本方案提供了一套全面的解剖与分析指南，用于利用深部眼内标志、S-视蛋白免疫组织化学、Retistruct 软件及自定义代码，准确且可靠地将分离的小鼠视网膜在解剖空间中进行定向。
本文内容
摘要
摘要
准确且可靠地确定分离的小鼠视网膜的空间方位，对于视觉神经科学领域的许多研究至关重要，包括视网膜细胞类型密度和大小梯度的分析、方向选择性神经节细胞的方向调谐特性研究，以及某些视网膜疾病中拓扑退行性变模式的检测。然而，文献中报道了多种用于识别和标记小鼠视网膜方位的眼球解剖方法。尽管这些研究中所采用的方位确定方法常被忽视，但若未明确报告视网膜方位的判定方式，可能导致文献间的差异，并在不同研究之间数据比较时引起混淆。浅层眼部解剖标志（如角膜灼伤标记）虽常被使用，但近期研究表明，其可靠性低于深层标志，例如眼外直肌、脉络膜裂或S-视蛋白梯度。本文提供了一套全面的操作指南，介绍如何利用深层眼部解剖标志，准确解剖并记录分离小鼠视网膜的空间方位。我们还比较了两种S-视蛋白抗体的有效性，并提供了S-视蛋白免疫组织化学的实验方案。由于基于S-视蛋白梯度确定视网膜方位需要使用Retistruct软件进行视网膜重建，并通过自定义代码实现旋转校正，因此我们详细列出了使用这两个程序的关键步骤。总体而言，本实验方案旨在提供一套可靠且可重复的方法，以实现精确的视网膜方位判定，并适用于大多数实验流程。本工作的核心目标是为今后的研究建立标准化的视网膜方位判定方法。
引言
视网膜神经科学中一个关键但有时被忽视的方面，是对分离的全层视网膜进行正确的定位与分析，无论是在电生理记录装置中还是在组织学切片上的视网膜定位。这一点在涉及小鼠视网膜的研究中尤为重要，因为小鼠目前是哺乳动物视觉系统研究中最广泛使用的模型。最近的研究发现，小鼠视网膜在空间上并非均匀分布，而是存在功能上不同的视网膜细胞类型的密度和大小梯度，例如黑视蛋白神经节细胞、瞬态OFF-α神经节细胞 以及视锥细胞视蛋白1,2,3,4,5。因此，用于确定视网膜定位的方法可能会影响涉及细胞类型或视蛋白分布2,3,6、方向选择性神经节细胞的方向调谐7,8,9以及视网膜变性拓扑模式10,11,12,13,14的实验结果。事实上，若未说明视网膜定位的确定方法，可能导致文献中的结果不一致，并在不同研究之间数据比较时造成混淆。因此，研究人员必须报告其用于识别视网膜定位的方法，以确保此类研究结果能够被准确解读。
视网膜方位通常通过在眼球摘除前对角膜的背侧、腹侧、鼻侧或颞侧进行标记来确定1,3,12,15,16,17,18,19，或通过切割或染色深层解剖标志（如眼外肌6,7、脉络膜裂20,21或短波敏感视蛋白（s-opsin）梯度2,3）来识别。通过在上直肌、下直肌、内直肌或外直肌附着处做深部切口，可分别利用这些直肌来识别视网膜的背侧、腹侧、鼻侧和颞侧。然而，对于大多数实验而言，仅使用一条直肌即足以确定视网膜方位22。脉络膜裂是眼球发育的残留结构，在眼球后部可见为一条微弱的水平线，该线的两端分别终止于眼球的鼻极或颞极23。最后，在小鼠中，s-opsin的表达在腹侧视网膜呈不对称分布，可通过s-opsin抗体在免疫组织化学实验中显示腹侧视网膜1。
Stabio的近期研究， 等22 研究表明，角膜烧灼等浅层眼部解剖标志在视网膜空间定位中的可靠性较低，这很可能归因于人为误差以及在使用颞侧和内侧眶眦作为参考点时角膜烧灼操作的变异性。相比之下，上直肌、脉络膜裂和S-视蛋白梯度等深层解剖标志已被证实是更为可靠且准确的视网膜定位参考标志22然而，识别这些解剖标志需要特定的解剖步骤，而这些步骤在现有文献中尚未得到详细描述。因此，本实验方案的目标是提供一个全面的教程，介绍如何利用上直肌、脉络膜裂和S-视蛋白梯度来准确判断小鼠视网膜的空间方位。此外，我们还比较了两种S-视蛋白抗体的有效性，并提供了S-视蛋白免疫组织化学的实验流程。
