文内容
摘要
摘要
这种宏基因组方法用于鉴定具有环状DNA基因组的植物病毒及其转录本。通常，一些在寄主中滴度较低或无法通过机械接种传播到其他寄主的植物DNA病毒，难以扩增以获得足够高滴度的感染性材料。将感染的叶片在温和缓冲液中研磨，该缓冲液的pH值和离子组成适用于大多数杆状植物逆转录病毒的纯化。使用尿素破坏包裹病毒粒子的包涵体并溶解细胞组分。通过差速离心进一步将病毒粒子与植物杂质分离。随后用蛋白酶K处理去除衣壳。然后浓缩病毒DNA，并用于下一代测序（NGS）。利用NGS数据组装重叠群（contigs），并提交至NCBI-BLASTn，以鉴定数据集中的一部分病毒序列。在并行的流程中，采用基于柱的标准RNA提取方法从感染叶片中分离RNA。随后进行核糖体RNA耗竭，以富集部分mRNA和病毒转录本。由RNA测序（RNA-seq）获得的组装序列同样提交至NCBI-BLASTn，以鉴定该数据集中的一部分病毒序列。在本研究中，我们在两个数据集中鉴定出两条相关的完整长度的花椰菜花叶病毒属（badnavirus）基因组。该方法优于另一种常用方法，即提取小RNA序列的总群体以重构植物病毒基因组序列。后一种宏基因组流程所回收的是已整合到植物基因组中的逆转录元件相关的病毒序列。因此需结合生物化学或分子检测手段，进一步区分真正具有活性的感染性病原体。本研究所描述的方法所获得的序列代表了正在复制的病毒，可能指示了活跃的病毒感染状态。
引言
新出现的植物病害促使研究人员开发新工具以准确鉴定致病因子。关于新发或再现病毒病的初步报告通常基于常见症状，如叶片花叶、畸形、脉明、矮化、萎蔫、病斑、坏死或其他症状。将一种新病毒确立为某种病害的致病因子的标准是：将其从其他污染性病原体中分离出来，在合适的寄主中进行增殖，并通过接种健康原寄主植物重现该病害。该方法的局限性在于，许多植物病毒属依赖昆虫或其他传播介体将其传入合适寄主或原寄主植物。在此情况下，寻找合适介体的过程可能耗时较长，建立介体的实验室种群可能存在困难，还需进一步努力制定实验性传播方案。若无法实现成功的实验室传播研究条件，则相关工作便无法达到报道新病毒病的标准。对于在自然寄主中滴度极低的病毒，研究人员必须鉴定替代寄主用于增殖，以维持足够量的感染性毒源以开展研究。而对于仅能感染少数几种植物的病毒种类，建立稳定的毒株培养也可能成为障碍1。
近年来，科学家越来越多地采用高通量测序（NGS）和宏基因组学方法来发现环境中存在的病毒序列，这些病毒可能与已知疾病无关，但可归类到特定的分类学种和属2,3,4。这类方法可用于发现和分类特定环境中的遗传物质，从而描述自然界中病毒的多样性或其在某一生态系统中的存在情况，但并不一定能够为明确某种明显疾病的致病因子提供判定框架。
Badnavirus 属属于副逆转录病毒科（Caulimoviridae）。这类病毒呈杆状，具有环状双链DNA基因组，大小约为7至9 kb。所有副逆转录病毒均通过RNA中间体进行复制。副逆转录病毒以附加体形式存在，并独立于植物染色体DNA进行复制5,6。对病毒群体的田间研究表明，这些病毒群体在遗传上具有复杂性。此外，通过高通量测序在多种植物基因组中获得的信息揭示了大量木薯花叶病毒属基因组片段通过非法整合事件插入植物基因组的实例。这些内源性木薯花叶病毒序列并不一定与感染相关7,8,9,10,11。因此，利用下一代测序技术（NGS）鉴定新的木薯花叶病毒作为致病因子时，由于附加体基因组的亚群多样性以及内源性序列的存在，分析过程变得复杂12,13。
尽管目前尚无一种最优的流程用于发现新的副逆转录病毒基因组，但通常采用两种常见方法来鉴定这些病毒是否为致病因子。一种方法是从感染的叶片中富集小RNA序列，然后将这些序列进行组装以重构病毒基因组14,15,16,17。另一种方法是采用滚环扩增（RCA）技术扩增环状DNA病毒基因组18。RCA的成功与否取决于叶片的发育阶段以及所选组织中的病毒滴度。RCA扩增产物需进行限制性酶切消化，并克隆至质粒中，以便直接测序19,20,21。
Canna yellow mottle virus（CaYMV）是一种杆状DNA病毒（badnavirus），被描述为导致美人蕉黄斑病的病原体，尽管此前仅从感病的美人蕉中分离出一段565 bp的基因组片段22。最近一项研究在Alpinia purpurata（姜花；CaYMV-Ap）中鉴定出CaYMV23。本研究的目标是从感病的美人蕉中回收完整的杆状DNA病毒基因组序列。我们描述了一种从植物杂质中纯化病毒、随后从该纯化物中提取病毒DNA，并构建适用于下一代测序（NGS）的DNA文库的方案。该方法无需中间的分子扩增步骤。我们还从感病植株中分离mRNA用于RNA测序（RNA-seq）。利用每种核酸样品分别进行包括RNA-seq在内的下一代测序（NGS）。通过美国国家生物技术信息中心（NCBI）的核酸基本局部比对搜索工具（BLASTn）分析，两个数据集中的组装重叠群（contigs）均被发现与Badnavirus属相关。我们鉴定了两种杆状DNA病毒的基因组24。
