方法文章

通过脑内注射促炎性细胞因子诱导广泛性大脑皮层脱髓鞘的大鼠模型

5.3K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/57879

⸱

2021年9月21日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Research Unit of Experimental Neurotraumatology, Department of Neurosurgery, Medical University Graz, 2Department of Neurology, Medical University Graz, 3Centre for Molecular Medicine, Department of Clinical Neuroscience, Karolinska Institutet, 4Division of Vascular Biology, Department of Medical Biochemistry and Biophysics, Karolinska Institutet

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文所述方案可在成年雄性Dark Agouti大鼠的双侧大脑皮层广泛复制出灰质脱髓鞘病变。该方法包括脑内植入导管、针对髓鞘少突胶质细胞糖蛋白的亚临床免疫致敏，以及通过已植入的导管向脑内注射促炎性细胞因子混合物。

摘要

多发性硬化症（MS）是最常见的中枢神经系统（CNS）免疫介导疾病，由脊髓和小脑的白质病变以及灰质脱髓鞘引起，可逐渐导致身体功能障碍甚至死亡。尽管传统的实验性过敏性脑脊髓炎模型适用于研究脊髓和小脑白质中的细胞介导性炎症，但无法有效模拟灰质的病理变化。本文介绍了一种新型皮质脱髓鞘大鼠模型的实验方案，可用于研究导致皮质病变的病理与分子机制。该模型通过低剂量髓鞘少突胶质细胞糖蛋白（MOG）在不完全弗氏佐剂中免疫，随后经导管介导向脑内递送促炎性细胞因子，从而诱导脱髓鞘。此外，该导管可在不造成注射相关创伤的前提下实现多轮脱髓鞘，并可用于递送正处于临床前研究阶段的潜在治疗药物。该方法在伦理方面也具有优势，动物的疼痛、痛苦或功能障碍均受到控制且相对轻微。整个实验方案的预计实施时间为8至10周。

引言

多发性硬化症（MS）是一种由免疫介导的中枢神经系统（CNS）炎症性疾病，主要损害髓鞘，但最终会导致轴突丢失和永久性神经元损伤。根据美国国家多发性硬化症协会的数据，MS是全球最常见的中枢神经系统免疫介导疾病，估计全球约有230万人患病1，给个人及社会经济带来重大负担。该病的平均发病年龄为30岁，因导致严重残疾而使患者失去宝贵的劳动能力。目前MS尚无法治愈，现有的治疗手段旨在控制复发-缓解型多发性硬化症（RRMS）急性复发期的症状，并通过免疫调节疗法改变疾病进程以降低复发频率2,3。迄今为止，尚无治疗手段被证实对进展型MS有效4，最近一项针对B细胞耗竭疗法的临床试验除外，该试验证明在伴有活动性炎症的原发进展型多发性硬化症（PPMS）亚组患者中具有疗效5。尽管已发现多种潜在的遗传6和环境风险因素7，但MS的病因至今仍不明确。

多发性硬化症（MS）的特征是白质中出现大范围的炎性脱髓鞘斑块以及弥漫性损伤8,9。局灶性病变与广泛的T细胞介导的攻击、少突胶质细胞破坏、反应性星形胶质增生及轴突变性相关，导致运动神经元功能下降。灰质脱髓鞘和萎缩已被确认为该疾病的附加组织病理学特征9,10,11。后者被认为与患者的神经功能障碍和认知能力下降有关12,13。 cortical脱髓鞘已可区分出三种模式，即：i）白质-皮质型，与白质病变相连（占34%）；ii）小的、血管周围型（占16%）；iii）软脑膜下型（占50%）。与局灶性白质病变不同，这些灰质病变据报道缺乏T细胞介导的攻击，而是以小胶质细胞活化增强、细胞凋亡及神经元丢失为特征12。

迄今为止，尚无法通过单一动物模型完全重现人类多发性硬化症（MS），这主要是由于该疾病的复杂性所致。因此，研究人员已开发出多种MS动物模型，每种模型分别模拟疾病发生和发展过程中的不同方面14,15。目前的动物模型可模拟三种不同的疾病过程：i）局灶性炎症病灶，ii）弥漫性白质损伤，以及iii）弥漫性灰质病变。

