在缺乏形态学标准或细胞遗传学信息不明确的情况下，骨髓增生异常综合征（MDS）的诊断较为困难。多参数流式细胞术（MFC）可能有助于优化MDS的诊断流程。为了在临床实践中具有应用价值，MFC分析必须基于具备足够特异性和敏感性的参数，且不同操作者之间的数据应具有可重复性。
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摘要
摘要
法国细胞计量学会（AFC）内成立的一个工作组致力于在法国范围内统一多参数流式细胞术（MFC）在髓系疾病诊断中的应用。本文所述方案于2013年9月至2015年11月期间在法国六家诊断实验室（圣艾蒂安、格勒诺布尔、克莱蒙费朗、尼斯、里尔大学医院以及马赛的帕奥利-卡尔梅特研究所）达成共识并实施，实现了骨髓样本制备和数据采集的标准化。研究基于“健康”供体个体（无任何造血系统疾病证据的个体）的骨髓样本，建立了中性粒细胞、单核细胞和红细胞系的三个成熟数据库。针对每种髓系细胞的稳健分析方法应适用于常规诊断应用。新病例可采用相同方法进行分析，并与正常数据库进行比较，从而识别定量和定性的表型异常；与正常骨髓样本数据相比，偏差超过2SD的异常应视为提示病理状态。该方法的主要局限性在于，目前临床诊断中使用的基于杂交瘤技术制备的单克隆抗体所获得的数据存在较高的变异性。制定数据采集的技术验证标准可能有助于提高MFC在骨髓增生异常综合征（MDS）诊断中的实用性。这些标准的建立需基于数据库的分析。该方法的重要优势之一是减少了分析人员在数据解读中的主观性。
引言
由于目前尚无针对骨髓增生异常综合征（MDS）发生和进展过程中髓系细胞发育异常改变的特异性表型标志物，近年来提出了一种新方法，该方法基于评估髓系细胞成熟途径（成熟髓系细胞生成过程中髓系抗原表达异常）或骨髓（BM）细胞区室中不同类型细胞的异常分布1,2。
本文介绍了一种标准化应用多参数流式细胞术（MFC）的新方法，用于检测与骨髓增生异常综合征（MDS）或其他髓系血液病相关的骨髓中髓系细胞区室的发育异常改变。本研究还展示了在MFC数据分析中使用成熟度数据库的实用性。
通过使用数据库对样本制备流程、数据采集和分析进行标准化，可识别与骨髓髓系细胞发育异常改变相关的最重要表型异常。因此，需要基于明确标记且广泛认可的格式（如自动群体分离器（APS）图、直方图和点图）进行统计学筛选的亚群，以建立可用于后续分析轮次的分析策略。在骨髓增生异常综合征（MDS）中发现稳定的表型异常，将有助于对存在或不存在轻微形态学发育异常以及无细胞遗传学异常的病例进行诊断。识别具有区分能力的参数，以减少免疫表型检测组合的数量，可能简化现有的评分系统2，使其更适用于临床病理 实验室。
该方法限制了流式细胞术数据的主观解读，而主观解读已....
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方案
以下方案已获得法国圣艾蒂安大学医院东南1号独立伦理委员会（"Comité de Protection des Personnes"）的批准。
1. 流式细胞仪设置
注意：流式细胞仪的设置根据法国流式细胞术推荐方案进行，并遵循 EuroFlow 操作规程"《EuroFlow 仪器设置与补偿标准操作程序（SOP）》（https://www.euroflow.org/usr/pub/protocols.php）。
- 每月仪器设置
- 打开流式细胞仪。确保所有液体液位正常，打开 Diva 6.1.3 软件。执行流体启动：在菜单栏中选择 “Cytometer | Fluidics Startup”。提示时点击 “OK”。让仪器预热至少 30 分钟。
- 性能检查 - CST 微球
注意：此步骤需准备 12 个 75 mm 聚苯乙烯管、CST 微球和鞘液（参见材料表）。- 标记一个 12 × 75 mm2 聚苯乙烯管为“CST”。通过轻轻倒置或极轻柔地涡旋混匀提供的微球小瓶。向标记好的管中加入 0.35 mL 鞘液和 1 滴 CST 微球。轻轻涡旋混匀....