方案
1. 使用 Covey 等人et al. 报道的标准方法通过差速离心进行病毒的一般性纯化25
- 首先，从感病植株上剪取80–100 g叶片，在4 °C条件下，使用200 mL研磨缓冲液（0.5 M NaH2PO4，0.5 M Na2HPO4 （pH 7.2）和 0.5% (w/v) Na2SO3）。在此实验的所有步骤中均需穿戴实验服和手套。
- 然后，将匀浆液（300 mL）转移至1.0 L烧杯中。加入18 g尿素和25 mL 10%非离子型去垢剂（t八月-十日-碳6H4-(OCH2CH2)9在通风橱内向匀浆液中加入 OH。
注意：进行此步骤时，最好佩戴安全护目镜和简易呼吸面罩，以确保个人防护。 - 在通风橱中使用磁力搅拌器短暂搅拌，并用铝箔覆盖烧杯。然后将覆盖铝箔的烧杯转移至冷室，在4 °C下用磁力搅拌器搅拌过夜。
- 将匀浆转移至离心转子瓶（250 mL 容器）中，在4 °C条件下，使用固定角转子于4,000 × g离心10分钟。在化学通风橱中收集上清液，并通过四层纱布过滤。
- 将匀浆液分装至若干个38.5 mL聚丙烯离心管中，在4 °C条件下以40,000 × g离心2.5小时。通常检查管底是否有绿色沉淀，以及沿管壁长度方向是否有白色沉淀。倒去上清液，保留两种沉淀；将样品置于冰上。
注意：绿色沉淀物含有叶绿体、淀粉及其他细胞器。 - 在通风橱中操作，使用橡胶刮刀将沉淀物分开。将每个转子瓶中的白色沉淀物重悬于 1 mL ddH₂O 中。2在1–2小时内缓慢加入O，同时将悬浮液在4 °C下静置过夜，以使材料充分溶解。在4 °C下以6,000 × g离心10分钟，以去除残留的不溶物。
- 在 4 °C 条件下，以 136,000 x g 离心浓缩悬浮液 2 小时，沉淀病毒颗粒。将沉淀物重悬于 1 mL 缓冲液（50 mM Tris-HCl，pH 7.5，5 mM MgCl₂）中2).
注意：可选步骤是用 DNAse I（10 µg/mL）在 37 °C 处理病毒颗粒 10 分钟，以去除未被包裹的 DNA。 即， 污染的叶绿体和线粒体DNA。然后通过加入EDTA至1 mM以灭活DNAse I。 - 用 40 µL 浓度为 2 µg/µL 的蛋白酶K在 37 °C 下处理 15 分钟以裂解病毒颗粒。
- 在化学通风橱内操作，通过有机提取法回收病毒颗粒DNA。提取过程中佩戴面罩、手套和实验服，以防范潜在的急性健康危害。向样品中加入1体积的苯酚-氯仿-异戊醇（49:50:1），手动振荡20秒。在室温下以16,000 × g离心5分钟。小心移取上层水相，转移至新离心管中。重复此提取步骤两到多次。将有机相收集至玻璃废液瓶中，按照机构规定的化学品处理程序进行妥善处置。26.
- 使用乙醇沉淀法浓缩DNA。加入乙酸钠至终浓度为0.3 M（pH 5.2），并加入2.5倍体积的95%乙醇。将样品置于-20 °C环境中30–60分钟，然后在13,000 × g离心10–20分钟，使DNA形成沉淀。26.
- 在实验台操作，将DNA沉淀重悬于1 mL 0.1 mM TE缓冲液（pH 8.0）中。将悬液通过市售凝胶过滤柱（通常用于聚合酶链式反应（PCR）产物纯化）过滤，以去除可能干扰下一代测序（NGS）的盐类和低分子量物质。
- 使用1%琼脂糖凝胶电泳结合溴化乙锭染色分析样品，以评估制备物的质量。使用纳米滴光谱光度计评估DNA的质量。
注意：样品在260 λ和280 λ处的吸光度比值在1.85至2.0之间，通常表明该制备物 "清洁" 杂质含量符合要求，且质量达标。 - 使用基于芯片的毛细管电泳仪器分析DNA（用量为5 pg至10 ng）的质量。
注意：高质量的输出结果应显示清晰的峰，代表沿X轴按大小分布的DNA片段。峰高表示片段的丰度。锯齿状峰形提示存在部分降解的片段或化学污染物。圆滑曲线代表DNA弥散，表明样品质量较差
2. 使用 DNA 和基于乳液的克隆扩增（emPCR 扩增）进行文库制备
注意：文库通常由下一代测序（NGS）平台制备，该平台负责开展面向客户的服务工作。
- 使用雾化器对DNA溶液（> 200 ng）进行剪切，使DNA断裂成片段。根据说明书指示连接商业化的接头27。
- 按照制造商的说明对DNA样本进行乳液PCR（emPCR）扩增28,29,30。洗涤步骤重复三次，每次洗涤后在微量离心机中离心10秒以沉淀磁珠。每次洗涤后弃去上清液。
注意：该流程首先使用试剂盒中提供的商用洗涤缓冲液对捕获磁珠进行洗涤。emPCR通常用于下一代测序（NGS）的模板扩增。 - 将DNA或RNA在95 °C加热变性2分钟，然后置于4 °C保存直至使用。每500万个捕获磁珠使用2亿个DNA/RNA分子，最终体积为30 µL。在处理DNA/RNA样本的同时制备一个模拟样本，并对核酸样本和模拟样本同时执行以下步骤。