多发性硬化症（MS）白质斑块的动物研究主要在啮齿类动物脑脊髓炎（EAE）模型中进行。实验动物通过含有髓鞘抗原（通常为髓鞘少突胶质细胞糖蛋白，MOG）的乳剂进行主动免疫。16,17，髓鞘碱性蛋白（MBP）18，或蛋白脂质蛋白（PLP）19]，以及完全弗氏佐剂（CFA）20该疾病也可通过过继性转移髓鞘特异性T细胞而被动诱导。21疾病的病程取决于所使用的抗原/小鼠品系组合。MOG35-55 在C57BL/6小鼠中，例如，会导致单相性慢性疾病22，而PLP139-151 在SJL小鼠中导致复发-缓解型疾病病程23 以性别特异性的方式24大鼠MOG35-55，此外，还会诱导产生脑炎性T细胞反应，而人MOG35-55 在C57BL/6小鼠中诱导B细胞依赖性炎症25多种实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）模型为研究主要发生在脊髓和小脑的细胞介导性炎症提供了极佳工具，但大脑前部结构如大脑皮层、胼胝体及皮层下结构通常较少受累。26此外，EAE 模型尚不能充分模拟弥漫性白质损伤或灰质脱髓鞘。26,27. 已有报道显示，在诱导活动性EAE的狨猴中出现与之相关的皮质脱髓鞘28,29 在某些Lewis大鼠亚系中，后者归因于占主导地位的MHC I类和II类同种型及等位基因的组合30.

铜螯合剂（cuprizone）模型31 是研究弥漫性白质脱髓鞘及灰质病变的有用工具，可导致皮层、皮层下32 和海马33 区域，以及胼胝体34 和尾状壳核35 发生广泛脱髓鞘。铜螯合剂中毒主要通过引起少突胶质细胞的代谢应激诱导凋亡，模拟了多发性硬化（MS）脑组织中皮层脱髓鞘病灶的某些特征，例如小胶质细胞活化、星形胶质细胞增生，以及外周免疫细胞浸润相对缺乏。然而，由于缺乏神经元凋亡和丘脑萎缩，且在停止饮食中添加铜螯合剂后脱髓鞘可完全消退并伴随显著的再髓鞘化32，因此铜螯合剂中毒模型作为临床前MS模型的应用受到一定限制。毒性脱髓鞘也可通过向白质通路局部注射溶血卵磷脂（lysolecithin）或溴化乙锭（ethidium bromide）来诱导36,37，但这些方法较少使用。毒性脱髓鞘模型特别适用于分析再髓鞘化的复杂机制，例如少突胶质前体细胞和星形胶质细胞的作用38,39。关于EAE模型和中毒模型的详细信息可参见两篇近期综述15,40。

细胞因子诱导的脱髓鞘模型最初用于研究实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）中的脊髓白质病变41。随后，该模型被改良用于研究多发性硬化症（MS）中的大脑皮层灰质病理变化。首先，通过不完全弗氏佐剂（IFA）对Dark Agouti（DA）或Lewis大鼠进行亚临床剂量的MOG1-12542,43 或MOG1-11644免疫致敏。与经典的EAE模型不同，这些致敏动物不会出现脊髓局灶性炎性病变的临床症状。相反，当动物血液中抗MOG抗体达到稳定滴度后，通过脑内注射促炎性细胞因子混合物［肿瘤坏死因子α（TNFα）和干扰素γ（IFNγ）］，从而在脑内诱发炎症反应和脱髓鞘病变。

Merkler 的研究 等42 和加德纳 等44 已证实通过亚临床剂量的MOG免疫联合脑内或蛛网膜下腔细胞因子注射，可成功诱导皮层下皮质脱髓鞘。然而，所报道的脱髓鞘持续时间过短——完全再髓鞘化在14天或更短时间内即发生，从而限制了药理学干预测试的时间窗口。此外，这两种模型均采用具有创伤性的注射方式，可能带来额外干扰。 本身 导致注射创伤和血脑屏障（BBB）破坏，从而引起炎症细胞不受控制地浸润至脑实质。此外，这两项研究均显示脱髓鞘仅局限于同侧皮层或细胞因子注射部位附近的小范围区域。

