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方法文章

基于数据库指导的流式细胞术评估骨髓髓系细胞成熟度

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DOI：

10.3791/57867

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2018年11月3日

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1Department of Hematology, University Hospital of Saint-Etienne, 2Department of Immunology, University Hospital of Grenoble-Alpes, 3Department Hematology, University Hospital of Clermont-Ferrand, 4Department of Immunology, University Hospital of Nice, 5Department of Biopathology, Institute Paoli-Calmettes, 6Department of Hematology, University Hospital of Lille

本文内容

摘要

在缺乏形态学标准或细胞遗传学信息不明确的情况下，骨髓增生异常综合征（MDS）的诊断较为困难。多参数流式细胞术（MFC）可能有助于优化MDS的诊断流程。为了在临床实践中具有应用价值，MFC分析必须基于具备足够特异性和敏感性的参数，且不同操作者之间的数据应具有可重复性。

摘要

法国细胞计量学会（AFC）内成立的一个工作组致力于在法国范围内统一多参数流式细胞术（MFC）在髓系疾病诊断中的应用。本文所述方案于2013年9月至2015年11月期间在法国六家诊断实验室（圣艾蒂安、格勒诺布尔、克莱蒙费朗、尼斯、里尔大学医院以及马赛的帕奥利-卡尔梅特研究所）达成共识并实施，实现了骨髓样本制备和数据采集的标准化。研究基于“健康”供体个体（无任何造血系统疾病证据的个体）的骨髓样本，建立了中性粒细胞、单核细胞和红细胞系的三个成熟数据库。针对每种髓系细胞的稳健分析方法应适用于常规诊断应用。新病例可采用相同方法进行分析，并与正常数据库进行比较，从而识别定量和定性的表型异常；与正常骨髓样本数据相比，偏差超过2SD的异常应视为提示病理状态。该方法的主要局限性在于，目前临床诊断中使用的基于杂交瘤技术制备的单克隆抗体所获得的数据存在较高的变异性。制定数据采集的技术验证标准可能有助于提高MFC在骨髓增生异常综合征（MDS）诊断中的实用性。这些标准的建立需基于数据库的分析。该方法的重要优势之一是减少了分析人员在数据解读中的主观性。

引言

由于目前尚无针对骨髓增生异常综合征（MDS）发生和进展过程中髓系细胞发育异常改变的特异性表型标志物，近年来提出了一种新方法，该方法基于评估髓系细胞成熟途径（成熟髓系细胞生成过程中髓系抗原表达异常）或骨髓（BM）细胞区室中不同类型细胞的异常分布1,2。

本文介绍了一种标准化应用多参数流式细胞术（MFC）的新方法，用于检测与骨髓增生异常综合征（MDS）或其他髓系血液病相关的骨髓中髓系细胞区室的发育异常改变。本研究还展示了在MFC数据分析中使用成熟度数据库的实用性。

通过使用数据库对样本制备流程、数据采集和分析进行标准化，可识别与骨髓髓系细胞发育异常改变相关的最重要表型异常。因此，需要基于明确标记且广泛认可的格式（如自动群体分离器（APS）图、直方图和点图）进行统计学筛选的亚群，以建立可用于后续分析轮次的分析策略。在骨髓增生异常综合征（MDS）中发现稳定的表型异常，将有助于对存在或不存在轻微形态学发育异常以及无细胞遗传学异常的病例进行诊断。识别具有区分能力的参数，以减少免疫表型检测组合的数量，可能简化现有的评分系统2，使其更适用于临床病理 实验室。

该方法限制了流式细胞术数据的主观解读，而主观解读已在骨髓增生异常综合征（MDS）诊断中被指出存在问题3。此步骤是开发用于处理和分析流式数据的自动化工具的前提条件4。

骨髓增生异常综合征（MDS）是一组异质性的克隆性造血干细胞（HSC）疾病，其中剪接体突变与特定的表观遗传修饰因子协同作用，导致MDS表型的产生。目前研究已知，除了HSC突变外，MDS的发病机制还涉及其他因素，例如异常的免疫介导性炎症以及恶性HSC与骨髓（BM）基质微环境之间的相互作用。然而，这些机制尚未被充分阐明。MDS在临床和生物学上的高度异质性使得其诊断及最佳治疗方案的选择面临挑战。在过去十年中，多项研究表明，多参数流式细胞术（MFC）在检测细胞发育异常方面通常比形态学分析更为敏感2，但由于技术和经济上的限制，该技术难以实现标准化，其结果往往依赖于操作者的解读经验3。此外，在存在或不存在轻微形态学发育异常、缺乏细胞遗传学异常的情况下，或在低增生性MDS等临界病例中（例如原始细胞比例较低，需与其他非克隆性骨髓疾病如骨髓衰竭（i.e., 再生障碍性贫血）相鉴别时），MFC如何帮助明确MDS诊断仍不明确。同时，将伴有原始细胞增多的MDS临界病例与急性髓系白血病（AML）相鉴别仍然困难。由于上述原因，目前的临床指南尚未将MFC检测纳入MDS的最终诊断标准。2011年，美国国家综合癌症网络（NCCN）建议将MFC用于评估CD34+细胞百分比、检测阵发性睡眠性血红蛋白尿克隆以及在低增生性MDS中识别细胞毒性T细胞克隆5。后两种情况还具有治疗指导意义，因为临床数据表明，这类患者对免疫抑制治疗反应良好6。2017年NCCN指南引用国际工作组（IWG）的建议，将MFC检测发现的异常免疫表型列为MDS诊断的辅助标准之一，但未作具体说明6。此外，最新发布的WHO分类指出，在缺乏明确的形态学和/或细胞遗传学证据时，仅凭MFC结果不足以确立MDS的初步诊断7。然而，MFC可作为一项辅助检测手段，用于揭示髓系细胞成熟模式的失调，并量化患者在疾病进程中某一特定时间点与正常状态之间的“偏离程度”""。