依赖精确视网膜方向的研究面临的另一个挑战是，为了将完整视网膜展平并固定在记录室、培养皿或载玻片上，需要进行较大的释放切口。这可能导致原本具有三维结构的视网膜在被作为二维平面结构成像时，给后续分析带来困难。一种名为 Retistruct24 的程序可用于在分析数据之前，将展平的完整视网膜恢复为其原始的三维结构。因此，本实验方案中专门设置了一部分内容，用于说明使用 Retistruct 软件重建经 s-opsin 免疫染色的小鼠视网膜所必需的操作步骤。我们还增加了一部分内容，介绍如何使用我们自主开发的 MATLAB 自定义脚本，该脚本旨在对经 s-opsin 染色的小鼠视网膜进行精确旋转和定向。
方案
本文所述所有方法均已获得阿克伦大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。
1. 利用上直肌标志识别视网膜方位
注意：上直肌是背侧视网膜的解剖标志（表1）。如果实验无需标记背侧视网膜，则跳过步骤1，直接进行步骤2。
- 遵循您所在机构动物护理和使用委员会批准的安乐死操作规程处理小鼠。
- 为了确定眼球的整体方位，在安乐死后立即于鼻侧和颞侧睑裂之间、靠近角膜-巩膜交界处的背部角膜上做一烧灼标记图1A）。通过将烧灼笔加热十秒钟，然后将笔尖接触角膜背侧不到一秒钟，以产生烧灼标记。
注意：灼烧笔接触角膜时间过长会导致眼球穿孔。
注意：尽管某些电灼笔会发出光线，但本清单中所列的电灼笔 材料表 加热时不会发出任何光线，因此是暗适应实验的安全选择。 - 摘除眼球时，使用弯头镊子轻柔地将眼睛从眼窝中推出，并从下方夹住眼球。不要切断视神经来移除眼球；而应缓慢地将眼球从眼窝中抬起，同时轻轻左右移动，直至眼球脱离眼窝。
注意：此操作可使直肌在眼球最终完全移出眼窝时仍附着于眼球。视神经也通常会保持与眼球的连接。 - 将附有直肌的眼球转移至含有解剖介质的培养皿中。注意记录左眼和右眼的对应关系。
注意：解剖操作应使用与实验方案相匹配的适当解剖介质。 - 在解剖显微镜下，肉眼观察定位角膜背侧烧伤区域，并辨认与其相关的上直肌（图1A).
- 使用解剖剪或20 G（0.9 mm × 25 mm）针头（参见 材料列表），在灼烧标记处刺穿角膜，朝视神经方向对眼球做一较深的减压切口，以分离上方肌肉。带有此切口的分离并重建的视网膜如图所示 图1B 和 1C.
- 开始使用两把镊子分离视网膜（参见 材料表用镊子轻轻撕开步骤1.6中穿刺形成的小孔，直至部分视网膜暴露出来。
注意：操作时务必轻柔，因为用力过大会导致减张切口进一步撕裂。 - 使用镊子将视网膜从巩膜上分离，直至完全去除巩膜。用镊子移除虹膜、晶状体、玻璃体及任何残留结构，直至视网膜完全分离。
注意：此处可暂停实验流程。若组织将用于s-opsin免疫组织化学染色，请继续进行步骤3.5。
2. 利用脉络膜裂标志识别视网膜方位
注意：脉络膜裂位于眼球后部的巩膜上，从颞极延伸至鼻极（图 2B 和 2C；表 1）。
- 按照批准的机构动物护理与使用委员会（IACUC）方案对小鼠实施安乐死。
- 为确定眼球的大致方位，在安乐死后立即于角膜背侧、鼻侧与颞侧睑裂之间靠近角膜-巩膜交界处进行烧灼标记（图2A）。使用电灼笔加热十秒后，将笔尖接触角膜背侧少于一秒完成标记。
注意：电灼笔接触角膜时间过长会导致眼球穿孔。 - 摘除眼球并将其转移至含有解剖介质的培养皿中。务必记录清楚左眼和右眼。
注意：解剖者应使用与其实验方案相匹配的适当解剖介质。 - 通过肉眼观察，定位并识别眼球后部的脉络膜裂（图2B, 2C）。
注意：脉络膜裂在眼杯内部在红外光下也可见20。 - 将眼球在培养皿中调整方向，使背侧烧灼标记位于上方极点，如同眼球仍位于小鼠体内时的位置。
注意：只要已记录是左眼或右眼，背侧烧灼标记的存在即可用于识别眼球的鼻侧和颞侧：若为右眼，鼻侧脉络膜裂位于烧灼标记右侧，颞侧脉络膜裂位于其左侧；若为左眼，颞侧脉络膜裂位于烧灼标记右侧，鼻侧脉络膜裂位于其左侧。
使用解剖剪或20 G（0.9 x 25 mm）针头（见材料表），在背侧烧灼标记处对眼球进行一次穿刺 。 - 从背侧角膜烧灼标记处向视神经方向做一条浅表的减张切口。该切口应垂直于脉络膜裂，以便在分离后识别背侧视网膜（图2D）。
- 向视神经方向做以下两条深部减张切口：第一条将解剖剪刀刃对准眼球后部的颞侧脉络膜裂线，第二条对准鼻侧脉络膜裂线。这些切口在分离并重建的视网膜上如图2D和2E所示。