为克服这些局限性，我们在DA大鼠的右侧顶叶皮层植入一根导管，导管尖端位于胼胝体上方。为使血脑屏障完整性充分恢复，导管植入后让动物休息2周。随后，大鼠接受5 µg重组MOG的亚临床免疫接种1-125 在IFA中。在约4周后达到稳定的抗MOG抗体滴度后，注射2 µL细胞因子混合物 通过 在10分钟内使用可编程注射泵输注导管内液体。该操作在细胞因子注射后15天内引发双侧大脑半球（同侧与对侧）广泛的皮层脱髓鞘，约在注射后30天出现部分再髓鞘化。43此外，通过导管重复给予促炎性细胞因子可诱导多次脱髓鞘阶段，而全脑萎缩是进展型多发性硬化亚型的常见特征45，可在第二次脱髓鞘阶段后尽早诱导产生43重要的是，植入的导管还可用于测试药物干预效果。

以下方案详细说明了利用脑内导管在DA大鼠双侧大脑半球可重复地诱导广泛皮层脱髓鞘的实验步骤。

方案

本文所述所有方法均已获得当地主管部门（奥地利科学与研究部，许可证号：66.010/0132-WF/V/3b/2014）批准。成年雄性DA大鼠（10至12周龄）饲养于12小时光照/12小时黑暗循环环境中，可自由获取食物和水。

1. 材料准备
注意：手术需在无菌条件下进行。开始前，确保所有手术器械（包括钻头）均已使用适当的消毒剂清洁。

  1. 配制麻醉混合液：每毫升含芬太尼 0.02 mg、咪达唑仑 0.4 mg 和美托咪定 0.2 mg（均为混合液中的终浓度）。
    注：有关替代麻醉剂的信息，请参见相应的讨论部分。
  2. 配制解毒混合液：每毫升含氟马西尼 0.07 mg 和阿替美唑 0.42 mg（均为混合液中的终浓度）。
  3. 将导管与带入口和螺钉的导管帽组装在一起。使用手术刀将导管切割至 2 mm 长度（图 1）。
    注：请勿使用剪刀进行切割，因为剪刀会挤压并破坏导管尖端的圆形横截面形状。

2. 手术准备

  1. 通过腹腔注射（i.p.）给予麻醉混合液（1.5 mL/kg 体重）使大鼠麻醉。
  2. 使用电动剃须刀剃除大鼠两耳之间的头部毛发。在将动物置于立体定位仪之前，先在其下方放置恒温毯，以防止手术过程中发生低体温。
  3. 使用耳杆和门齿板将大鼠头部固定在立体定位仪上，确保头部水平且稳固。用手指或镊子轻压颅骨以检查固定稳定性。
    注意：立体定位仪中固定不牢或头部未保持水平可能导致实际操作坐标偏离预定位置。
  4. 滴加润滑性眼药水，防止手术期间角膜干燥。用不透明材料覆盖眼睛，避免手术光源照射。
  5. 交替使用70%乙醇和10%聚维酮碘溶液清洁已剃毛的手术区域。
    注意：手术过程中应遵守所有预防感染的措施，手术需在无菌条件下进行。若无菌状态被破坏，受污染的材料必须更换。