该方法适用于临床实验室，旨在通过多色流式细胞术免疫表型分析对骨髓髓系细胞中的发育异常进行评估，以优化骨髓增生异常综合征（MDS）或其他伴有发育异常的髓系疾病的诊断。

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方案

以下方案已获得法国圣艾蒂安大学医院东南1号独立伦理委员会（"Comité de Protection des Personnes"）的批准。

1. 流式细胞仪设置

注意：流式细胞仪的设置根据法国流式细胞术推荐方案进行，并遵循 EuroFlow 操作规程"《EuroFlow 仪器设置与补偿标准操作程序（SOP）》（https://www.euroflow.org/usr/pub/protocols.php）。

  1. 每月仪器设置
    1. 打开流式细胞仪。确保所有液体液位正常，打开 Diva 6.1.3 软件。执行流体启动：在菜单栏中选择 “Cytometer | Fluidics Startup”。提示时点击 “OK”。让仪器预热至少 30 分钟。
    2. 性能检查 - CST 微球
      注意：此步骤需准备 12 个 75 mm 聚苯乙烯管、CST 微球和鞘液（参见材料表）。
      1. 标记一个 12 × 75 mm2 聚苯乙烯管为“CST”。通过轻轻倒置或极轻柔地涡旋混匀提供的微球小瓶。向标记好的管中加入 0.35 mL 鞘液和 1 滴 CST 微球。轻轻涡旋混匀后立即进行上样采集。若不立即采集，可将该管在避光条件下于 2–25 °C 保存最多 8 小时。
      2. 执行性能检查：在菜单栏中选择 “Cytometer | CST”。
      3. 在 CST 模块的 “Setup” 选项卡中：确认 Canto II 为默认的 4-2H-2V 配置，并确认该配置下已使用当前批次的 CST 微球创建了基线。若无基线，请参考 CST 微球使用说明书（IFU）。确认该基线未过期：在 “Setup Control” 下拉菜单中选择 “Check Performance”。
      4. 勾选 “Load tube manually” 并点击 “Run”。确认显示的批号。轻轻涡旋上述已稀释的微球，当提示时加载稀释后的微球并点击 “OK”。
      5. 性能检查完成后，确认流式细胞仪性能通过。点击 “View Report”。若结果未通过，请重新运行性能检查。将报告以 PDF 格式保存，并标注性能跟踪报告日期。
    3. 使用彩虹微球（Rainbow Beads）（材料表）调整 “荧光 PMT 电压”。
      ​注意：目标值在 Euroflow 标准操作程序（SOP）《"20180302_7th_Peak_Target_Values_Rainbow_Beads"》中有明确规定。该 SOP 可在 Euroflow 网站（www.euroflow.org；公共区域；Protocols 标签页）获取。
      1. 通过 “Monthly Instrument Setup Date | Specimen” 创建新实验。
      2. 选择与相关试管对应的光学参数和荧光染料（FITC、PE、PerCPCy5.5、PE-Cy7、APC、APC-H7、V450、V500），并设置所需的采集参数（Log、A、H 和/或 W）。应用当前 CST 设置（右键单击实验中的 “Cytometer Settings”）。将 FSC 参数的阈值设为 10,000。
      3. 在仪器上设置荧光 PMT 电压以达到目标 MFI 值时，关闭补偿；为此，请进入 “Inspector”，导航至 “Compensation” 选项卡。取消勾选 “Enable Compensation” 以禁用补偿。
      4. 创建一个名为 “Target MFI” 的工作表，包含所有必要的双参数散点图（n = 2；FSC 对 SSC、FITC 对 PE）、直方图（n = 8；每个荧光检测器一个直方图）以及显示各荧光通道参考峰的统计值（MFI 和 CV）。
      5. 将 1 滴 8 峰彩虹微球校准颗粒稀释于 1 mL 去离子水或蒸馏水中，使用前涡旋混匀。以 “LOW” 流速采集 8 峰彩虹微球溶液但不记录数据。若不立即采集，可将该管在避光条件下于 2–25 ˚C 保存最多 8 小时。
      6. 在 FSC 对 SSC 的双参数散点图中圈选单颗粒微球 “Population P1”，并在 FITC 对 PE 的双参数散点图中圈选第 8 或第 7 峰（最亮峰或其下一级峰，具体依据 Euroflow 文件《"20180302_7th_Peak_Target_Values_Rainbow_Beads"》中的规定），并将此门命名为 Population P2。
      7. 继续采集 8 峰彩虹微球悬浮液，并根据 Euroflow 文件《"20180302_7th_Peak_Target_Values_Rainbow_Beads"》调整所有荧光通道的 PMT 电压，以达到目标 MFI 值。