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结果
本研究纳入了使用K-EDTA抗凝剂采集的54份骨髓样本。多参数流式细胞术（MFC）数据在完全不知晓患者信息的情况下进行分析。回顾性研究显示，这些骨髓样本来源于7名健康供者（5名男性和2名女性，中位年龄为47.4岁[35–48岁]）、11名无造血系统疾病证据的个体（8名男性和3名女性，中位年龄为57.9岁[35–72岁]），以及36例患有各种病理状况的患者：1例贫血伴肌酐水平降低，3例贫血伴肌酐水平升高，8例炎症性贫血，1例因维生素B12缺乏引起的贫血，4例由肝损伤导致的贫血±其他血细胞减少，3例自身免疫性溶血性贫血，5例特发性血小板减少性紫癜，1例巨噬细胞活化综合征，3例淋巴瘤治疗后完全缓解（微小残留病灶 < 0.01%），以及7例伴有血液系统疾病的患者（4例骨髓增生异常综合征[MDS]，1例急性髓系白血病[AML]，1例慢性粒单核细胞白血病，1例JAK2阳性骨髓增殖性综合征）。最后一类包括18名男性和18名女性，平均年龄为60.3岁[17–100岁]。所有样本均来自高加索人种个体。构建数据库有助于识别并纠正与样本制备和数据采集相关的多个问题。.......
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讨论
骨髓穿刺物的质量可能影响最终结果。骨髓穿刺物的血液稀释可能会因祖细胞或前体细胞的缺失，而导致不同成熟阶段细胞分布的失真。采用整体裂解法可能有助于在流式细胞术分析中校正骨髓穿刺物的血液稀释效应。此外，通过流式细胞术评估骨髓髓系发育异常的关键步骤包括样本处理与染色、数据采集和结果解读2,3。样本处理与染色应在骨髓采集后72小时内完成。数据采集应尽可能在染色后立即进行，或在4 °C避光保存不超过1小时后尽快上机检测。基于数据库指导的解读可避免对骨髓髓系细胞成熟过程的主观判断。
抗体组合和样本制备基本遵循EuroFlow方案9,10。与EuroFlow抗体组合的不同之处在于，除CD300e外，所有抗体均由BD Bioscience提供。流式细胞术的标准化使得获得高度可重复的数据成为可能11，但这需要加入致力于相.......
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披露
作者声明不存在任何竞争性财务利益。圣艾蒂安大学医院血液学实验室流式细胞术部门 是EuroFlow联盟的成员。
致谢
本研究中使用的抗体由BD Biosciences提供。作者感谢法国圣艾蒂安大学医院分子生物学与血液学实验室的同事帕斯卡·弗兰德兰-格雷斯塔博士（Dr. Pascale Flandrin-Gresta）为第二例骨髓增生异常综合征（MDS）病例的二代测序（NGS）数据解读提供的专业支持。作者感谢临床血液科医生对本研究的关注与参与，也感谢患者及健康供者同意参与本研究。作者同时感谢“莱斯·阿米·德·雷米”基金会（"Les Amis de Rémi" Foundation）为本研究论文发表提供的经费支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| BD FACSCanto II 流式细胞仪 | BD Biosciences, CA, 美国 | 序列号: V33896301336 | 3 激光，4-2-2 配置；滤光片和反射镜详情：https://www.bdbiosciences.com/documents/BD_FACSCanto_II_FilterGuide.pdf |
| Awel C48-R 离心机 | AWEL Industries, 法国 | 序列号: 910120016；型号: 320002001 | 低速离心机；容量为 60 支 FACS 管 |
| 10µL 和 200µL 移液器 | |||
| 巴斯德移液管 | |||
| 15 mL Falcon 管 | |||
| FACS 用聚丙烯管 | |||
| 小鼠抗人 HLA-DR | BD Biosciences, CA, 美国 | 655874 | 克隆号 L243 小鼠 BALB/c IgG2a, κ 荧光染料 Horizon V450 （激发最大值 404 nm/ 发射最大值 448 nm） |
| 小鼠抗人 CD45 | BD Biosciences, CA, 美国 | 560777 | 克隆号 HI30 小鼠 IgG1, κ 荧光染料 Horizon V500（激发最大值 415 nm/ 发射最大值 500 nm） |
| 小鼠抗人 CD16 | BD Biosciences, CA, 美国 | 656146 | 克隆号 CLB/fcGran1 小鼠 BALB/c IgG2a, κ 荧光染料 FITC （激发最大值 494 nm/ 发射最大值 520 nm） |
| 小鼠抗人 CD13 | BD Biosciences, CA, 美国 | 347406 | 克隆号 L138 小鼠 BALB/c × C57BL/6 IgG1, κ 荧光染料 PE （激发最大值 496 nm/ 发射最大值 578 nm） |
| 小鼠抗人 CD34 | BD Biosciences, CA, 美国 | 347222 | 克隆号 8G12 小鼠 BALB/c IgG1, κ 荧光染料 PerCP-Cy5.5 （激发最大值 482 nm/ 发射最大值 678 nm） |