3. 导管植入

  1. 在头部皮肤正中做一条长约 2 cm 的纵向切口。使用无损伤血管夹将皮肤向两侧牵开。有关这些步骤的概览，请参见 图 2。
  2. 使用棉签清除血液。
  3. 去除颅骨骨膜。用棉签清洁组织，暴露颅骨表面。让颅骨自然干燥约 1 分钟。
  4. 确定解剖学标志点：人字缝（Lambda）、前囟（Bregma）和矢状缝。将钻头安装在立体定位仪上，将钻头尖端置于前囟作为起始点。从前囟向后移动 2 mm，再向矢状缝方向横向移动约 2.4 mm。
  5. 在此位置钻出一个直径为 0.5 mm 的孔，用于插入导管。轻轻吹去任何骨屑。
    注意：钻孔过程中必须保持硬脑膜完整。为确保这一点，请做到：1）使用可安装在立体定位仪上的钻头；2）在钻孔过程中频繁检查钻孔情况；3）分步缓慢钻入——若对颅骨施加压力过大，当颅骨被完全穿透时，钻头尖端会继续深入并损伤脑组织。
  6. 在距离第一个孔几毫米处再钻三个用于固定螺钉的孔（直径约 1.3 mm）。轻轻吹去骨屑。
    注意：选择固定螺钉的位置时，应确保为导管顶部（直径约 2 mm）和固定螺钉顶部（直径约 1 mm）留出足够空间。
  7. 使用注射器以约 1 - 2 mL 无菌磷酸盐缓冲液（PBS）或生理盐水冲洗清除骨屑。清洁颅骨表面。将固定螺钉拧紧 2 - 3 圈。
    注意：固定螺钉的作用是通过固定牙科水泥从而稳定导管位置。在拧紧固定螺钉时，需用镊子轻轻向上提拉确认其是否牢固，避免松动。由于导管植入本身会造成组织创伤，若在钻孔或拧紧固定螺钉过程中额外造成硬脑膜损伤，将导致多重创伤性损伤，可能影响组内结果的可比性。因此应先拧紧固定螺钉，最后再插入导管。
  8. 将长度为 2 mm 的导管垂直插入第一个孔，使其垂直于颅骨表面。在保持导管位置的同时，涂抹少量牙科水泥，并用牙科固化灯短暂照射（约 5 秒），使水泥初步聚合，以固定导管，便于下一步操作时可腾出双手。
    警告：使用牙科固化灯时，避免直视灯尖或从操作区域反射的强光，因其高强度可能造成视网膜损伤。应佩戴适当的防护护目镜。
  9. 在导管周围及固定螺钉处继续添加牙科水泥，并用牙科固化灯照射（约 15 - 30 秒）使其完全固化。用镊子尖端检查水泥是否已完全硬化。

4. 伤口闭合与麻醉拮抗

  1. 使用可吸收缝线在导管前方和后方缝合头部皮肤。
    注意：由于植入结束后颅骨上方会形成不平整的结构，因此应相应地进行伤口缝合。过度牵拉皮肤会导致动物不适。
  2. 使用1 mL注射器配合26 G针头，皮下注射解毒剂混合物（1.5 mL/kg体重）。
  3. 皮下注射恩诺沙星  （2.5%），剂量为7.5 mg/kg体重，用于预防性抗生素治疗。同时皮下注射卡洛芬（1 mg/mL；5 mg/kg体重）和布托啡诺（1.2 mg/kg），以缓解疼痛。

5. 术后护理与用药

  1. 将动物放回改造后的笼子中，并在术后1 - 3小时内持续观察，同时使用红外灯照射以防止低体温。 在术后恢复期间，每5至10分钟观察并调整动物体位一次。需特别注意避免光线持续照射动物眼睛直至其完全恢复。
  2. 术后次日，通过皮下注射重复给予恩诺沙星（7.5 mg/kg体重）和卡洛芬（1 mg/mL；5 mg/kg体重）。由于先前给予的布托啡诺药效可持续72小时，因此无需再次追加给药。

6. 免疫混合物的制备（导管植入后最早14天）

注意：在准备过程中将注射器置于冰上。

  1. 将两个10 mL鲁尔锁头玻璃注射器连接到三通旋塞的两个短臂上，并用长臂关闭第三个出口。
  2. 确保连接牢固且无泄漏：在握住活塞2的同时，向敞开的注射器中加入约4 mL无菌PBS。插入活塞1，来回推动两个活塞并检查是否泄漏。若无泄漏，弃去PBS，再次取出活塞1。
  3. 用移液器吸取1 mL IFA和50 µg rMOG1-125 至合适离心管中，再用无菌PBS（pH 7.4）将混合物体积调整至终体积2 mL。
    注意：由于在制备过程中乳剂可能在注射器针头或管壁上损失，建议配制的体积应大于实际给药所需量。同时，一次性为多只动物配制也更为实用。
  4. 将稀释后的IFA与rMOG1-125 混合液装入敞开的注射器中。轻轻插入活塞，同时对另一侧活塞保持轻微松动的压力（图3A）。
  5. 通过来回推动活塞，使液体在两个注射器之间反复转移，以乳化接种物，直至其呈现白色且黏稠状（图3B）。
  6. 将一个1 mL鲁尔锁头注射器连接至三通旋塞的开放短臂，并用接种物将其充满（图3C）。将全部接种物分装至1 mL注射器中。分装后置于冰上保存，待注射使用。接种物应在配制当天给予。

