mds 诊断是困难的, 在没有形态学标准或非信息细胞遗传学。mfc 可以帮助优化 mds 诊断过程。为了对临床实践有用, mfc 分析必须基于具有足够特异性和敏感性的参数, 数据应在不同的操作人员之间重现。
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mds 诊断是困难的, 在没有形态学标准或非信息细胞遗传学。mfc 可以帮助优化 mds 诊断过程。为了对临床实践有用, mfc 分析必须基于具有足够特异性和敏感性的参数, 数据应在不同的操作人员之间重现。
在法国细胞术协会 (afc) 内成立了一个工作组, 以协调多参数流式细胞术 (mfc) 在法国骨髓疾病诊断中的应用。这里介绍的议定书是在2013年9月至2015年11月期间在六个法国诊断实验室 (圣艾蒂安、格雷诺布尔、克莱蒙-费朗、尼斯、里尔和保利-卡尔特斯研究所) 商定并应用的。马赛), 并允许骨髓样品制备和数据采集的标准化。三个成熟数据库被开发了中性粒细胞, 单核细胞和红血球系与骨髓从 "健康" 捐献者 (个人没有任何证据的造血疾病)。对于每个髓系的可靠分析方法应该适用于常规诊断使用。可以以相同的方式分析新案例, 并与通常的数据库进行比较。因此, 定量和定性表型异常可以被确定, 那些超过2sd 的人相比, 正常骨髓样本的数据应被视为指示病理。主要的局限性是使用基于杂交瘤技术的方法获得的单克隆抗体获得的数据与目前用于临床诊断的数据之间的差异较高。为所获得的数据设置技术验证标准可能有助于提高 mfc 在 mds 诊断中的效用。制定这些标准需要对数据库进行分析。减少数据分析中的研究者主体性是该方法的一个重要优点。
在 mds 启动和进展过程中, 没有特定于骨髓细胞增生异常变化的表型标记的情况下, 近年来在评估成熟途径 (表达改变) 的基础上, 提出了一种新的方法。在生产成熟髓细胞的过程中, 或在骨髓 (bm) 细胞隔间 1,2内不同细胞类型的异常分布的髓抗原.
本文提出了一种新的方法, 标准化应用 mfc, 以检测与骨髓增生异常综合征 (mds) 或其他骨髓血液学疾病有关的 bm 骨髓细胞隔间的增生异常变化。本研究还显示了使用成熟数据库进行 mfc 数据分析的效用。
样品制备程序的标准化、数据采集和使用数据库进行分析, 将有助于识别与 bm 骨髓细胞增生异常变化有关的最相关的表型异常。因此, 在开发可用于后续分析的分析策略时, 需要基于标记良好且公认的格式 (自动人口分离器 (aps) 图、直方图和点图) 进行统计选择的子集轮。mds 中强健表型异常的发现将在有或没有最小形态发育不良和没有细胞遗传学异常的病例中缓解诊断。识别允许减少免疫表型面板的歧视性参数可以简化目前的分数2, 使其在临床病理实验室的适用性。
这种方法限制了细胞学数据的主观解释, 正如 mds 诊断3中所表明的那样。此步骤是开发用于处理和分析流数据的自动化工具的先决条件 4。
mds 包括一组异质性克隆造血干细胞 (hsc) 疾病, 其中牙代突变与特定的表观修饰语结合生成 mds 苯型。现在人们知道, 随着 hsc 突变, 其他机制也参与了 mds 病理生理学, 如异常免疫介导的炎症和恶性 hsc 与 bm 基质微环境之间的相互作用。然而, 对这些机制的了解仍然很少。mds 广泛的临床和生物学异质性使得诊断和选择最佳治疗方法成为一个挑战。在过去的十年里, 多项研究表明, mfc 在检测发育不良2方面往往比形态学更敏感, 但技术和经济上的限制使这一技术难以标准化, 其结果往往取决于口译人员的经验3。此外, 目前尚不清楚 mfc 如何在有或没有最小形态发育不良的情况下, 在没有细胞遗传学异常的情况下, 或在其他非克隆 bm 的低爆炸计数的低细胞 mds 等边缘病例中, 将天平向 mds 倾斜骨髓衰竭 (即再生障碍性贫血) 等疾病。在爆炸过多的情况下, 也很难区分 mds 的边缘病例和急性髓系白血病 (aml)。由于所有这些原因, 临床指南没有将 mfc 测试集成到 mds 最终诊断中。2011年, 美国国家综合癌症网络 (nccn) 推荐 mfc 用于估计 cd34+ 细胞的百分比, 检测阵发性夜间血红蛋白尿克隆, 以及细胞下 mds 5 中是否存在细胞毒性 t 细胞克隆.这两种情况后两种情况也涉及治疗目标, 因为临床数据显示, 这些患者对免疫抑制治疗有很好的反应.2017年 nccn 指南引用了国际工作组 (iwg) 的建议, 将 mfc 异常免疫表型检测列为 mds 诊断的共同标准, 但没有制定任何规格6。此外, 最近公布的世卫组织分类规定, 仅有 mfc 发现不足以在没有结论性形态和/或细胞遗传学数据的情况下确定 mds 的初步诊断7。然而, mfc 可以作为一个额外的测试, 显示骨髓细胞成熟模式的失调, 并量化患者在疾病过程中的特定时间 "与正常的距离"。