| 小鼠抗人 CD117 | BD Biosciences, CA, 美国 | 339217 | 克隆号 104D2 小鼠 BALB/c IgG1 荧光染料 PE-Cy7 （激发最大值 496 nm/ 发射最大值 785 nm） |
| 小鼠抗人 CD11b | BD Biosciences, CA, 美国 | 333143 | 克隆号 D12 小鼠 BALB/c IgG2a, κ D12, 荧光染料 APC （激发最大值 650 nm/ 发射最大值 660 nm） |
| 小鼠抗人 CD10 | BD Biosciences, CA, 美国 | 646783 | 克隆号 HI10A 小鼠 BALB/c IgG1, κ 荧光染料 APC-H7 （激发最大值 496 nm/ 发射最大值 785 nm） |
| 小鼠抗人 CD35 | BD Biosciences, CA, 美国 | 555452 | 克隆号 E11 小鼠 IgG1, κ 荧光染料 FITC （激发最大值 494 nm/ 发射最大值 520 nm） |
| 小鼠抗人 CD64 | BD Biosciences, CA, 美国 | 644385 | 克隆号 10.1 小鼠 BALB/c IgG1, κ 荧光染料 PE （激发最大值 496 nm/ 发射最大值 578 nm） |
| 小鼠抗人 CD300e | Immunostep | IREM2A-T100 | 克隆号 UP-H2 小鼠 BALB/c IgG1, k 荧光染料 APC （激发最大值 496 nm/ 发射最大值 578 nm） |
| 小鼠抗人 CD14 | BD Biosciences, CA, 美国 | 641394 | 克隆号 MoP9 小鼠 BALB/c IgG2b, κ 荧光染料 APC-H7 （激发最大值 496 nm/ 发射最大值 785 nm） |
| 小鼠抗人 CD36 | BD Biosciences, CA, 美国 | 656151 | 克隆号 CLB-IVC7 小鼠 IgG1, κ 荧光染料 FITC （激发最大值 494 nm/ 发射最大值 520 nm） |
| 小鼠抗人 CD105 | BD Biosciences, CA, 美国 | 560839 | 克隆号 266 小鼠 BALB/c IgG1, κ 荧光染料 PE （激发最大值 496 nm/ 发射最大值 578 nm） |
| 小鼠抗人 CD33 | 345800 | 克隆号 P67.6 小鼠 BALB/c IgG1, κ 荧光染料 APC （激发最大值 496 nm/ 发射最大值 578 nm） | |
| 小鼠抗人 CD71 | BD Biosciences, CA, 美国 | 655408 | 克隆号 M-A712 小鼠 BALB/c IgG2a, κ 荧光染料 APC-H7 （激发最大值 496 nm/ 发射最大值 785 nm） |
| 溶血液 10 倍浓缩液（IVD） | BD Biosciences, CA, 美国 | 349202 | |
| FACSFlow 鞘液 | BD Biosciences, CA, 美国 | 342003 | |
| FACSDiva CS&T IVD 微球 | BD Biosciences, CA, 美国 | 656046 | |
| RAINBOW 校准微粒，8 峰 | Cytognos, 萨拉曼卡, 西班牙 | SPH-RCP-30-5A | 批号 EAB01, EAC01, EAD05, EAE01, EAF01, EAG01, EAH01, EAI01, EAJ01, EAK01 |
| 补偿微粒 多色 CompBeads（CE/IVD） | BD Biosciences, CA, 美国 | 货号 #51-90-9001229 + #51-90-9001291 | |
| Diva 软件版本 6.1.2 和 6.1.3 | BD Biosciences, CA, 美国 | ||
| 磷酸盐缓冲液片剂 | R&D Systems, 明尼阿波利斯, 美国 | 5564 | |
| 牛血清白蛋白 （BSA） | Sigma-Aldrich, 法国 | A9647 | |
| 叠氮化钠 99% | Sigma-Aldrich, 法国 | 199931 | |
| Infinicyt 软件版本 1.8.0.e | Cytognos, 萨拉曼卡, 西班牙 |
参考文献
- Orfao, A., Ortuño, F., de Santiago, M., Lopez, A., San Miguel, J. Immunophenotyping of Acute Leukemias and Myelodysplastic Syndromes. Cytometry Part A. 58, 62-71 (2004).
- Porwit, A., et al. Revisiting guidelines for integration of flow cytometry results in the WHO classification of Myelodysplastic Syndromes - proposal from the International/European LeukemiaNet Working Group for Flow....
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