7. 免疫接种

  1. 在麻醉舱内使用异氟烷对大鼠进行麻醉（约 2 分钟，以 2 L/min 的氧气混合），随后通过持续吸入异氟烷维持麻醉状态 面罩（与氧气混合，1.5 L/min）。
  2. 使用21 G针头在尾根部皮下注射200 µL接种物。
    注意：由于溶液黏稠，应缓慢注射。

8. 抗体滴度的测定

  1. 免疫后4周采集约200 µL血液，以测定抗MOG抗体滴度。
  2. 用MOG（5 µg/mL PBS溶液）包被96孔板的孔，37 °C孵育1小时。
  3. 用含1%牛血清白蛋白（BSA）的PBS在室温下封闭板孔1小时。
  4. 加入大鼠血清（1:50稀释），37 °C孵育2小时进行标准化。用200 µL PBS/吐温20溶液洗涤3次。
  5. 加入辣根过氧化物酶标记的抗大鼠IgG二抗（1:10,000稀释），37 °C孵育。用200 µL PBS/吐温20溶液洗涤3次。
  6. 每孔加入100 µL过氧化物酶底物溶液，室温避光孵育20–30分钟。
  7. 在405 nm波长下测定吸光度，并根据标准曲线通过吸光度值计算抗体滴度。

9. 脑内细胞因子注射

  1. 调整连接套管的长度（2 mm）。（参见 图4 （用于准备步骤。）
  2. 用1 mL注射器吸取细胞因子混合液（含500 ng/µL TNF-α和300 U/µL重组大鼠IFN-γ的无菌PBS溶液）。将注射器连接至连接套管，用细胞因子混合液填充套管，避免产生气泡。
  3. 将注射器安装到可编程注射泵上，并设置程序以 0.2 µL/min 的速度注射图5A启动泵并保持其持续运行，以防止在套管尖端形成气泡。
    注意：注射速度必须考虑所用注射器的内径；因此，在泵的设置过程中需登记注射器的直径。
  4. 使用异氟烷在麻醉舱内对大鼠进行麻醉（约 2 分钟，与 2 L/min 氧气混合），随后通过面罩维持麻醉（与 1.5 L/min 氧气混合）图5B 和 5C). 动物将被麻醉至少30分钟，期间需使用润滑性眼药水。
  5. 移除带有入口的导管帽。将连接器套管插入导管，并旋转拧紧（图5D 和 5E).
    注意：切勿过度拧紧，否则会损坏导管的顶端。
  6. 注射持续10分钟（总注射体积为2 µL）。停止泵送。将套管保留在导管内20分钟，以使注射液体充分扩散。
  7. 拧开连接套管并缓慢取出，以避免产生负压效应。
  8. 重新连接导管帽与入口并拧紧。将动物置于笼中，使其从麻醉中恢复。

结果

通过蛋白脂质蛋白（PLP）的免疫组织化学染色，可在细胞因子注射后的不同时间点评估皮层脱髓鞘情况（图6）。图6A 显示，在仅通过植入导管注射无菌PBS的MOG免疫对照动物中，第15天时PLP免疫反应性保持完整。在细胞因子注射后第1天，MOG致敏动物中已可检测到脱髓鞘现象，尽管此时仅局限于导管植入区域附近（图6B）。细胞因子注射后第1天，对侧皮层的PLP免疫反应性仍保持完整。到第3天时，同侧皮层内PLP免疫反应性的缺失呈逐渐扩展趋势（图6C）。在第3天也可观察到对侧皮层出现脱髓鞘（图6D），但其范围主要局限于锚定螺钉下方区域，可能是由于锚定螺钉造成间质液流动缓慢所致43。在PBS注射的对照动物中未观察到类似现象，排除了锚定螺钉引起创伤性脱髓鞘的可能性。

在第9至15天之间，脱髓鞘影响双侧大脑半球皮层的大部分区域（图6E、6F和6G）。这一现象与动物行为变慢的观察结果相吻合，但在转棒实验中其运动能力并未出现统计学上显著的下降43。双侧半球的皮层脱髓鞘可持续至细胞因子注射后30天（图6H和6I），且仅有部分再髓鞘化。图6J展示了脑室内注射细胞因子后皮层灰质中蛋白脂质蛋白（PLP）丢失的定量分析结果。需要注意的是，目前尚未评估超过30天后的PLP免疫反应性，因此若存在再髓鞘化的即时恢复过程，仍有待进一步实验验证。在首次注射30天后，通过已植入的导管再次给予细胞因子混合物，可在第15天观察到明显的脑萎缩（图7）。