该方法适用于有兴趣用 mfc 免疫表型评估 bm 骨髓细胞发育不良的临床实验室, 以完善 mds 或其他骨髓异常异常疾病的诊断。
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以下议定书已得到法国圣艾蒂安大学医院 "独立道德委员会" (独立道德委员会) 的批准。
1. 细胞仪设置
注: 细胞仪设置是根据法国流量建议, 根据欧洲流程序 "欧洲流标准操作协议 (sop) 的仪器设置和补偿 (https://www.euroflow.org/usr/pub/protocols.php)。
2. bm 样品制备
注: 在染色程序之前执行细胞清洗协议。
3. 数据采集
4. 数据分析
注: 为了构建正常的 bm 数据库, 使用的文件来自健康的捐献者和个人没有任何证据证明造血疾病如下11个从18个文件的中性粒细胞 _ nm 数据库, 10个从18个文件的 mon细胞 _ nm 数据库和14个从18个数据库的文件。如 "代表结果" 部分所示, 丢弃的文件显示了各种技术问题。这些文件使用英菲尼迪软件 (材料表) 进行了单独分析, 符合图 1a(1-3)所描述的中性粒细胞谱系的各种策略 (中性粒细胞 _ maturation. inp),图2 a用于单核细胞谱系 (单核细胞谱), 图3A(1-2)用于红血球谱系 (单核细胞谱系)。
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研究包括在 k-edta 抗凝剂中采集的 54个 bm 样品。在没有任何患者信息的情况下, 对 mfc 数据进行了分析。回顾性研究显示, bm 样本来自7个健康捐献者 (5名男性和2名女性, 中位年龄为 47.4 [35-48], 11 人没有造血疾病的证据 (8名男性和3名女性, 中位年龄为 57.9 [35-72]) 和36例。 病理情况: 贫血和肌酐水平低1例, 贫血3例, 肌酐水平高, 贫血8例, 维生素 b12 缺乏引起贫血1例, 贫血4例, 贫血±其他细胞增生症肝损害, 自身免疫性溶血性贫血3例, 特发性血小板减少性紫癜5例, 巨噬细胞活化综合征1例, 淋巴瘤治疗后完全缓解3例 (最小残留疾病 & lt; 0.01%), 7 例携带血液学疾病 (4 mds、1 aml、1例慢性粒细胞白血病和1例骨髓增生性综合征 jak2 阳性)。最后一类包括18名男性和18名女性, 平均年龄为60.3 岁 [17-100 岁]。所有样本均来自白种人。通过建立数据库, 可以查明和解决与样品制备和采集有关的若干问题。在我们的例子中, 最终的数据库包括...
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bm 吸气的质量可能会对最终结果产生影响。bm 吸气的血液稀释会由于没有祖细胞或前体细胞而扭曲不同成熟阶段细胞的分布。在流式细胞仪分析中, 采用大容量裂解法可能有助于 bm 吸气液的正常化, 用于血液稀释。此外, 流动细胞学评价 bm 骨髓发育不良的关键步骤是样品处理和染色、数据采集和解释2,3。在 bm 收获后, 样品处理和染色应进行至72小时。数据应获得, 最好是染色后立即或将样品存放在 4°c, 保护不受光线照射, 不超过 1小时, 直到测量在流式细胞仪中。数据库引导解释避免了对 bm 骨髓细胞成熟的主观评价。
抗体组合和样品制备大致符合 euroflow 程序9,10。与 euroflow 面板相比的区别在于, 除 cd300e 外, 所有抗体都由 bd 生物科学提供。流式细胞术标准化使获得具有高度可重复性...