- 通过涡旋振荡乳化油管10秒（最高速度）进行乳化，然后将全部内容物（4 mL）倒入与平台式均质器兼容的塑料搅拌管中。将搅拌管置于平台上，以2,000 rpm混合乳液5分钟。
- 将乳液分装为每份100 µL，加入8联管或96孔板中。盖上管盖或密封板，然后按照制造商推荐的程序进行emPCR28。
注意：PCR完成后，检查各孔中乳液是否完整，确认无破损后再继续操作。若乳液破裂，则整孔废弃。 - 穿戴实验服并在化学通风橱内操作以收集扩增后的DNA磁珠（ADB）。用真空抽吸法从各孔中移除乳液，并将磁珠收集至50 mL离心管中。用100 µL异丙醇冲洗各孔两次，并将冲洗液一同抽入同一50 mL离心管中。
- 涡旋收集的乳液，并用异丙醇重悬ADB，最终体积为35 mL。在930 × g条件下离心5分钟以沉淀磁珠。弃去上清液，加入10 mL增强缓冲液。涡旋混匀ADB，然后加入异丙醇至终体积为40 mL进行洗涤。每次洗涤后离心并弃去上清液，重复洗涤两次。
- 最后一次洗涤使用乙醇替代异丙醇。加入增强缓冲液至终体积为35 mL，涡旋混匀后在930 × g条件下离心5分钟以沉淀磁珠。弃去上清液，但保留2 mL增强缓冲液。
- 将悬浮液转移至微量离心管中，短暂离心以沉淀ADB。弃去上清液后，用1 mL增强缓冲液冲洗ADB沉淀两次。每次冲洗后离心并弃去上清液。
- 为进行DNA文库磁珠富集，向磁珠中加入1 mL 1 N NaOH。涡旋混匀ADB，室温孵育2分钟。离心后弃去上清液。重复此洗涤步骤一次。
- 加入1 mL退火缓冲液，涡旋混匀ADB，室温孵育2分钟。短暂离心后弃去上清液。再次使用100 µL退火缓冲液重复此步骤。
- 为使测序引物与DNA退火，加入试剂盒提供的15 µL Seq Primer A和15 µL Seq Primer B。短暂涡旋混匀后，将微量离心管置于65 °C金属浴中5分钟。随后转移至冰上冷却2分钟。
- 用1.0 mL退火缓冲液洗涤三次，每次涡旋5秒后弃去上清液。
- 测序前使用商用磁珠计数仪测定磁珠数量。富集后的磁珠数量应至少达到500,000个。
注意：磁珠计数仪是一种专门用于测定所提供微量离心管中磁珠数量的设备。
3. 利用已报道的诊断性引物通过RT-PCR检测CaYMV阳性的染病美人蕉叶片，进行总mRNA分离及dsDNA合成
- 在后续所有步骤中，穿戴实验服和乳胶手套以进行个人防护。在实验台操作，从叶片中采集12个样品，并迅速将样品浸入液氮中。使用珠磨机进行匀浆。采用提供标准柱法的商业试剂盒进行总植物RNA提取。加入试剂盒提供的异硫氰酸胍裂解缓冲液至研磨后的样品中，振荡20秒。
- 根据试剂盒说明书加入乙醇并充分混匀。将每个匀浆液加入可结合RNA的离心柱中。洗涤三次后，将RNA洗脱至回收管中24。
- 使用分光光度计测定260 λ和280 λ处吸光度的比值，以定量RNA。通过含溴化乙锭染色的1%琼脂糖凝胶电泳验证RNA完整性。
注意：吸光度比值在1.85至2.0之间表明样品质量符合要求。用DNase I（10 µg/mL）在37 °C处理RNA 10分钟。使用商业离心柱将RNA浓缩于无RNase的水中31。在继续实验前合并RNA样品。 - 使用rRNA去除试剂盒去除植物核糖体RNA。将磁珠分装至微量离心管中，并用无RNase的水洗涤两次。涡旋振荡管内分装液以重悬磁珠，将管置于磁力架上，等待液体澄清。弃去上清液，加入磁珠重悬液。涡旋振荡以重悬，并加入1 µL RNase抑制剂。
注意：此类试剂盒利用与磁珠结合的寡核苷酸-dT与mRNA杂交。该方法采用标准磁珠分离技术回收转录本24。 - 将500 ng至1.25 µg的RNA、无RNase的水以及试剂盒提供的反应缓冲液混合。将混合物在50 °C孵育10分钟。移离热源后，加入经洗涤的磁珠（溶于无RNase的水中）。短暂涡旋振荡，室温静置5分钟。
- 将管置于磁力架上，等待液体澄清。将上清液转移至新的微量离心管中，置于冰上。
- 采用基于溶液的捕获方法富集外泌体，并使用200 ng RNA构建cDNA文库。
注意：双链cDNA文库通常由提供客户定制服务的高通量测序机构制备。 - 使用商业RNA片段化溶液（含0.136 g ZnCl2和100 mM Tris-HCl pH 7.0）对RNA进行片段化。向18 µL RNA（总量200 ng）中加入2 µL溶液。短暂离心后，将样品在70 °C孵育30秒，随后立即转移至冰上。加入2 µL 0.5 M EDTA pH 8.0和28 µL 10 mM Tris-HCl pH 7.5以终止反应。
- 室温下混合10分钟使RNA结合至磁珠。使用磁力浓缩器收集磁珠，弃去上清液。用200 µL 70%乙醇洗涤磁珠三次。每次洗涤后弃去乙醇，室温下空气干燥沉淀磁珠3分钟。用19 µL 10 mM Tris-HCl pH 7.5重悬磁珠。