      8. 当第 8 或第 7 峰的目标 MFI 值达到后，记录实现的目标 MFI 值及对应的最终 PMT 值。采集 5,000 个事件并记录数据。
        注意：这些 PMT 值必须在后续步骤 1.2.3（性能检查 - 使用彩虹微球确认 PMT 值）中使用。
      9. 通过截取包含 “Target MFI” 工作表和仪器设置的屏幕截图记录这些值，并保存为 .jpg 图片。
        注意：创建 "New" 管时，PMT 值有时会意外变化。因此，必须双重检查 PMT 值。每次均需将 PMT 值与您的记录进行比对，确认 “Target MFI” 值和 PMT 值正确无误！
      10. 保存 “Application Settings”。在浏览器中右键单击 “Cytometer Settings”。从下拉菜单中选择 “Application Settings” 并保存。点击 “OK”。若提示，点击“是”以保留阈值。
        注意：使用默认名称保存 Application Settings。切勿重命名设置。
    4. 使用裂解洗涤血液（LWB）调整 “FSC” 和 “SSC 电压”。
      ​注意：此步骤需要 50 µL 健康志愿者外周血（PB）样本、裂解液（材料表）和洗涤缓冲液。
      1. 将 50 µL PB 加入试管中。加入 2 mL 新鲜稀释的裂解液。轻轻混匀，室温孵育 10 分钟。
      2. 以 540 × g 离心 5 分钟。
      3. 吸除上清液，勿扰动细胞沉淀，每管留约 50 µL 残余体积。轻轻混匀，加入 2 mL 过滤洗涤液。
      4. 以 540 × g 离心 5 分钟。
      5. 重复步骤 1.1.4.3–1.1.4.4 一次。
      6. 加入 250 µL 过滤洗涤缓冲液，轻轻混匀。
      7. 在为彩虹微球采集创建的实验中，新建一个 “Specimen | New Worksheet”：绘制双参数 SSC-A / FSC-A 图。
      8. 采集细胞，在 FSC 对 SSC 的双参数散点图中圈选淋巴细胞，并调整 FSC 和 SSC 电压，使圈选的淋巴细胞群体达到以下平均目标值：FSC：55,000（范围 50,000–60,000）；SSC：13,000（范围 11,000–15,000）。
      9. 采集并记录约 10,000 个事件的数据。验证圈选淋巴细胞的平均 FSC 和 SSC 目标值。必要时重新调整 FSC 和 SSC 电压。
      10. 截屏并保存获得的目标通道值打印结果。
    5. 荧光补偿设置。
      注意：单染色补偿对照必须在目标 MFI 设置和 FSC/SSC 设置建立后进行。此步骤需要健康志愿者的 PB、补偿微粒（材料表）、裂解液和洗涤缓冲液。用于建立荧光补偿矩阵的荧光染料偶联抗体试剂及其参考群体列于表 1中。
      1. 为每种用于建立荧光补偿的试剂（FITC、PE、PerCPCy5.5、APC、V450、V500、PECy7 - CD117、APC-H7 - CD10、APC-H7 - CD14 和 APC-H7 - CD71）标记一个试管，并另设一个 "空白/未染色" 试管。
      2. 向每个试管中加入 50 µL PB，或在上述表 1中指定的补偿对照管中加入 1 滴 "阴性" 补偿微粒 + 1 滴 "阳性" 补偿微粒。
      3. 向试管中加入适量抗体试剂。加入过滤洗涤缓冲液，使每管终体积为 100 µL，轻轻混匀。室温避光孵育 15 分钟。
      4. 仅在含细胞的试管中加入 2 mL 新鲜稀释的裂解液，轻轻混匀。室温避光孵育 10 分钟。
      5. 以 540 × g 离心 5 分钟。
      6. 吸除上清液，勿扰动细胞沉淀，每管留约 50 µL 残余体积。轻轻混匀。加入 2 mL 过滤洗涤缓冲液。
      7. 以 540 × g 离心 5 分钟。
      8. 吸除上清液，勿扰动细胞沉淀，每管留约 50 µL 残余体积。加入过滤洗涤缓冲液，使每管终体积为 250 µL，轻轻混匀。
      9. 创建补偿对照。
        1. 从菜单栏中选择为彩虹微球采集创建的实验。创建新的 “Specimen | Compensation Setup | Create Compensation Controls”。
        2. 在弹出的对话框中，勾选 “Include separate unstained control tube/well”。为 FITC、PE、PerCPCy5.5、APC、HV450、HV500 创建通用（非标签特异性）补偿对照。为 PE-Cy7-CD117、APC-H7-CD10、APC-H7-CD14 和 APC-H7-CD71 创建标签特异性补偿对照。点击 “OK”。