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提交人声明, 他们没有相互竞争的经济利益。圣艾蒂安大学医院血液学实验室流细胞计系是欧洲流联合会的成员。
本研究中使用的抗体由 bd 生物科学提供。作者感谢他们的同事, 来自法国圣艾蒂安大学医院分子生物学系血液学实验室的 pascale flandrin-gresta 博士, 他为解释 ngs 数据提供了专门知识。mds 案例。作者感谢临床医生血液学家对这项研究的兴趣和参与, 并感谢患者和健康捐献者同意参与这项研究。作者还要感谢 "les amis de rémi" 基金会为出版提供的财政支持。
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| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| BD FACSCanto II 流式细胞仪 | BD Biosciences，CA，USA | SN： | 3 激光器，4-2-2 配置，滤光片和镜子详细信息： https://www.bdbiosciences.com/documents/BD_FACSCanto_II_FilterGuide.pdf |
| Awel C48-R 离心机 | AWEL Industries，FR | SN：910120016;型号：320002001 | 低速离心机;容量 60 个 FACS 管 |
| 10&微量的移液器;L 和 200µL | |||
| 巴斯德移液器 | |||
| 15 mL Falcon 管 | |||
| 用于 FACS | |||
| 小鼠抗人 HLA-DR | BD Biosciences， CA， USA | 655874 | 克隆 L243 小鼠 BALB/c IgG2a 和 kappa; 荧光染料 Horizon V450 （Ex 最大 404 nm/ Em 最大 448 nm） |
| 小鼠抗人 CD45BD | Biosciences，CA，USA | 560777 | 克隆 HI30 小鼠 IgG1 和 kappa; 荧光染料 Horizon V500（Ex 最大 415 nm/ Em 最大 500 nm） |
| 小鼠抗人 CD16BD | Biosciences，CA，USA | 656146 | 克隆 CLB/fcGran1 小鼠 BALB/c IgG2a，κ 荧光染料 FITC （激发最大 494 nm/ 发射波长最大 520 nm） |
| 小鼠抗人 CD13BD | Biosciences，美国加利福尼亚州 347406 | 克隆 L138 小鼠 BALB/c X C57BL/6 IgG1，κ 荧光染料 PE （Ex 最大 496 nm/ Em 最大 578 nm） | |
| 小鼠抗人 CD34BD | Biosciences，CA，USA | 347222 | 克隆 8G12 小鼠 BALB/c IgG1，κ 荧光染料 PerCP-Cy5.5 （激发最大 482 nm/ Em 最大 678 nm） |
| 小鼠抗人 CD117 | BD Biosciences，美国加利福尼亚州339217 | 克隆 104D2 小鼠 BALB/c IgG1 荧光染料 PE-Cy7 （激发最大 496 nm/ Em 最大 785 nm） | |
| 小鼠抗人 CD11b | BD Biosciences， 美国加利福尼亚州 | 333143 克隆 | D12 小鼠 BALB/c IgG2a，κ D12，荧光染料 APC （Ex max 650 nm/ Em max 660nm |
| 小鼠抗人 CD10 | BD Biosciences，CA，USA | 646783 | 克隆 HI10A 小鼠 BALB/c IgG1，κ 荧光染料 APC-H7 （Ex 最大 496 nm/ Em 最大 785nm） |
| 小鼠抗人 CD35BD | Biosciences，CA，USA | 555452 | 克隆 E11 小鼠 IgG1，κ 荧光染料 FITC （激发最大 494 nm/ 发射最大 520 nm） |
| 小鼠抗人 CD64BD | Biosciences，CA，USA | 644385 | 克隆 10.1 小鼠 BALB/c IgG1，κ 荧光染料 PE （激发最大 496 nm/ Em 最大 578 nm） |
| 小鼠抗人 CD300e | 免疫步骤 | IREM2A-T100 | 克隆 UP-H2 小鼠 BALB/c IgG1，k 荧光染料 APCC （激发最大 496 nm/ Em 最大 578 nm） |
| 小鼠抗人 CD14BD | Biosciences， CA，美国 | 641394 | 克隆 MoP9 小鼠 BALB/c IgG2b，κ 荧光染料 APC-H7 （Ex max 496 nm/ Em max 785nm） |
| 小鼠抗人 CD36BD | Biosciences，CA，USA | 656151 | 克隆 CLB-IVC7 小鼠 IgG1，κ 荧光染料 FITC （Ex max 494 nm/ Em max 520 nm） |
| 小鼠抗人 CD105BD | Biosciences，CA，USA | 560839 | 克隆 266 小鼠 BALB/c IgG1，κ 荧光染料 PE （激发最大 496 nm/ 发射波长最大 578 nm） |
| 小鼠抗人 CD33 | 345800 | 克隆 P67.6 小鼠 BALB/c IgG1，κ 荧光染料 APCC （激发最大 496 nm/ 发射最大 578 nm） | |
| 小鼠抗人 CD71 | BD Biosciences，美国加利福尼亚州 | 655408 | 克隆 M-A712 小鼠 BALB/c IgG2a，κ 荧光染料 APC-H7 （激发最大 496 nm/ 发射波长 785 nm） |
| 裂解液 10x 浓缩液 （IVD） | BD Biosciences，CA，美国 | 349202 | |
| FACSFlow 鞘液 | BD Biosciences，CA，USA | 342003 | |
| FACSDiva CS&T IVD 微珠 | BD Biosciences，CA，USA | 656046 | |
| 彩虹校准颗粒，8 个峰 | Cytognos，西班牙萨拉曼卡 | SPH-RCP-30-5A | 批次 EAB01、EAC01、EAD05、EAE01、EAF01、EAG01、EAH01、EAI01、EAJ01、EAK01 |
| 补偿颗粒 多色 CompBeads（CE/IVD） | BD Biosciences，CA，USA | 参考 #51-90-9001229 + #51-90-9001291 | |
| Diva 软件版本 6.1.2 和 6.1.3 | BD Biosciences，美国 | ||
| 盐缓冲盐水片 | R&D Systems，美国明尼阿波利斯 | 5564 | |
| 牛血清白蛋白 （BSA） | Sigma-Aldrich，法国 | A9647 | |
| 氮化钠 99% | Sigma-Aldrich，法国 | 199931 | |
| Infinicyt 软件版本 1.8.0.e | Cytognos，萨拉曼卡，西班牙 |
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