本文介绍了一种针对昆虫口器须状突上的锥形感器进行单感器记录的详细且高效的方法。
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摘要
摘要
蝗虫口器的须被认为是传统的味觉器官，在蝗虫的食物选择中起着重要作用，特别是通过毛形感器（以前称为末端感器或冠状感器）来检测非挥发性化学信号。目前越来越多的证据表明，这些须还具有嗅觉功能。在须的锥形感器中，已分别在神经元和辅助细胞中定位到一种气味受体（LmigOR2）和一种气味结合蛋白（LmigOBP1）。单感器记录技术（SSR）用于记录气味受体神经元的反应，是筛选特定气味受体活性配体的有效方法，也被应用于须部感器中气味受体的功能研究。位于须顶端圆顶上的锥形感器结构与触角上的锥形感器略有不同。因此，在使用气味物质诱发SSR记录时，一些具体的操作建议可能有助于获得最佳实验结果。本文介绍了一种针对昆虫须部锥形感器进行单感器记录的详细且高效的操作方案。
引言
动物进化出多种化学感受器官，用于感知外界的化学信号。在昆虫中，最重要的化学感受器官是触角和须。这些器官上分布着多种称为化学感受器的化学感受毛，其内部含有化学感受神经元（CSNs）。化学感受器中的化学感受神经元通过将化学刺激转化为电信号，实现对特定化学信号的识别，并将这些电信号传递至中枢神经系统1,2,3。
化学感觉神经元（CSNs）在其细胞膜上表达多种化学感受受体[例如，气味受体（ORs）]、离子型受体（IRs）和味觉受体（GRs），这些受体可编码与不同类型化学感知相关的外源性化学信号4,5,6。对CSNs的表征是阐明昆虫化学感受细胞与分子机制的关键。目前，单感器记录技术（SSR）已被广泛用于多种昆虫触角感器中CSNs的表征研究，包括果蝇7、蛾类8、甲虫9、蚜虫10、蝗虫11和蚂蚁12。然而，将SSR技术应用于昆虫须状结构（palps）的研究较少13,14,15,16,17，因其感器的特殊结构使得电生理记录较为困难18。
蝗虫（直翅目）常成群出现，造成严重的农作物损害和经济损失19。研究表明，蝗虫的触须在其食物选择过程中可能发挥重要作用20,21,22,23,24。通过扫描电子显微镜（SEM）可观察到两种类型的化学感受感器。通常，在每一片蝗虫触须的半球形结构上可观察到约350个毛形感器和7至8个锥形感器18。毛形感器为味觉感器，用于感知非挥发性化学信号，而锥形感器则具有嗅觉功能，用于感知挥发性化学信号。
在蝗虫的触须上，锥形感器（sensilla basiconica）的毛窝直径（约 12 µm）明显大于刺形感器（sensilla chaetica）的毛窝直径（ca. 8 µm）18,25。触须上锥形感器的角质层壁比触角感器的角质层壁厚得多18。此外，触须顶端的圆顶结构内部含有液体，且被一层高度柔韧的角质层包裹。这些特征使得使用微电极穿刺并获取良好的电生理信号的难度高于触角感器。本文结合视频，介绍了一种针对蝗虫触须锥形感器的详细且高效的SSR实验方案。
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方案
1. 仪器与昆虫的准备
- 制备钨电极和刺激溶液
- 将一根新的钨丝（直径 0.125 mm，长度 75 mm）固定至显微操作器中，并在 10%（w/v）亚硝酸钠（NaNO₂）溶液中进行尖端处理2在体视显微镜（40倍放大）下，使用电源提供的10 V电压，将注射器中的溶液电穿孔约1分钟。
- 将 sharpened 钨丝反复浸入 10% NaNO2 溶液，约在5 V时迁移4 mm < 1 分钟（图1A).
- 在体视显微镜下频繁检查钨丝尖端的直径，直至其足够细，能够刺入蝗虫触角嗅觉感器的角质层图1B).
- 配制刺激溶液。将每种化学刺激物用矿物油稀释。1-非醇和壬酸稀释至10%。反-2-己烯醛和己醛稀释至10-2, 10-3, 10-4，和10-5.