        3. 在新工作表中，创建双参数 SSC-A / FSC-A 图，并在淋巴细胞（P1）上绘制门控，以及对应于每管中检测荧光染料的直方图，并为阳性峰绘制 P2 门控。显示层级结构（右键单击图形并选择 “Show Population Hierarchy”），以查看 P2 中的事件数（未染色对照管除外）。
        4. 在浏览器中展开补偿对照样本。
        5. 将上述制备的未染色细胞涡旋 3–5 秒。将制备好的未染色细胞安装到流式细胞仪上。将流速调整为“Medium”，点击 “Acquire Data”。在 FSC-A 对 SSC-A 散点图中，调整 P1 门控以完全包含淋巴细胞群体。右键单击 P1 门控，选择 “Apply to all compensation control”。
        6. 从 “Acquisition” 仪表板中点击“Record Data” 以采集 5,000 个事件。对所有单色染色的对照细胞，验证 P2 区间门控是否完全包含阳性群体。
        7. 对于 PE-Cy7 和 APCH7 试管，在直方图上添加 P3 区间门控，确保其包含阴性群体，且 P2 包含阳性群体。
        8. 计算补偿。从菜单栏中选择 “Experiment | Compensation Setup | Calculate Compensation”。将补偿矩阵命名为：“Compensations date”。选择 “Link and Save”。
        9. 将补偿矩阵保存至目录应用设置：点击“Cytometer Settings | Application settings | Save”，将补偿矩阵命名为 “Compensation date”，点击 “OK”。
        10. 在浏览器中点击 “Cytometer Settings”。在 Inspector 中导航至 “Compensation” 选项卡。点击右下角的“Print”。
          注意：此信息也可从目录中获取。
        11. 补偿矩阵的验证。
          1. 将所有单染色管（任选 APCH7）混合于一个试管中。
          2. 创建一个名为 “Compensation verification date” 的新实验，添加新样本，右键单击该实验的 “Cytometer Settings” 并选择在步骤 1.1.3.10 中保存的 “Link | Unlink | Application Setting”。使用新设置从此管中采集 50,000 个事件。
          3. 应用新的全局工作表。创建 1 个 FSC-A/SSC-A 双参数散点图并绘制门控以观察淋巴细胞，以及 n × (n-1)/2 个其他聚焦于淋巴细胞门控的双参数图，以两两观察各参数。
  2. 每日仪器设置
    1. 打开流式细胞仪。确保所有液体液位正常，打开 Diva 6.1.3 软件。执行流体启动：在菜单栏中选择 “Cytometer | Fluidics Startup”。提示时点击 “OK”。让仪器预热至少 30 分钟。
    2. 性能检查 - CST 微球：重复步骤 1.1.2.1–1.1.2.5。
    3. 性能检查 - 使用彩虹微球确认 PMT 值。
      1. 将一个聚苯乙烯管标记为 “Rainbow Beads”，并确认批号为当前使用的批号。充分混匀彩虹微球小瓶。制备彩虹微球：将 1 滴彩虹微球加入 1 mL 去离子水或蒸馏水中。避光保存。
        注意：可立即进行采集，或将试管在 2–8 ˚C 保存至采集前。
      2. 创建一个新实验：“Rainbow Beads Date”。
      3. 链接补偿：右键单击 “Cytometer Settings”，选择 “Link Setup”，选择在步骤 1.1.5.9.9 中创建的适当补偿矩阵，并选择 “Overwrite”。
      4. 取消链接补偿：右键单击 “Cytometer Settings”，选择 “Unlink from the previously linked setup”，点击 “OK”。
      5. 应用 “Application Settings”：右键单击 “Cytometer Settings”，选择 “Application Settings”，应用在月度设置期间步骤 1.1.3.10 创建的设置，并选择“Keep the compensation value”。
      6. 取消勾选 “Enable compensation”。
      7. 在实验中创建一个新样本，并使用彩虹微球的工作表模板。以 “LOW” 采集模式采集该管。
      8. 在微球采集过程中，调整 P1 门控仅包含单颗粒微球群体。在 FITC-A / PE-A 散点图中调整 P2 门控，仅包含单颗粒微球群体。记录 10,000 个事件。
      9. 检查 P2 群体获得的 MFI 和 CV 值是否在协议预定义的目标范围内。否则，清洗仪器并重新开始操作。将报告以 PDF 格式保存。