- 将随机引物与片段化RNA在70 °C加热10分钟进行退火，随后将管置于冰上2分钟。使用标准商业cDNA合成试剂盒合成第一链和第二链cDNA。
- 使用磁力浓缩器纯化双链cDNA。用800 µL 70%乙醇洗涤三次。每次洗涤后弃去乙醇，室温下空气干燥沉淀3分钟。用16 µL 10 mM Tris-HCl pH 7.5重悬。使用磁力浓缩器将磁珠与已处于溶液中的双链cDNA分离。用移液器将cDNA转移至新的200 µL PCR管中。
- 使用商业文库构建试剂盒提供的Taq DNA聚合酶和脱氧核苷酸混合物进行片段末端修复。该商业试剂盒提供预稀释的接头，在25 °C条件下使用商业连接酶连接至双链cDNA的两端，反应10分钟。
4. 来自粗病毒制备物的DNA文库及来自mRNA的双链DNA文库的高通量测序
- 使用标准的高通量焦磷酸测序仪器，并遵循制造商推荐的所有操作规程，以获得DNA序列的直接读数。使用商业化的测序试剂，包括荧光标记的核苷酸。
注意：具体操作细节请参考仪器附带的制造商说明书。 - 采用基因组组装软件进行测序后分析，该软件可自动将测序读段组装成第一组重叠群（contigs），平均长度为 < 700 bp。在iPlant/CyVerse网站上使用FastQC软件对原始测序数据进行质量控制检查32。选择Phred质量值 ≥ 30 的序列，继续使用比对和扩增子分析软件，从较短的测序读段中重建更长的序列24。
注意：具体操作请参考制造商说明书。 - 将这些组装得到的重叠群提交至NCBI-BLASTn分析，使用MEGABLAST默认模块，并以Viridiplantae（TaxID: 33090）和Viruses（TaxID: 10239）作为限定的生物类群名称33。收集与已报道的Badnavirus基因组具有高度相似性的重叠群子集，并生成报告。
- 验证所连接的支架序列（scaffolds）是否代表一个或多个候选的完整病毒基因组，并正确生成与标准花椰菜花叶病毒（badnavirus）基因组结构一致的同框序列。为此，将候选的全长病毒基因组序列输入质粒图谱绘制软件。确认其前15个核苷酸为tRNAmet（TGGTATCAGAGCGAG），该序列在花椰菜花叶病毒中高度保守。定位基因组3'端附近的潜在多聚腺苷酸化信号。对完整基因组进行注释，识别其中是否存在两个小的开放阅读框（ORF）以及一个编码多聚蛋白的大开放阅读框。随后使用ExPASy平台的翻译工具确定花椰菜花叶病毒ORF1、ORF2和ORF3的翻译产物34。
注意：该科学软件免费提供，可生成环状DNA图谱，识别所有开放阅读框，并即时输出结果，用于确认序列是否代表完整的环状DNA基因组。 - 使用开源的多序列比对工具MUSCLE和CLUSTALW，对从DNA和RNA分析中获得的病毒基因组进行比较35,36。
- 在NCBI核苷酸数据库中检索，获取30种花椰菜花叶病毒（badnavirus）物种的完整基因组序列，并以.fasta格式导出为文件。将这些序列与通过NGS获得的病毒基因组序列一起上传至进化遗传分析软件。使用MUSCLE生成多序列比对和最大似然系统发育树37。
5. 质量评估 从头合成 通过PCR扩增感染植物中的病毒基因组进行测序
- 将新鉴定出的完整长度的badnavirus基因组序列（.fasta格式）输入免费的在线Primer3工具，以设计PCR引物38确定能够沿病毒基因组全长扩增出长度为1,000–1,500 bp的交错产物的引物对。将引物序列送至合成服务单位，以合成并获取PCR引物。
注意：该输出可识别出在引入序列上具有常见且适宜的熔解温度以及精确引物位置的可接受引物对。 - 在实验台工作，穿戴实验服和手套，使用基于标准顺磁性纤维素颗粒的自动化方法，从病毒感染叶片和健康对照叶片中分离5 µg DNA39 . 在微量离心管中用液氮速冻植物叶片材料（20–40 mg），并使用珠磨机研磨。将样品与裂解缓冲液在微量离心管中混合，并向每个样品中加入RNase A。涡旋振荡样品10–20秒，然后短暂离心以去除固体颗粒。
注意：顺磁性纤维素颗粒具有高DNA结合能力，可分离出高产量的纯DNA。标准的商用硅胶柱DNA提取方法无法高效地从多种植物物种中提取DNA。因此，已存在数十种针对这些方法的改良方案，以提高对特定植物物种的提取效率。本研究选用自动化顺磁性纤维素颗粒法，因其可从25种以上的草本被子植物物种中获得更高产量和更高质量的DNA。40. - 使用商用试剂盒 cartridge 进行自动化磁性 DNA 分离。向每个商用试剂盒 cartridge 中加入 300 µL 无核酸酶水，并将植物裂解液转移至同一 cartridge 中。将 cartridge 置于 cartridge 架上，将推杆放入靠近洗脱管的孔中，并向洗脱管中加入洗脱缓冲液。将 cartridge 装入自动核酸提取仪，运行植物 DNA 提取程序41,42.