注意：也可选择在颞侧脉络膜裂处做深切口，在鼻侧脉络膜裂处做浅切口，从而无需进行背侧角膜烧灼标记切口。此方法可通过更少的减张切口实现视网膜的准确定位。 - 使用两把镊子（见材料表）从步骤2.7和2.8所形成的穿刺孔开始，轻轻撕开组织，直至部分视网膜暴露，从而开始分离视网膜。
注意：此操作必须轻柔进行，用力撕扯可能导致减张切口进一步撕裂。 - 用镊子将视网膜从巩膜上逐步剥离，直至完全去除巩膜。随后用镊子移除虹膜、晶状体、玻璃体及其他残留结构，直至视网膜完全分离。
注意：此步骤可暂停。若组织将用于s-opsin免疫组织化学染色固定，请继续进行步骤3.5。
3. 小鼠视网膜中S-视蛋白梯度的标记
注意：S-视蛋白感光色素的表达在视网膜腹侧呈不对称分布1，因此可作为视网膜腹侧半区的优良标记物。该方法仅适用于固定并经免疫染色的组织（表1）。以下步骤可用于采用前述任一方法分离的视网膜。
- 按照批准的机构动物护理和使用委员会（IACUC）安乐死小鼠的操作规程进行操作。
- 安乐死后立即摘除眼球，并将眼球置于含有解剖介质的培养皿中。务必记录左眼和右眼的位置，以便在视网膜解剖后确定其方位。
注意：解剖者应使用与其实验方案相匹配的适当解剖介质。 - 使用两把镊子（材料表）轻轻撕开角膜，形成一个小孔，直至部分视网膜暴露，开始分离视网膜。
注意：此步骤必须轻柔操作，用力过猛可能导致视网膜撕裂。 - 用镊子将视网膜从巩膜上逐步剥离，直至完全去除巩膜。用镊子移除虹膜、晶状体、玻璃体及任何残留结构，使视网膜完全分离。
注意：此处可暂停操作流程。若将视网膜用于离体（ex vivo）实验，应在执行后续步骤前完成实验。 - 使用解剖剪在视网膜上做四个减张切口，使其能够平铺。用镊子轻轻按压视网膜各角，将其神经节细胞层朝上固定在硝酸纤维素膜上（材料表）。
注意：当使用S-视蛋白梯度确定视网膜方位时，减张切口的位置可任意选择。 - 用镊子将固定好的视网膜转移至24孔板（材料表）的第一个孔中，孔内预先加入1 mL 4%多聚甲醛（材料表）进行固定。将24孔板置于摇床上（材料表），室温下准确固定40分钟。
注意：以下所有洗涤和孵育步骤均应在置于摇床的24孔板中完成。 - 将视网膜转移至第二个含有1 mL 0.1 M PBS的孔中，室温下洗涤15分钟。依次将视网膜转移至第三和第四孔（均含1 mL 0.1 M PBS），重复该步骤两次。
- 将固定好的视网膜转移至第五孔，孔内含有1 mL封闭液（0.1 M PBS中含1.7% Triton X-100和5.2%驴正常血清；见材料表），4 °C下孵育过夜。
- 向封闭液中加入兔抗S-视蛋白一抗（见材料表），终浓度为1:500，4 °C孵育三天。
- 将视网膜依次放入六个含有1 mL新鲜0.1 M PBS的孔中，每个孔室温孵育10分钟，共洗涤六次，以去除未结合的一抗。
- 将视网膜转移至含有新鲜封闭液（0.1 M PBS中含1.7% Triton X-100和5.2%驴正常血清）的孔中，加入驴抗兔Alexa-594二抗（见材料表），4 °C下与二抗孵育过夜。
- 将视网膜依次放入六个含有1 mL新鲜0.1 M PBS的孔中，每个孔室温孵育10分钟，共洗涤六次，以去除未结合的二抗。
- 用镊子将固定在膜上的视网膜转移至含有0.1 M PBS的培养皿中。用镊子尖端轻轻插入视网膜与硝酸纤维素膜之间，逐步分离，直至视网膜完全脱离膜。
- 用镊子轻轻推动视网膜，使其贴附于载玻片表面，完成视网膜的贴片操作，然后将载玻片从培养皿中取出。
- 在载玻片上的视网膜上滴加Aquamount封片剂，加盖#1.5盖玻片。将载玻片放入载片盒中（见材料表），室温静置1小时。
- 使用完毕后将载玻片放回冰箱，并置于载片盒中（见材料表）于4 °C保存。盖玻片封片24小时后，用指甲油密封载玻片四周，防止脱水。
注意：此处可暂停操作流程。
4. 使用经S-视蛋白免疫染色的重建视网膜识别视网膜方向
- 使用共聚焦显微镜或配备相机的落射荧光显微镜观察S-视蛋白梯度（参见 材料表）并对视网膜进行成像，使整个视网膜在单幅图像中清晰可见（图1B、2D、3A， 和 三维可通过低倍镜下对视网膜进行分区域成像，然后将图像拼接完成。
- 为视网膜命名以便识别。例如，将第一个需要重建的视网膜命名为 "视网膜1".