2. 骨髓样本制备

注意：在染色步骤开始前立即进行细胞洗涤操作。

  1. 将600 µL原始样品用移液器转移至15 mL离心管中。
  2. 加入10 mL洗涤缓冲液（PBS + 0.5% BSA [>98%纯BSA] + 0.09% NaN3过滤溶液，pH 7.4）。使用移液器充分混匀细胞悬液。
  3. 在540 × g条件下离心5分钟（洗涤1）。弃去上清液，注意不要扰动细胞沉淀。
  4. 重复步骤2.2–2.3（洗涤2）。
  5. 将细胞沉淀重悬于400 µL洗涤缓冲液中。
  6. 骨架标记物染色。将全部体积的骨架抗体转移至用于流式细胞分析的聚丙烯管中，该管需标记患者信息及"骨架"。加入350 µL洗涤后的样品（即填满面板中所有试管所需的洗涤样品体积）。使用移液器充分混匀。
    注意：根据表2所示计算用于细胞膜表面染色的骨架抗体总体积。
  7. 将样品-骨架混合液等量分装至3个用于流式细胞分析的聚丙烯管中，每管标记患者信息及"1号管"至"3号管"。如有需要，可用洗涤缓冲液补足每管终体积至200 µL。
    注意：务必避免样品残留在管壁上；否则这些细胞将无法被染色。如有需要，可涡旋混匀细胞并短暂离心。
  8. 根据表2规定，在每管中加入针对细胞表面标记物（骨架标记物除外）的相应体积抗体。使用移液器充分混匀。室温避光孵育30分钟。
  9. 每管加入2 mL裂解液。使用移液器充分混匀。室温避光孵育10分钟。
  10. 在540 × g条件下离心5分钟。弃去上清液，注意不要扰动细胞沉淀，每管保留约50 µL残留液体。使用移液器充分混匀。
  11. 向细胞沉淀中加入2 mL洗涤缓冲液。使用移液器充分混匀。
  12. 重复步骤2.10–2.11（洗涤2）。
  13. 在540 × g条件下离心5分钟。弃去上清液，不要扰动细胞沉淀，将细胞沉淀重悬于200 µL PBS中。使用移液器充分混匀。
  14. 染色后应尽快上机检测细胞；若不能立即检测，可在4 °C避光保存，但不得超过1小时，之后需尽快进行流式细胞仪检测。

3. 数据采集

  1. 在 Diva 软件中打开一个新的实验，并根据样本名称、样本类型和日期重命名。
  2. 创建一个包含 3 个试管的新样本。在实验布局中指定每个试管所使用的抗体。
  3. 右键单击 “Cytometer Settings”，选择 “Application Settings”，并应用每月设置中获得的数值（步骤 1.1.3.10）。
  4. 打开一个新的全局工作表，并创建以下散点图：SSC-A/FSC-A、SSC-A/CD45-HV500-A、SSC-A/FITC-A、SSC-A/PE-A、SSC-A/CD34-PerCP-Cy5.5、SSC-A/CD117-PECy7-A、SSC-A/APC-A、SSC-A/APCH7-A、SSC-A/HLA-DR-HV450-A。在 SSC-A/FSC-A 散点图中创建门以选择单细胞。在 SSC-A/CD45-BV500-A 散点图中创建门以选择 4 个群体：粒细胞、单核细胞、原始细胞和淋巴细胞。将这些群体投射到之前创建的散点图中。
  5. 按照步骤 1.1.5.9.11.3 中所述，为补偿控制创建一个新的全局工作表。
  6. 以 “MEDIUM” 采集模式获取试管数据，每管记录 500,000 个事件。在完成技术验证（评估补偿效果和染色情况）后，将数据导出为 FCS3.0 文件。

4. 数据分析

注意：为了构建正常的骨髓 数据库使用了来自健康供体以及无任何造血系统疾病证据的个体的文件，具体如下：中性粒细胞_NM数据库使用了18个文件中的11个，单核细胞_NM数据库使用了18个文件中的10个，NRC_NM数据库使用了18个文件中的14个。被剔除的文件存在各种技术问题，详见代表性结果部分。所有文件均使用Infinicyt软件进行单独分析。材料表），符合图中所示的各种策略 图 1A(1-3) 用于中性粒细胞谱系（Profile Neutrophils_Maturation.inp）， 图2A 用于单核细胞谱系（配置文件 Monocytes_Maturation.inp），以及 图3A(1-2) 用于红系细胞谱系（Profile NRC_Maturation.inp）。