- 通过PCR扩增获得一组重叠的PCR产物。每种正向和反向引物的浓度为5 µM，进行35个循环的PCR扩增。PCR循环条件如下：95 °C 变性60 s，50 °C 退火45 s，72 °C 延伸1–2 min，最后在72 °C 延伸7–10 min。使用预装的凝胶过滤柱，参照步骤1.2去除盐类和低分子量物质。31.
- 根据PCR产物与载体的3:1摩尔比，计算需与50 ng线性化pGEM质粒连接的PCR产物用量43使用对照插入DNA以确定连接反应是否高效。在4 °C条件下，使用T4 DNA连接酶（3 U/µL）过夜连接。随后转化市售的JM109感受态细胞 大肠杆菌 细胞。使用100 pg未切割的质粒DNA作为阳性对照，以检测转化效率。将100 µL转化后的细胞涂布于含抗生素及蓝/白筛选的LB-琼脂平板，用于回收连接后的质粒2637 °C下孵育平板16-24小时。
注意：pGEM 载体含有一个 lacZ 基因，该基因编码 β-半乳糖苷酶。在含有 100 µg/mL 氨苄青霉素、0.5 mM IPTG 和 80 µg/mL 5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖吡喃苷（X-gal）的平板上培养的转化细菌会因 β-半乳糖苷酶活性而呈现蓝色。pGEM 质粒被线性化的方式会破坏 lacZ 基因的完整性 lacZ 基因。含有PCR产物插入片段的菌落会破坏lacZ基因，无法代谢X-gal，因此这些菌落呈白色。由此可通过菌落颜色（白色与蓝色）区分含有插入片段的菌落与无插入片段的菌落。26. - 使用标准的柱式质粒提取试剂盒从三个菌落中提取DNA39对转化产物的三个质粒进行测序，将每条DNA序列与 从头合成 由下一代测序（NGS）产生的组装病毒基因组。使用CLUSTALW对序列进行比对，并确保其排列顺序正确。
结果
这种改良的病毒纯化方法可有效富集病毒DNA，有助于通过高通量测序（NGS）和生物信息学手段鉴定两种病毒种类。将匀浆在40,000 × g条件下离心2.5小时后，离心管底部出现绿色沉淀，管壁一侧出现白色沉淀。将绿色沉淀重悬于一个微量离心管中，白色沉淀则分置于两个微量离心管中。使用标准的CaYMV PCR诊断引物进行PCR扩增，结果显示可溶性白色沉淀中检测到扩增产物，而绿色沉淀中未检测到（图1A）。对粗提样品进行透射电子显微镜观察，发现杆状颗粒，长度为124–133 nm（图1B），该尺寸处于大多数杆状DNA病毒（badnavirus）预测的典型长度范围内。分别从白色和绿色沉淀中提取DNA并重悬。在图1C中，将从绿色和白色沉淀样品中提取的DNA各取5 µL（绿色组分含DNA 1.6 µg，白色组分含DNA 3.1 µg）上样至0.8%琼脂糖凝胶，经溴化乙锭染色后进行电泳分析。绿色组分主要含有低分子量DNA，而白色组分除低分子量DNA外，还显示出两条较高分子量DNA条带（图1C）。图1C所示凝胶在100 V电压下电泳40分钟，第3泳道的弥散条带提示应降低电泳电压以获得更清晰的条带。这些结果表明，白色沉淀中富含病毒颗粒。从白色样品中提取的DNA浓度为0.6 µg/mL，虽较低，但足以满足NGS对最低10 ng DNA的要求。随后利用片段化的DNA构建文库用于高通量测序。
同时，从感染的美人蕉植株（图1D）中提取RNA，用于高通量RNA测序。按照标准流程进行文库构建、下一代测序（NGS）、拼接生成重叠群，并鉴定病毒基因组序列（图1E）。比较了以DNA和RNA作为起始材料所获得的结果。
我们通过高通量测序（NGS）对粗提病毒样品中分离的DNA进行测序，共获得188,626条原始DNA读长。将这些读长组装为13,269个重叠群，并使用BLASTn比对NCBI核苷酸序列数据库（限定生物类群为绿色植物（Viridiplantae TaxID: 33090）和病毒（Virus TaxID: 10239））图1E）。NCBI-BLASTn 结果显示，93% 的 从头合成 组装的重叠群中，细胞序列占大部分，22% 为未知序列，0.3% 为病毒重叠群（图2A）。被归类为细胞序列的大部分重叠群被鉴定为线粒体或叶绿体DNA。在病毒重叠群数据集中，32%的病毒重叠群与属于 花椰菜花叶病毒科 （非芭蕉花叶病毒属序列），其中58%与以下序列相关 芭达病毒 在病毒重叠群中，29% 与已知序列高度相似（e < 1 × 10-30) 至 CaYMV 分离株 V17 ORF3 基因 (EF189148.1)， 甘蔗杆状病毒 分离巴达维亚病毒D株，完整基因组（FJ439817.1），以及 香蕉条纹CA病毒 完整基因组（KJ013511）。在此群体中，存在一些长的重叠群，其序列与两个全长基因组相似。
高通量RNA测序获得了153,488条经过清洗的独立序列读段，平均读段长度为 < 500 bp。重叠群组装将其减少至8,243个重叠群。这些重叠群被提交至NCBI-BLASTn（使用绿色植物TaxID: 33090和病毒TaxID: 10239作为限定生物类群），结果将76%的重叠群归类为植物细胞序列，23%为未知序列，0.1%被归类为病毒重叠群图2B）。对病毒重叠群中占0.1%的群体进行更深入分析后发现，其中68%被归类至 花椰菜花叶病毒科 (图2B）。在此群体中鉴定出三个具有高度相似性的大型重叠群（contig） < 1 × 10-30) 至 CaYMV 分离株 V17 ORF3 基因 (EF189148.1)， 甘蔗杆状病毒 分离巴达维亚病毒D株，完整基因组（FJ439817.1）及 香蕉条纹CA病毒 完整基因组（KJ013511）。通过分析这三个重叠群，我们手动将其中两个连接，获得一条完整的病毒基因组。