- 准备装有刺激物的巴斯德管：将滤纸条（长2 cm，宽0.5 cm）插入巴斯德管中，每条滤纸加入10 µl稀释后的刺激溶液，然后用1 ml移液器吸头封住巴斯德管口。
- 准备昆虫
- 后部的蝗虫飞蝗在相对湿度60%、温度28–30 °C、光周期18:6 h（光照：黑暗）的条件下，使用新鲜的小麦幼苗在拥挤环境中培养。选取1至3日龄的5th 二龄蝗虫若虫，用精细剪刀去除触角，以避免记录时产生干扰。
- 准备蝗虫上颚须固定器
- 使用载玻片（25 mm × 75 mm）作为上颚须固定器（MPH）的基底。用双面胶带将一块塑料片（高1 mm，宽10 mm，长35 mm）固定在载玻片的一角，再用双面胶带将盖玻片（18 mm × 18 mm）固定在塑料片上方。在盖玻片上放置一小块红色橡胶胶带作为防滑层。塑料片与盖玻片共同构成蝗虫须的承载平台，平台高度约为1.5 mm。
- 在平台内侧边缘平行距离1.5 mm处安装一根钨丝（直径0.125 mm，长度36 mm）。使用双面胶带将钨丝两端固定在平台上。
2. 蝗虫上颚须的制备
- 将离心管（1.5 ml）沿纵向切开成两半，并切除底部。将蝗虫放入制备好的管中，使蝗虫的腹面和头部暴露在外。用双面胶带将该装置固定在载玻片上（图2A）。
- 将右侧上颚须拉至记录平台上。
- 将钨丝放置在上颚须的第四节上。在钨丝两侧距上颚须约2 mm处各放置一团黏性固定胶（图2A 和 2B）。
3. 单感器记录
- 将蝗虫上颚须标本置于显微镜下，使用低倍镜（100X）观察。调整标本位置，使上颚须与记录电极垂直（图3A）。
- 使用显微操作器将参考电极（钨电极）插入蝗虫眼部。用显微操作器将记录电极（钨电极）移至上颚须附近（图3B 和 3C）。
- 调节气味递送装置，使其距离上颚须约1 cm（图3B）。
- 打开记录软件 Auto Spike 32，设置记录参数如下：记录量程为 500 µV；滤波器高截止频率为 300 Hz，低截止频率为 200 Hz；预触发时间为 10 s。
- 将记录电极连接至10倍通用交流/直流放大器。
- 切换显微镜至高倍镜（500X）。将记录电极插入上颚须上的一个锥形感器基部，并精细调节记录电极位置，以获得良好的自发放电峰电位（图3D）。
- 打开刺激控制器，以20 ml/s的流速输送持续气流。设置刺激时间为1 s。记录刺激脉冲开始前10 s至结束后共10 s的信号。
- 使用10倍通用交流/直流放大器对信号进行放大，将信号输入IDAC 4。使用Auto Spike 32软件分析信号。交流信号通过200至300 Hz的带通滤波。利用Auto Spike 32区分峰-谷振幅与噪声。将神经元反应计算为动作电位频率（每秒放电次数）相对于自发频率的增加量。使用GraphPad Prism 7进行统计分析。
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结果
根据对化学气味物质（10% 1-壬醇和10% 壬酸）的不同响应动态，已鉴定出蝗虫上颚须上的两种感器亚型（pb1 和 pb2）。pb1 中的神经元对 1-壬醇产生的峰电位显著多于对壬酸的反应，而 pb2 中的神经元对 1-壬醇的激活程度显著低于对壬酸的激活（图 4）。己醛和反-2-己烯醛均可引发蝗虫须部张开反应（POR）26。己醛是一种丰富的寄主植物绿色叶片挥发物，可能有助于进一步确认食物来源26。当受到反-2-己烯醛刺激时，pb1 神经元产生的峰电位持续时间长于 pb2 神经元（图 4）。pb1 和 pb2 中的神经元对己醛均表现出强烈且相似的响应（图 4）。比较刺激前 5 秒与刺激后 5 秒期间总峰电位的平均变化表明，在 pb1 中对 1-壬醇的响应显著高于对壬酸的响应，而在 pb2 中则相反（
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讨论
昆虫依靠触须来探测食物气味，其触须被认为在物种形成过程中发挥着重要作用13,27。触须是简单的嗅觉器官，正日益成为研究化学感应背后神经分子网络的一个理想模型28。
果蝇（Drosophila melanogaster）、冈比亚按蚊（Anopheles gambiae）和致倦库蚊（Culex quinquefasciatus）的唇瓣和须的单感器记录（SSR）已成功开展13,14,15,16,17，但以视频形式报道的极为少见
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究工作得到中国国家自然科学基金（编号：31472037）的资助。本文中提及的任何商品名或商业产品仅用于提供具体信息，并不构成推荐。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 钨丝 | ADVENT | W559504 | 用于制作电极和固定触角 |
| NaNO2 | Sigma-aldrich | 563218-25G | 用于 sharpening 钨丝 |
| 交流电源 | Syntech | A2-70 | 为 sharpening 钨丝提供电压 |
| 体视显微镜 | Motic | SMZ-163 | 用于观察钨丝的 sharpening 过程 |
| 显微镜 | Olympus | W-51 | 用于观察蝗虫上颚须上的感器 |
| 智能数据采集控制器 | Syntech | IDAC-4 | 在记录前后实时显示所有信号 |
| 刺激控制器 | Syntech | CS-55 | 用于控制刺激施加 |
| 电子显微操作器 | C.M.D.T | CFT-8301D | 用于微调记录电极的位置 |
| 显微操作器 | Narishige | MN-151 | 用于微调参考电极的位置 |
| 扬声器 | EDIFIER | R101T06 | 连接 IDAC-4，用于输出信号声音 |
| 磁性底座 | PDOK | PD-101 | 用于固定电极和刺激递送管 |
| 减震台 | TianHe | HAP-100-1208 | 用于隔离设备产生的振动 |
| 载玻片 | CITOGLAS | ZBP-407 | 用于制作 MPH 的基底 |
| 蓝丁胶 | Bostik | Blu-tack-45g | 固定钨丝 |
| 巴斯德管 | YARE | WITEG | 放置含有刺激物溶液的滤纸 |
参考文献
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