  1. 中性粒细胞分析策略 - 中性粒细胞_NM数据库构建
    1. 使用七个门控的交集鉴定CD34+中性粒细胞定向原始细胞，以筛选出CD34+ CD117+ HLADR+low CD10- CD13+ CD11b-细胞事件图1A.1）。将这些事件分配给 中性粒细胞 在群体层级树中取消勾选该标签，以从剩余事件（灰色）的显示中移除这些细胞（以蓝色显示）。
    2. 使用如图所示的六个门联合设门策略，分选 CD117+ CD34- CD13+ CD11b- HLADR+low 中性粒细胞前体 图1A(2) 并将它们分配给 中性粒细胞 表。
    3. 使用四个门控的交集来鉴定更成熟的中性粒细胞，以区分 CD45dim SSCint-hi CD117- HLADR- 细胞并将其归类至 中性粒细胞 表。
    4. 取消选中其余事件，仅保留中性粒细胞可见，然后通过点击导出此细胞群 文件 | 导出 并确认所有必需的参数均已检查，然后将数据保存为FCS文件。
    5. 在由所有导出的FCS文件合并而成的文件中，通过评估每个亚群标记物的表达强度来进行质量检查。使用APS图，显示每个文件的中位数以及每个亚群的标准差（SD）曲线，剔除位于2SD曲线范围之外的样本（详见代表性结果部分）。图1B).
    6. 在最终合成的文件中 "中性粒细胞" 可见，在 APS 图上绘制成熟途径（图1C 左侧）并另存为 .cyt 文件。
      注意：成熟度比较图可用于可视化中性粒细胞_NM数据库中所有文件的全部参数与标准化数据库的对应关系。图中所示的示意图 图2C右侧显示，中性粒细胞_NM数据库中包含的所有文件（n=11）与该组中位数相比均在2个标准差范围内。
  2. 单核细胞分析策略 - 单核细胞_NM数据库构建
    1. 使用四个门控的交集来鉴定单核细胞系细胞（CD117+/- CD64+hi HLADR+hi）图2A）。将这些事件分配给 单核细胞样 群体分层树中的标签
    2. 取消选中其余事件，仅保留单核细胞可见，然后通过点击导出此细胞群 文件 | 导出 并确认所有必需的参数均已检查，将数据保存为 FCS 文件。
    3. 在由所有导出的FCS文件合并而成的文件中，通过评估每个亚群标记物的表达强度来进行质量检查，然后剔除超出2SD曲线的样本（详见代表性结果部分）。图2B).
    4. 在生成的文件中 "单核细胞的" 可见细胞时，在 APS 图示上绘制成熟途径（图2C 左侧）并将其保存为 .cyt 文件。
      ​注意：成熟度比较图可用于可视化单核细胞_NM 数据库中所有文件的全部参数，这些参数以归一化数据库为参照进行呈现。图中所示的比较图 图2C右侧显示，Monocytes_NM 数据库中包含的所有文件（n=10）与该组的中位数相比均在 2 个标准差（SD）范围内。
  3. 有核红细胞（NRCs）的分析策略 - NRC_NM 数据库构建
    1. 使用七个门控的交集来鉴定CD34+红系定向原始细胞，以筛选出CD34+ CD117+ HLADR+low CD105+ CD33- CD36+ CD71+细胞事件图3A(1)）。将这些事件分配给 "NRC" 在群体层级树中取消勾选该标签，以从剩余事件（灰色）的显示中移除这些细胞（红色所示）。
    2. 使用四个门控的交集来鉴定更成熟的NRCs，以区分CD45-/+dim SSClow CD36+hi CD71+hi CD105+/-细胞。将这些事件归入 "NRC" 标签图3A(2)）。血小板（CD36+hi SSClow 细胞）必须从 NRC 群体中去除（图3A(2)).
    3. 取消选中其余事件，仅保留 NRC 细胞可见，然后通过点击导出此细胞群 文件 | 导出 并确认所有必需的参数均已检查，将数据保存为FCS文件。
    4. 在由所有导出的FCS文件合并而成的文件中，通过评估每个亚群标记物的表达强度来进行质量检查，随后去除超出2SD曲线的样本（详见代表性结果部分）。图3B).
    5. 在生成的文件中 "NRC" 可见细胞时，在APS图上绘制成熟途径（图3C，左侧）并将其保存为 .cyt 文件。
      ​注意：成熟度对比图可用于可视化NRC_NM数据库中所有文件的全部参数，并将其与标准化数据库进行对照。文中所示的图示为 图3C右侧显示，NRC_NM 数据库中包含的所有文件（n = 14）均在组内中位数的 2 个标准差范围内。
  4. 利用成熟数据库评估骨髓髓系组分的成熟状态
    1. 打开与目标谱系对应的 .cyt 文件 即中性粒细胞系使用 Neutrophils_NM_GMFF.cyt，单核细胞系使用 Monocytes_NM_GMFF.cyt，红系细胞使用 NRCs_NM_GMFF.cyt。
    2. 右键单击 成熟 位于目标谱系对应标签下方的标签中性粒细胞 | 单核细胞样 | NRC）并将成熟过程保存至成熟数据库。
    3. 打开一个新的FCS文件，并按照之前所述方法进行分析（中性粒细胞参照步骤4.1.1–4.1.3，单核细胞参照步骤4.2.1，NRC参照步骤4.3.1–4.3.2）。
    4. 绘制目标群体的成熟路径。
    5. 打开相应的数据库 工具 切换至（数据库分析）选项卡，将待分析的群体与相应的成熟度数据库进行比较。检查数据与可用数据库的兼容性：完全兼容（绿色三角形）；部分兼容，多数情况下为参数名称存在差异（黄色三角形）；不兼容（红色三角形）。
    6. 如果数据是兼容的或部分兼容的，软件将生成 标准化成熟度差异 示意图。为了可视化 参数带成熟度差异，打开一个新图表 示意图 标签，点击 成熟 并选择要显示的参数数量，然后单击 好的 图表将显示出来。在图表中单击右键，可对数据可视化、数据库可视化和成熟度图谱可视化进行修改。
    7. 为了直观显示新文件与数据库中已有数据之间差异的重要性，可配置缩放功能（在 标准化成熟度差异 并应用 Zoom).