- 在 https://imagej.nih.gov/ij/download.html 下载并安装 ImageJ。
- 为每张需要重建的视网膜创建一个独立的文件夹，但保持文件夹为空。例如，创建一个名为 "视网膜1"重建该视网膜所需的所有文件将在后续步骤中放入此文件夹。
注意：这些文件夹中仅应包含需由 Retistruct 分析的文件。除下述文件外，任何其他文件均会导致视网膜图像无法被 Retistruct 软件打开。 - 在 ImageJ 中选择“文件”→“打开”，然后选择视网膜图像以打开 "视网膜1".
- 在不修改图像的情况下，将其另存为 "image.png" 名为的文件夹 "视网膜 1" 通过选择“文件”→“另存为”→“PNG”来保存。
注意：文件必须命名为 "image.png" 以便 Retistruct 软件将该文件识别为用于重建的视网膜。 - 使用分段线工具勾勒视网膜边缘。通过在视网膜边界的两个相邻位置点击，分段线工具将自动连接这些点，从而实现对视网膜边界的轮廓描绘。 "连接点与点" 在两个相邻的点之间连接，形成轮廓。重复此步骤，直至整个视网膜被勾勒完成。将视网膜轮廓保存为 "outline.roi" 名为的文件夹 "视网膜1" 通过选择“分析”→“工具”→“ROI管理器”→“添加[t]”→“更多”→“保存”。
注意：视网膜边缘可通过s-视蛋白染色向背景过渡的区域来识别。 - 使用步骤 4.7 中所述的分段线工具勾勒视盘边界的轮廓。将视盘轮廓保存为 "od.roi" 名为的文件夹 "视网膜1" 通过选择“分析”→“工具”→“ROI管理器”→“添加[t]”→“更多”→“保存”。
注意：视盘表现为视网膜中央的一个小孔，其形态可能因解剖质量的不同而有所差异。
注意：进行 Retistruct 重建所需的所有文件（"image.png", "轮廓.roi"，以及 "od.roi") 应保存到该文件夹中 "视网膜1". - 要下载、安装和打开 Retistruct 程序，请参阅 Sterratt 补充材料部分中 Retistruct 用户指南所列的说明。 等24
- Retistruct 窗口出现后，单击 "开放" 窗口左上角的图标，然后选择目录文件夹 "视网膜1".
- 将弹出一个图像窗口，提示不存在比例尺。单击 "关闭" 视网膜图像将显示在框内。通过点击来可视化视网膜的轮廓 "性质" 窗口右上角的按钮，并将轮廓颜色更改为可见颜色（图5A).
- 重要提示：在左侧面板中注明视网膜来自右眼或左眼图5A).
- 点击 "添加泪液" 左侧按钮，通过点击视网膜裂孔或切口的三个顶点来标示其位置（图5A）。这将形成连接切口三个顶点的线条。对视网膜中的所有切口重复此操作。
- 通过点击视网膜轮廓上的任意一点来指定背侧视网膜。一个大写字母 "D" 将在轮廓的该位置显示图5B).
注意：视网膜背侧将是视网膜颜色较深的一半，与S-视蛋白梯度方向相反。然而，在Retistruct中对视网膜背侧进行标记并非识别视网膜背侧半区的可靠方法，因此该标记方法的使用需谨慎。 "背侧" 此步骤中的参数可以是任意的。 - 通过点击重建视网膜 "重建视网膜" 屏幕左上角的按钮（图5B). 重建的视网膜极坐标图将显示出来，切口部分将以与轮廓相同颜色呈现图5C).
- 点击 "保存" 屏幕右侧的按钮，以保存重建的视网膜及其所有相关数据 "视网膜1" 文件夹目录 (图5D).