我们通过DNA和RNA测序产生的病毒基因组长度重叠群进行比较，相互作为支架，以确认两个完整长度病毒基因组的存在。其中一个完整长度的病毒基因组为6,966 bp，暂命名为Canna yellow mottle associated virus 1（CaYMAV-1）（图3A）。第二个基因组长度为7,385 bp，是感染Alpinia purpurata的一种CaYMV变体（CaYMV-Ap01）（图3A）。
最后，使用针对每种病毒设计的PCR引物，扩增约1,000 bp的片段，以在代表9个商业品种的227株美人蕉植株群体中差异性检测两种病毒的基因组。在许多情况下，单个植株同时感染了两种病毒。我们提供了在12株植株中通过RT-PCR检测CaYMAV-1和CaYMV-Ap01的示例。其中3株仅对CaYMV-Ap01呈阳性，9株对两种病毒均呈阳性（图3B）。
图1：病毒核酸制备及高通量测序流程。（A）CaYMV基因组565 bp PCR片段的琼脂糖（1.0%）凝胶电泳结果。在来自白色沉淀物的样品（泳道1、2）中检测到两个PCR产物，而在绿色沉淀物样品（泳道3）中未检测到。阳性对照（+）代表从感染植株DNA中扩增的PCR产物，该DNA使用基于标准顺磁性纤维素颗粒的自动化方法提取。泳道L为DNA分子量标记，用作测定样品泳道中线性DNA条带大小的标准。（B）通过透射电子显微镜观察到的病毒颗粒示例，该病毒颗粒来自感染芭蕉芋叶片经粗分级分离后获得的白色沉淀物。（C）从PCR检测呈阳性的绿色（泳道1）和白色（泳道2）沉淀物中回收的DNA进行琼脂糖（0.8%）凝胶电泳的结果。泳道2旁边的红色和黄色点标识了白色组分中出现的两条高分子量DNA条带。（D）通过基于柱的RNA纯化方法回收的总RNA的琼脂糖（1%）凝胶电泳结果。泳道L为DNA分子量标记，用作测定样品泳道中线性条带大小的标准。泳道1–6为从感染芭蕉芋叶片中分离的RNA，这些RNA被混合为单一样品用于核糖体RNA去除及RNA测序。（E）核酸提取、文库构建、测序、重叠群组装及病毒基因组发现的示意图流程。请点击此处查看该图的放大版本。
图 2：Krona 图表展示重叠群的分类学类别。（A）左侧图表显示从粗制病毒制剂组装得到的重叠群的丰度及其分类学分布。右侧图表描绘了与花椰菜花叶病毒科（Caulimoviridae）、芭豆病毒属（Badnavirus）以及三种近缘物种相关的病毒重叠群的比例。（B）左侧图示基于分类学分布显示从 RNA-seq 获得的重叠群的丰度。右侧图表则展示了在与花椰菜花叶病毒科（Caulimoviridae）、芭豆病毒属（Badnavirus）以及三种近缘物种相关的病毒重叠群群体中，各类重叠群的丰度。请点击此处查看该图的放大版本。
图3．CaYMAV-1和CaYMV-Ap01基因组的表征。（A）Canna yellow mottle associate virus 1（CaYMAV）和从Alpinia purpurata中分离的Canna yellow mottle virus类似基因组（CaYMV-Ap01）的示意图。核苷酸位置1-10被确定为基因组的起始区域，包含典型的大多数花椰菜花叶病毒（badnavirus）基因组所共有的tRNAmet反密码子位点。开放阅读框（ORF）1和ORF2翻译的终止与起始位置相邻，这些蛋白功能未知。ORF3为一种多聚蛋白，包含锌指（ZnF）、蛋白酶（Pro）、逆转录酶（RT）和RNA酶H（RNAse H）结构域。两种病毒基因组均保守存在3'端的poly(A)信号序列。（B）使用从病毒感染叶片中提取的RNA以及可检测CaYMAV和CaYMV-Ap01的引物进行RT-PCR分析。在同一组12株植物中，有3株仅感染CaYMV-Ap01，其余植株则同时感染CaYMAV和CaYMV-Ap01。（+）表示阳性对照，（-）表示阴性对照。本图经许可转载/修改自Wijayasekara et al.24。 请点击此处查看此图的放大版本。
讨论
近年来，已有多种方法被用于研究自然环境中植物病毒的生物多样性，包括富集病毒样颗粒（VLP）或病毒特异性的RNA或DNA2,3,44,45,46。这些方法随后结合高通量测序（NGS）和生物信息学分析。本研究的目标是鉴定一种栽培植物常见病害的致病因子。该病害被报道由一种未知病毒引起，该病毒具有无包膜的杆状颗粒，且仅有一个565 bp的片段被克隆47。这些信息已足以使先前的研究者假定该病毒属于花椰菜花叶病毒科（Caulimoviridae）的Badnavirus属。尽管此前有报道推测美人蕉花叶病是由单一的杆状DNA病毒（badnavirus）引起，但通过本研究中所述的宏基因组学方法，我们发现该病害实际上由两种暂定的杆状DNA病毒物种共同导致24。因此，采用宏基因组学方法鉴定病害致病因子的优势在于，我们现在能够识别出可能存在多种致病因素的情况。