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结果

本研究纳入了使用K-EDTA抗凝剂采集的54份骨髓样本。多参数流式细胞术（MFC）数据在完全不知晓患者信息的情况下进行分析。回顾性研究显示，这些骨髓样本来源于7名健康供者（5名男性和2名女性，中位年龄为47.4岁[35–48岁]）、11名无造血系统疾病证据的个体（8名男性和3名女性，中位年龄为57.9岁[35–72岁]），以及36例患有各种病理状况的患者：1例贫血伴肌酐水平降低，3例贫血伴肌酐水平升高，8例炎症性贫血，1例因维生素B12缺乏引起的贫血，4例由肝损伤导致的贫血±其他血细胞减少，3例自身免疫性溶血性贫血，5例特发性血小板减少性紫癜，1例巨噬细胞活化综合征，3例淋巴瘤治疗后完全缓解（微小残留病灶 < 0.01%），以及7例伴有血液系统疾病的患者（4例骨髓增生异常综合征[MDS]，1例急性髓系白血病[AML]，1例慢性粒单核细胞白血病，1例JAK2阳性骨髓增殖性综合征）。最后一类包括18名男性和18名女性，平均年龄为60.3岁[17–100岁]。所有样本均来自高加索人种个体。构建数据库有助于识别并纠正与样本制备和数据采集相关的多个问题。...

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讨论

骨髓穿刺物的质量可能影响最终结果。骨髓穿刺物的血液稀释可能会因祖细胞或前体细胞的缺失，而导致不同成熟阶段细胞分布的失真。采用整体裂解法可能有助于在流式细胞术分析中校正骨髓穿刺物的血液稀释效应。此外，通过流式细胞术评估骨髓髓系发育异常的关键步骤包括样本处理与染色、数据采集和结果解读2,3。样本处理与染色应在骨髓采集后72小时内完成。数据采集应尽可能在染色后立即进行，或在4 °C避光保存不超过1小时后尽快上机检测。基于数据库指导的解读可避免对骨髓髓系细胞成熟过程的主观判断。

抗体组合和样本制备基本遵循EuroFlow方案9,10。与EuroFlow抗体组合的不同之处在于，除CD300e外，所有抗体均由BD Bioscience提供。流式细胞术的标准化使得获得高度可重复的数据成为可能11，但这需要加入致力于相...