- 通过点击保存重建的视网膜 "PDF" 右侧面板中的按钮（图5D）。将弹出一个对话框，要求输入尺寸参数。默认尺寸适用于后续步骤。此操作会将重建的视网膜保存为 "image.polar.pdf" 在 "视网膜1" 文件夹目录
- 开放 "image.polar.pdf" 在绘图程序（或其他图像处理程序）中使用 "油漆桶" 使用工具（或类似工具）将重建视网膜的背景更改为黑色。将重建的视网膜保存为 .tif 文件，例如 "视网膜1_重建.tif" 在 "视网膜1" 文件夹目录
注意：此处可暂停本实验方案。 - 下载用于旋转视网膜的 MATLAB 代码，名为 "Retina_Rotator.m" （参见补充材料）。将代码文件单独放置在一个文件夹中，该文件夹内不包含其他任何文件。
- 打开 MATLAB（版本 2007b 或更高版本）。双击代码文件，以在 MATLAB 中打开该文件。在命令窗口中输入 "视网膜旋转器" 然后按回车键，将出现一个搜索窗口。
注意：该代码仅适用于 .tif 文件。如果待旋转的文件格式不正确，代码将无法正确旋转视网膜。有关以正确格式保存重建视网膜的操作，请参见步骤 4.17 和 4.18。 - 打开需要旋转的文件。例如，选择 "视网膜1_重建.tif"。代码将分析重建的视网膜，并自动保存旋转后的视网膜为 "Retina1_reconstructed_rotated.tif" 在原始文件所在的文件夹中。
- 在代码完成对视网膜的分析后，将弹出一个窗口，显示视网膜旋转前和旋转后的图像，以便进行对比图3B 和 3C；图3E 和 3F).
注意：此代码将重建的视网膜旋转，使腹侧（最亮的一半）位于底部，背侧（最暗的一半）位于顶部，从而根据S-视蛋白梯度准确地定向视网膜1如果已记录视网膜来自右眼或左眼，则也可根据此定向方法推断出鼻侧和颞侧极的位置。图3).
结果
一条准确且可靠的切口，横贯上直肌，可精确定位背侧视网膜图1）。脉络膜裂通过沿颞侧和鼻侧脉络膜裂进行深部减张切口，可准确且可靠地识别鼻侧和颞侧视网膜图2）。在此示例中，还在视网膜背侧进行了减压切口，以确定视网膜的背侧/腹侧轴向（图2D，垂直箭头）。这些操作步骤的展示旨在为后续解剖者提供复制参考。结合s-opsin免疫组织化学（图 3A 和 三维），使用 Retistruct 软件进行重建（3B, 3E）以及通过定制的 MATLAB 代码实现精确旋转（3C, 3F)可用于识别视网膜的腹侧和背侧部分，如果已知视网膜来自右眼或左眼，则还可确定其鼻侧和颞侧极图3）。我们还比较了两种常用于标记s-opsin视锥细胞的s-opsin一抗抗体的有效性（图 4A-D）：山羊抗s-视蛋白一抗和兔抗s-视蛋白一抗均能有效标记s-视锥细胞（图4E) 在同一只小鼠中。
在经s-视蛋白免疫染色重建的小鼠视网膜中确定缓解切口的位置，并将其与根据s-视蛋白梯度确定的方向进行比较。利用我们定制的MATLAB代码（见补充材料），将视网膜精确旋转，使s-视蛋白染色浓度最高的区域位于腹侧，从而将真实背侧定位在90°（对应上直肌）、真实鼻侧定位在0°（对应鼻侧脉络膜裂）、真实颞侧定位在180°（对应颞侧脉络膜裂）。视网膜根据s-视蛋白梯度完成旋转后，使用ImageJ中的角度工具测定每个单独缓解切口的角度值。计算每种缓解切口类型的平均角度，并将各类切口的平均值绘制于极坐标图中（图6）。平均而言，上直肌切口将背极定位在96.3 ± 4.3°（n = 11）（图6）；鼻侧脉络膜裂将鼻极定位在6.7 ± 5.8°，颞侧脉络膜裂将颞极定位在172.0 ± 4.4°（n = 9；图6）。
图1：利用上直肌精确定位右眼背侧视网膜。（A）在角膜-巩膜交界处附近进行背侧角膜烧灼的示例，使用电灼笔完成（白色箭头）。在此视野中亦可见上直肌（白色箭头）。（B）完整铺片视网膜示例，通过切断上直肌在背侧视网膜制作减张切口。箭头指示通过切断上直肌在背侧视网膜所作的深层减张切口。视网膜使用一抗山羊抗-s-视蛋白（见材料表）和二抗驴抗山羊Alexa 594（见材料表；激发波长：590 nm；发射波长：620 nm）染色（青色）。使用配备Texas Red滤光片（595 nm）的落射荧光显微镜对视网膜成像。（C）在Retistruct软件中重建并使用自定义MATLAB代码旋转的视网膜（见补充材料），可见上直肌减张切口（白色箭头）。D：背侧，V：腹侧，T：颞侧，N：鼻侧。比例尺 = 1 mm。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2：利用脉络膜裂准确定位右眼视网膜的鼻侧和颞侧极。