我们结合DNA和RNA测序数据的方法具有全面性，同时表明两种方法所得结果一致，确认了两种相关病毒的存在。我们采用了一种改良的花椰菜花叶病毒（caulimovirus）分离流程，获得了富含病毒相关核酸且被保护于病毒衣壳内的样本。随后委托商业实验室进行DNA测序。从头测序的核心原理是，在DNA合成的连续循环过程中，DNA聚合酶将荧光标记的核苷酸掺入DNA模板链中。通过下一代测序（NGS）组装得到的重叠群（contigs）被提交至生物信息学分析流程，最终获得数个被鉴定为病毒来源的重叠群。进一步通过基于核糖体RNA耗竭后RNA样本所获得的RNA-seq数据进行生物信息学分析，确认了两个病毒基因组10,24,48,49,50的存在。一个有趣的发现是，通过DNA和RNA测序回收的序列群体在非病毒和病毒核酸的分布上表现出相似性。在DNA和RNA测序中，病毒来源的序列占比均< 0.5%。在病毒序列群体中，78–82%属于花椰菜花叶病毒科（Caulimoviridae）。通过比较DNA和RNA测序所组装的病毒重叠群，我们确认这两个组装出的基因组在两组数据中均存在。
仅使用DNA测序来鉴定新病毒基因组的一个问题是，杆状DNA病毒（badnavirus）的基因组为开环状DNA。我们推测，跨越基因组不连续区域的序列可能对从重叠群（contigs）进行基因组组装造成困难。对DNA测序结果的初步分析揭示了两种相似的病毒基因组。我们假设，这些基因组可能代表了一个尚未被研究过的物种的遗传多样性，或代表了在同一植株中共同感染的两个不同物种24。因此，通过对NGS DNA和RNA测序获得的数据集进行综合生物信息学分析，最终确认了两个完整长度基因组的存在。
另有研究报告开发了一种从植物匀浆中提取病毒样颗粒（VLP）和核酸以进行宏基因组学研究的替代方法，该方法基于从花椰菜花叶病毒（Cauliflower mosaic virus，CaMV；一种花椰菜花叶病毒属病毒）中回收DNA的技术3。该方法在非栽培植物中鉴定出了新的RNA和DNA病毒序列。本研究中用于发现栽培植物病害致病因子的花椰菜花叶病毒分离流程所衍生的步骤，与从自然感染植物中提取病毒样颗粒的步骤有所不同24。这两种经改进方法的成功表明，花椰菜花叶病毒的分离流程框架可能为植物病毒宏基因组学研究提供一个有价值的起点。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究由俄克拉荷马州科学技术进步中心应用研究项目第二阶段（AR 132-053-2）以及俄克拉荷马州农业部特色作物研究资助计划资助。我们感谢洪金（HongJin Hwang）博士以及俄克拉荷马州立大学生物信息学核心设施，该设施获得了美国国家科学基金会（NSF，项目号EOS-0132534）和美国国立卫生研究院（NIH，项目号2P20RR016478-04、1P20RR16478-02 和 5P20RR15564-03）的资助支持。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich，圣路易斯，密苏里州 | S5976 | 用于病毒纯化的研磨缓冲液 |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S0751 | 用于病毒纯化的研磨缓冲液 |
| Na2SO3 | Thermo-Fisher Waltham, MA | 28790 | 用于病毒纯化的研磨缓冲液 |
| 尿素 | Thermo-Fisher | PB169-212 | 匀浆提取 |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X-100 | 匀浆提取 |
| 纱布 | VWR，拉德诺，宾夕法尼亚州 | 21910-107 | 过滤匀浆 |
| Tris | Thermo-Fisher | BP152-5 | 沉淀重悬&和 DNA 重悬缓冲液 |
| MgCl₂2 | Spectrum，加利福尼亚州格伦代尔 | M1035 | 沉淀重悬缓冲液 |
| EDTA | 光谱 | E1045 | 终止酶反应 |
| 蛋白酶K | Thermo-Fisher | 25530 | DNA重悬缓冲液 |
| 苯酚:氯仿:异戊醇 | Sigma-Aldrich | P2069 | 溶解病毒颗粒蛋白 |
| DNA酶I | Promega | M6101 | 降解提取物中的细胞DNA |
| 95% 乙醇 | Sigma-Aldrich | 6B-100 | 病毒DNA沉淀 |
| 实验室均质器 | VWR | 58984-030 | 研磨叶片样品 |
| 落地式超速离心机 &Ti70 转子 | Beckman Coulter，美国德克萨斯州欧文市 | A94471 | 细胞提取物的分离 |
| 落地式离心机与JA-14转子 | 贝克曼库尔特 | 369001 | 细胞提取物的分离 |
| 磁力搅拌器 | VWR | 75876-022 | 过夜将尿素混入样品 |
| 橡胶刮刀 | VWR | 470104-462 | 溶解病毒沉淀 |
| 2100 生物分析仪仪器 | 安捷伦基因组学，美国加利福尼亚州圣克拉拉 | G2939BA | DNA和RNA质量与数量的高灵敏度检测 |
| 2100 生物分析仪 RNA-Pico芯片 | 5067-1513 | 用于在2100 Bioanalyzer中移动、染色并检测RNA质量的微流控芯片 | |