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披露

作者声明不存在任何竞争性财务利益。圣艾蒂安大学医院血液学实验室流式细胞术部门 是EuroFlow联盟的成员。

致谢

本研究中使用的抗体由BD Biosciences提供。作者感谢法国圣艾蒂安大学医院分子生物学与血液学实验室的同事帕斯卡·弗兰德兰-格雷斯塔博士（Dr. Pascale Flandrin-Gresta）为第二例骨髓增生异常综合征（MDS）病例的二代测序（NGS）数据解读提供的专业支持。作者感谢临床血液科医生对本研究的关注与参与，也感谢患者及健康供者同意参与本研究。作者同时感谢“莱斯·阿米·德·雷米”基金会（"Les Amis de Rémi" Foundation）为本研究论文发表提供的经费支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
BD FACSCanto II 流式细胞仪BD Biosciences, CA, 美国序列号: V338963013363 激光，4-2-2 配置；滤光片和反射镜详情：https://www.bdbiosciences.com/documents/BD_FACSCanto_II_FilterGuide.pdf
Awel C48-R 离心机AWEL Industries, 法国序列号: 910120016；型号: 320002001低速离心机；容量为 60 支 FACS 管
10µL 和 200µL 移液器
巴斯德移液管
15 mL Falcon 管
FACS 用聚丙烯管
小鼠抗人 HLA-DRBD Biosciences, CA, 美国655874克隆号 L243
小鼠 BALB/c IgG2a, κ
荧光染料 Horizon V450
（激发最大值 404 nm/
发射最大值 448 nm）
小鼠抗人 CD45BD Biosciences, CA, 美国560777克隆号 HI30
小鼠 IgG1, κ
荧光染料 Horizon V500（激发最大值 415 nm/
发射最大值 500 nm）
小鼠抗人 CD16BD Biosciences, CA, 美国656146克隆号 CLB/fcGran1 小鼠 BALB/c IgG2a, κ
荧光染料 FITC
（激发最大值 494 nm/
发射最大值 520 nm）
小鼠抗人 CD13BD Biosciences, CA, 美国347406克隆号 L138
小鼠 BALB/c × C57BL/6 IgG1, κ
荧光染料 PE
（激发最大值 496 nm/
发射最大值 578 nm）
小鼠抗人 CD34BD Biosciences, CA, 美国347222克隆号 8G12
小鼠 BALB/c IgG1, κ
荧光染料 PerCP-Cy5.5
（激发最大值 482 nm/
发射最大值 678 nm）
小鼠抗人 CD117BD Biosciences, CA, 美国339217克隆号 104D2
小鼠 BALB/c IgG1
荧光染料 PE-Cy7
（激发最大值 496 nm/
发射最大值 785 nm）
小鼠抗人 CD11bBD Biosciences, CA, 美国333143克隆号 D12
小鼠 BALB/c IgG2a, κ
D12, 荧光染料 APC
（激发最大值 650 nm/
发射最大值 660 nm）
小鼠抗人 CD10BD Biosciences, CA, 美国646783克隆号 HI10A
小鼠 BALB/c IgG1, κ
荧光染料 APC-H7
（激发最大值 496 nm/
发射最大值 785 nm）
小鼠抗人 CD35BD Biosciences, CA, 美国555452克隆号 E11
小鼠 IgG1, κ
荧光染料 FITC
（激发最大值 494 nm/
发射最大值 520 nm）
小鼠抗人 CD64BD Biosciences, CA, 美国644385克隆号 10.1
小鼠 BALB/c IgG1, κ
荧光染料 PE
（激发最大值 496 nm/
发射最大值 578 nm）
小鼠抗人 CD300eImmunostepIREM2A-T100克隆号 UP-H2
小鼠 BALB/c IgG1, k
荧光染料 APC
（激发最大值 496 nm/
发射最大值 578 nm）
小鼠抗人 CD14BD Biosciences, CA, 美国641394克隆号 MoP9
小鼠 BALB/c IgG2b, κ
荧光染料 APC-H7
（激发最大值 496 nm/
发射最大值 785 nm）
小鼠抗人 CD36BD Biosciences, CA, 美国656151克隆号 CLB-IVC7
小鼠 IgG1, κ
荧光染料 FITC
（激发最大值 494 nm/
发射最大值 520 nm）
小鼠抗人 CD105BD Biosciences, CA, 美国560839克隆号 266
小鼠 BALB/c IgG1, κ
荧光染料 PE
（激发最大值 496 nm/
发射最大值 578 nm）
小鼠抗人 CD33345800克隆号 P67.6
小鼠 BALB/c IgG1, κ
荧光染料 APC
（激发最大值 496 nm/
发射最大值 578 nm）
小鼠抗人 CD71BD Biosciences, CA, 美国655408克隆号 M-A712
小鼠 BALB/c IgG2a, κ
荧光染料 APC-H7
（激发最大值 496 nm/
发射最大值 785 nm）
溶血液 10 倍浓缩液（IVD）BD Biosciences, CA, 美国349202
FACSFlow 鞘液BD Biosciences, CA, 美国342003
FACSDiva CS&T IVD 微球BD Biosciences, CA, 美国656046
RAINBOW 校准微粒，8 峰Cytognos, 萨拉曼卡, 西班牙SPH-RCP-30-5A批号 EAB01, EAC01, EAD05, EAE01, EAF01, EAG01, EAH01, EAI01, EAJ01, EAK01
补偿微粒 多色 CompBeads（CE/IVD）BD Biosciences, CA, 美国货号 #51-90-9001229 + #51-90-9001291
Diva 软件版本 6.1.2 和 6.1.3BD Biosciences, CA, 美国
磷酸盐缓冲液片剂R&D Systems, 明尼阿波利斯, 美国5564
牛血清白蛋白 （BSA）Sigma-Aldrich, 法国A9647
叠氮化钠 99%Sigma-Aldrich, 法国199931
Infinicyt 软件版本 1.8.0.eCytognos, 萨拉曼卡, 西班牙

参考文献

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基于数据库指导的流式细胞术评估骨髓髓系细胞成熟度
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