（A）使用电灼笔在角膜-巩膜交界处附近制造角膜背侧灼伤的示例。（B）在眼球后部巩膜上可见的脉络膜裂（白色箭头）。在此视角下也可看到角膜背侧灼伤，其位置距离颞侧脉络膜裂约90°。（C）在眼球后部巩膜上可见的脉络膜裂，从视神经延伸至角膜-巩膜交界处。（D）用山羊抗-s-视蛋白抗体（见材料表）和驴抗山羊Alexa 594二抗（见材料表；激发波长：590 nm；发射波长：620 nm）（青色）染色的视网膜，显示脉络膜裂切口（水平箭头）和背侧减张切口（垂直箭头）。使用配备Texas Red滤光片（595 nm）的落射荧光显微镜观察视网膜。（E）通过Retistruct软件重建并使用自定义MATLAB代码旋转的视网膜图像（见补充材料），可见背侧减张切口以及鼻侧和颞侧脉络膜裂切口（白色箭头）。D：背侧，V：腹侧，T：颞侧，N：鼻侧。比例尺 = 1 mm。 请点击此处查看该图的放大版本。
图 3：利用 s-视蛋白梯度识别视网膜的四个极。 (A) 来自右眼的一个视网膜样本，经解剖后通过免疫染色标记 s-视蛋白，并使用配备德克萨斯红滤光片（595 nm）的落射荧光显微镜成像。该视网膜上的切口是任意的，因为其拓扑方向由 s-视蛋白的梯度决定。(B) 使用 Retistruct 软件对 A 中的视网膜进行数字重建的结果。注意，s-视蛋白梯度未正确对齐，因为该视网膜尚未经过定制的 MATLAB 代码处理（参见补充材料）。(C) 使用定制代码对 A 中的视网膜进行旋转后的结果。视网膜已旋转至 s-视蛋白染色浓度最高的区域位于底部，并被确定为腹侧视网膜。由于该视网膜来自右眼，颞极位于背极逆时针 90°，鼻极位于背极顺时针 90°。(D) 来自左眼的一个视网膜样本，经解剖后通过免疫染色标记 s-视蛋白，并使用德克萨斯红滤光片（595 nm）成像。该视网膜上的切口是任意的，因为其拓扑方向由 s-视蛋白梯度决定。(E) 使用 Retistruct 软件对 D 中的视网膜进行数字重建的结果。注意，s-视蛋白梯度未正确对齐，因为该视网膜尚未通过定制代码进行旋转。(F) 使用定制代码对 D 中的视网膜进行旋转后的结果。视网膜已旋转至 s-视蛋白染色浓度最高的区域位于底部，并被确定为腹侧视网膜。由于该视网膜来自左眼，鼻极位于背极逆时针 90°，颞极位于背极顺时针 90°。D：背侧，V：腹侧，T：颞侧，N：鼻侧。比例尺 = 1 mm。 请点击此处查看该图的放大版本。
图4：两种抗s-视蛋白一抗在标记s-视锥细胞中的比较。 (A) 视网膜经山羊抗-s-视蛋白一抗染色（参见 材料清单). (B) 同一小鼠的另一只视网膜用兔抗-s-视蛋白一抗染色（见 材料清单). (C) 一个代表性区域（0.1 x 0.1 mm）2) 来自使用山羊抗-s-视蛋白一抗染色的视网膜。图像在落射荧光显微镜下以40倍放大倍数拍摄。 (D) 一个代表性区域（0.1 × 0.1 mm）2）来自用兔抗-s-视蛋白抗体染色的视网膜（参见 材料清单），一种一抗替代物。图像采用落射荧光显微镜在40倍放大倍率下拍摄。E两种抗体标记的短波视锥细胞外节数量相同，因为在所检测的任何视网膜偏心距下，山羊抗短波视蛋白抗体与兔抗短波视蛋白抗体所标记的免疫阳性短波视锥细胞数量之间均无显著差异（n = 2；采用方差分析） 事后检验 Bonferroni 检验 p >0.05)。比例尺 = 1 mm（A-B）； 25 µm （C-D）。 请点击此处以查看此图的放大版本。
图5：使用 Retistruct 软件重建经 s-视蛋白免疫染色的视网膜的可视化指南。（A）在 Retistruct 中打开的视网膜，可见其轮廓，并已添加一处“撕裂”。图中叠加的白色箭头指示“撕裂”位置的各个点。该视网膜上的所有切口均为任意设定，因为在解剖过程中未使用特定解剖标志来标记视网膜的方向。重要按钮以红色轮廓标出。（B）已添加全部“撕裂”并用边缘处的“D”标记背侧视网膜的视网膜图像。请注意，“重建视网膜”按钮此时已可见。重要按钮以红色轮廓标出。（C）视网膜重建过程。重建后视网膜的极坐标图将显示在右侧，图中以青色显示释放切口（叠加蓝色箭头以明确切口位置）。（D）将视网膜运行 Retistruct 软件处理后的最终结果。原始全层视网膜图像保留在左侧，重建后的视网膜显示在右侧。释放切口以青色显示（叠加白色箭头以明确切口位置）。请点击此处查看该图的放大版本。