| 2100 生物分析仪 DNA-高灵敏度芯片 | 5067-4626 | 用于在2100 Bioanalyzer中移动、染色和测量DNA质量的微流控芯片 | |
| Nanodrop 分光光度计 | Thermo-Fisher | ND-2000 | 在实验流程的中间步骤中对DNA/RNA质量的分析 |
| 植物总RNA提取试剂盒 | Sigma-Aldrich | STRN50-1KT | 分离RNA用于RNA测序 |
| 无RNase水 | VWR | 10128-514 | 用于NGS的DNA和RNA重悬 |
| RNA浓缩旋转柱 | Zymo Research，加利福尼亚州尔湾市 | R1013 | 为RNA测序准备RNA |
| rRNA 去除试剂盒 | Illumina，加利福尼亚州圣地亚哥 | MRZPL116 | 为RNA测序准备RNA |
| DynaMag-2 磁力架 | 赛默飞世尔科技 | 12321D | 为RNA测序准备RNA |
| RNA 富集系统 | 罗氏 | 7277300001 | 为RNA测序制备RNA |
| 琼脂糖 | Thermo-Fisher | 16500100 | 实验流程中间步骤中DNA/RNA质量的凝胶分析 |
| 溴化乙锭 | 赛默飞世尔科技 | 15585011 | 琼脂糖凝胶染色 |
| pGEM-T + JM109 感受态细胞 | Promega，美国威斯康星州麦迪逊市 | A3610 | 克隆基因组片段 |
| pFU Taq 聚合酶 | Promega | M7741 | PCR扩增病毒基因组 |
| dNTPs | Promega | U1511 | PCR扩增病毒基因组 |
| PCR寡核苷酸 | IDT，爱荷华州科拉尔维尔 | 定制订单 | PCR扩增病毒基因组 |
| 质粒小提DNA纯化试剂盒 | Promega | A1330 | 测序前质粒DNA纯化 |
| PCR 纯化试剂盒 | Promega | A9281 | 准备用于克隆的PCR产物 |
| pDRAW32 软件 | ACAClone | 环状DNA与基序的计算机分析 | |
| MEGA6.0 软件 | MEGA | 分子进化遗传学分析 | |
| 引物设计 3.0 | Simgene.com | ||
| Quant-iT™ RiboGreen™ RNA 检测试剂盒 | Thermo-Fisher | R11490 | RNA含量的荧光测定 |
| GS Junior™ 焦磷酸测序系统 | 罗氏 | 5526337001 | 测序平台 |
| GS Junior Titanium EmPCR试剂盒（Lib-A） | 罗氏 | 5996520001 | 乳液PCR试剂 |
| GS Jr EmPCR 珠回收试剂 | 罗氏 | 5996490001 | 乳液PCR试剂 |
| GS Junior EmPCR试剂（Lib-A） | 罗氏 | 5996538001 | 乳液PCR试剂 |
| GS Jr EmPCR 油 &和断裂试剂盒 | 罗氏 | 5996511001 | 乳液PCR试剂 |
| GS Jr Titanium测序试剂盒* | 罗氏 | 5996554001 | 包含测序试剂、酶、缓冲液和填装珠 |
| GS Jr. Titanium Picotiter板试剂盒 | 罗氏 | 5996619001 | 测序板及配套试剂与垫圈 |
| IKA Turrax 混合器 | 3646000 | 专用于Turrax管的特殊混合器 | |
| IKA Turrax 试管混合器（专用混合器） | 20003213 | 用于制备乳剂的带内置转子专用混合管 | |
| GS 雾化器套件 | 罗氏 | 5160570001 | 用于文库构建过程中的核酸大小分选仪 |
| GS Junior emPCR 珠计数器 | 罗氏 | 05 996 635 001 | 文库磁珠计数器 |
| GS Junior 微珠沉积装置 | 罗氏 | 05 996 473 001 | 离心过程中用于固定皮可滴度板的支架 |
| 平衡重物 &和珠子沉积装置的适配器 | 罗氏 | 05 889 103 001 | 用于通过皮可滴度板离心平衡沉积装置 |
| GS Junior 软件 | 罗氏 | 05 996 643 001 | 用于控制仪器、采集和分析数据的软件套件 |
| GS Junior 测序仪控制软件 v. 3.0 | 罗氏 | （包含在上述编号 05 996 643 001 项目中） | |
| GS Run Processor v. 3.0 | 罗氏 | （包含在上述项目 05 996 643 001 中） | |
| GS De Novo Assembler v. 3.0 | 罗氏 | （包含在上述编号 05 996 643 001 项目中） | |
| GS Reference Mapper v. 3.0 | 罗氏 | （包含在上述项目 05 996 643 001 中） | |
| GS扩增子变异分析仪 v. 3.0 | 罗氏 | （包含在上述编号 05 996 643 001 项目中） |
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重印与许可