图6：上直肌和脉络膜裂可用于准确定位小鼠视网膜的方向。 基于使用Retistruct重建的视网膜，通过上直肌切口或脉络膜裂切口所获得角度的极坐标图。在经s-opsin免疫染色并重建的视网膜上确定释放切口的位置，并将其与s-opsin梯度的位置进行比较。利用定制的MATLAB代码精确旋转视网膜，使s-opsin染色浓度最高的区域位于腹侧，从而确定每块视网膜的真实背侧（上直肌对应90°）、真实鼻侧（鼻侧脉络膜裂对应0°）和真实颞侧（颞侧脉络膜裂对应180°）。每个单独释放切口的角度在ImageJ中测定，并对每种类型的释放切口计算平均角度。上直肌切口将背极定位在96.3 ± 4.3°（n = 11）。鼻侧脉络膜裂将鼻极定位在6.7 ± 5.8°，而颞侧脉络膜裂将颞极定位在172.0 ± 4.5°（n = 9）。请点击此处查看此图的放大版本。
| 深层解剖标志 | 角膜烧灼位置 | 视网膜极性确定 | 实验应用 |
| 上直肌 | 背侧 | 背侧 | 活体或固定 |
| 鼻侧脉络膜裂 | 背侧 | 鼻侧 | 活体或固定 |
| 颞侧脉络膜裂 | 背侧 | 颞侧 | 活体或固定 |
| S-视蛋白梯度 | 无 | 背侧、腹侧、鼻侧、颞侧 | 固定 |
表1：深层解剖标志、它们所标识的视网膜极性位置，以及是否可用于活体或固定组织的应用。
讨论
目前尚无全面且标准化的方案用于确定和标记分离小鼠视网膜在解剖空间中的方向。本文详述的方案旨在填补这一空白，通过标准化并详细说明如何利用深层解剖标志作为参考点，以可靠地识别视网膜的方向。已有研究表明，本方案中所述的深层解剖标志在定位小鼠视网膜方向方面，比角膜灼伤等表层标志更为准确和可靠22。因此，依赖角膜灼伤进行视网膜定向的研究，其方向判断误差可能大于依赖直肌和脉络膜裂等标志的研究。这一差异凸显了本标准化方案的重要性，尤其是在解释结果以及对依赖精确视网膜定向的研究之间进行比较时尤为关键。总体而言，该标准化方案将为视觉科学研究人员提供一种通用的方法，从而消除因使用非标准化方法识别视网膜方向而在数据采集过程中可能引入的混杂变量。
本文介绍的方法易于重复，且适用于多种类型的实验方案。事实上，本方案最大的优势之一在于其可适应性。由于脉络膜裂、S-视蛋白表达以及直肌解剖标志均已被证实可稳定地用于确定视网膜方位22，因此可根据实验参数选择最合适的标志，以优化数据采集（表1）。此外，可将多种解剖方法结合使用，以进一步明确视网膜的方位。例如，可将脉络膜裂切口与S-视蛋白免疫组织化学染色相结合，从而确定视网膜的四个极：鼻侧和颞侧半球可通过脉络膜裂切口识别，而S-视蛋白免疫组织化学染色则可识别腹侧和背侧半球。然而，本方案的可适应性可能受到生理学实验时间敏感性的限制。由于在离体（ex vivo）实验中，识别标志、制作角膜灼烧标记及实施减张切口所需的时间可能导致组织发生显著死亡，因此其中某些解剖方法可能并非最优选择。幸运的是，一旦操作者熟悉了脉络膜裂或上直肌解剖方法，识别深层解剖标志并快速完成减张切口便会成为常规解剖流程的一部分，不会显著延长整体解剖时间。尽管我们承认此处详述的步骤可能增加对时间极为敏感的实验的耗时，但我们建议在组织活性不再成为问题时，采用S-视蛋白梯度进行事后（post hoc）视网膜方位判定（图3）。对视网膜进行S-视蛋白染色是一种有效的定位方法，因其可识别全部四个极：S-视蛋白染色可将视网膜划分为背侧和腹侧两极，并根据视网膜来自右眼或左眼进一步确定鼻侧和颞侧两极（图3）。因此，我们认为本方案提供了一套可靠且可重复的方法体系，能够准确确定视网膜方位，满足各种实验需求。
与任何改良的视网膜解剖方法一样，该解剖方法的有效性受限于解剖者的操作准确性和所分离组织的质量。如果在解剖过程中丢失了部分组织，或视网膜损伤过于严重而无法进行准确重建，则 Retistruct 和 MATLAB 程序将无法可靠地重建或定位视网膜。因此，在用于数据收集实验之前，必须先练习该解剖方法。尽管本文所述的解剖类型并不复杂，但仍需反复练习，以确保能够重复识别具有特定解剖标志的视网膜方位。此外，解剖者在开始数据收集前，必须练习通过视觉识别解剖标志，以确保使用的是正确的标志。检验某位解剖者准确性的方法之一是制作脉络膜裂切口或上直肌切口，然后将切口位置与 S-视蛋白梯度进行比较，因为后者是一个固定的标记，不依赖于解剖操作的准确性。潜在的解剖者还可以将自己的重建视网膜结果与 图1 和 图2 中展示的具有准确标志切口的重建视网膜示例进行比较。本质上，潜在的解剖者应按照本方案中针对特定解剖类型（无论是上直肌法还是脉络膜裂法）所列出的步骤进行操作，并将结果与 S-视蛋白梯度进行比对，以验证该解剖者的可靠性。因为如果解剖者对标志位置不确定，可能导致视网膜定位错误，从而默认影响数据的收集与解释。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢Brittany Day和Jessica Onyak提供的技术协助，以及Liu博士慷慨允许我们使用他的落射荧光显微镜。 资助声明：NIH R15EY026255-01和Karl Kirchgessner基金会。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.1 M 磷酸盐缓冲液 | Sigma-Aldrich | P5244 | |
| Axioplan2 正置荧光显微镜 | Zeiss | N/A | |
| 透明指甲油 | N/A | N/A | |
| Corning LSE 低速轨道摇床 | Sigma-Aldrich | CLS6780FP | |
| Costar TC 处理 24 孔板 | Sigma-Aldrich | CLS3524 | |
| 解剖显微镜 | Olympus | SZ51 | |
| 驴抗山羊 Alexa 594 | Life Technologies | A11058 | |
| 驴抗兔 Alexa 594 | Life Technologies | A21207 | |
| 正常驴血清 | Millipore | 566460 | 使用浓度为 5.2%（每 1 mL 封闭液中加入 52 μL 正常驴血清、86 μL 20% Triton X-100 和 863 μL 0.1 M PBS） |
| Fisherbrand Superfrost Plus 显微镜载玻片 | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| 山羊抗 s-视蛋白 | Santa Cruz Biotechnologies | sc-14363 | 截至 2017 年未商业化供应 |
| Graefe 弯头眼科镊 | Fine Science Tools | 11052-10 | |
| ImageJ 或 FIJI | 美国国立卫生研究院 | N/A | 免费软件 |
| 低温眼科精细尖电凝器 | Bovie Medical Corporation | AA00 | |
| MATLAB | MathWorks | N/A | 至少版本 2007b 或更高版本 |
| 微型盖玻片 | VWR International | 48393-241 | |
| 显微镜载玻片架 | VWR International | 82020-913 | |
| Moira 超细镊 | Fine Science Tools | 11370-40 | |
| 硝酸纤维素膜 | Millipore | HAWP04700 | |
| 多聚甲醛 | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | 使用浓度为 4%（每 1 mL 固定液中加入 25 μL 多聚甲醛和 875 μL 0.1 M PBS） |
| PrecisionGlide 针头 20G (0.90 mm x 25 mm) | BD PrecisionGlide | 305175 | |
| Pyrex 玻璃培养皿 | Sigma-Aldrich | CLS3160152 | |
| R | 统计计算 R 项目 | N/A | 免费软件；版本 3.4.3 或更高版本 |
| 兔抗 s-视蛋白 | Millipore | ABN1660 | |
| Retiga R3 显微镜相机 | Qimaging | 01-RET-R3-R-CLR-14-C | |
| Retistruct | N/A | N/A | 免费软件 ，兼容 Windows 7 或 Windows 10 |
| Shandon Aqua-Mount 载玻片封片介质 | Fisher Scientific | 14-390-5 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | 使用浓度为 1.7%（每 1 mL 封闭液中加入 86 μL 20% Triton-X、52 μL 正常驴血清和 863 μL 0.1 M PBS） |
| Vannas 弹簧解剖剪 | Fine Science Tools | 15000-03 | |
| 500 万像素 USB 数码显微镜相机 | AmScope | MU500 | 与 Olympus 解剖显微镜配合使用 |
参考文献
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