用于微流控分析的毛细管微探针组件；图像 A、B 和 C 显示了各组件组装阶段。
图1：导管的制备。（A 和 B）将导向套管和假性套管（带入口的导管帽）组装并旋紧。（C）然后借助手术刀将导管切割至2 mm长度。显微观察显示，使用剪刀会导致套管尖端的圆形结构变形，因此必须避免使用剪刀。请点击此处查看该图的放大版本。

手术植入序列，步骤 a-g，显示在啮齿类动物颅骨上的实验操作过程。
图 2：导管的植入。（A）手术开始于纵向切口并去除骨膜。（B, C）该图示出导管植入位置的标记点，位于前囟后方 2 mm、矢状缝右侧 2.4 mm 处；以及用于三个固定螺钉的钻孔位置，这些位置与导管和人字缝保持适当距离。（D）使用圆锥形钻头钻出直径为 0.5 mm 的导管孔，使用扭转型钻头钻出直径为 1.3 mm 的固定螺钉孔，随后拧紧固定螺钉。（E, F）然后插入导管，并用聚合型牙科水泥固定整个装置。（G）在导管前后方各缝合两到三个结。B = 前囟；L = 人字缝；C = 导管；S1、S2 和 S3 = 三个固定螺钉钻孔的位置。比例尺 = 1 cm。请点击此处查看该图的放大版本。

冰浴中使用注射器滤器进行蛋白质纯化；精确提取的实验装置。
图 3：rMOG/IFA 乳剂的制备。（A）通过反复推动活塞将rMOG、PBS和IFA的混合物从一个注射器推入另一个注射器，从而乳化接种液；（B）直至形成白色且黏稠的乳剂；（C）随后将接种液分装至1 mL注射器中用于注射。每只大鼠皮下免疫使用200 µL PBS/IFA混合液中含有5 µg rMOG；然而，由于制备过程中注射器尖端和管壁会造成损失，因此应制备更大体积的乳剂。请点击此处查看该图的放大版本。

用于医疗器械或流体传输装置的导管构造与组装顺序示意图。
图 4：连接套管的制备。（A - D）这些图示展示了如何使用2 mm尺寸的模板导向套管将连接器与内套管进行组装。（E）在刀片（F）辅助下，将内套管切割至与导向套管相同长度，随后卸下模板导向套管。（G）将连接套管的另一端通过20 G针头固定于含有注射混合液的1 mL注射器上。比例尺 = 3 cm。请点击此处查看该图的放大版本。

使用呼吸机设置的啮齿类动物麻醉过程，展示镇静和实验准备。
图 5：脑内注射。（A）将可编程注射泵调节至 2 µL/min 的注射速度，并将装有细胞因子混合物（对照组使用无菌 PBS）的 1 mL 注射器安装到泵上。（B）首先在麻醉舱内使用 5% 异氟烷（氧气流速为 2 L/min）对动物进行麻醉，然后（C）通过面罩持续给予 2.5% 异氟烷（氧气流速为 1.5 L/min）以维持麻醉状态。（D）拧下带有入口的导管帽（假性套管），将注射套管经植入的导管插入。由于注射体积非常小，操作者应谨慎避免套管尖端产生气泡。因此，应在泵运行的同时开始插入操作，仅当套管尖端出现逐渐增大的液滴时才进行插入。多余的液体不会进入脑组织，因为在插入前液滴会在导管顶部破裂。（E）随后拧紧连接套管，让泵持续运行 10 分钟。注射 10 分钟后停止泵运行，将套管保留在原位 15–20 分钟，以使注射液体充分扩散至组织间液。比例尺 = 5 cm，除非另有说明。请点击此处查看该图的放大版本。

细胞因子注射后皮层组织的组织学切片和柱状图；包含比例尺。
图6：脑冠状切片中PLP免疫反应性。（A）该图显示对照组脑组织（MOG致敏）在第15天注射PBS，未引起皮层脱髓鞘。（B）在细胞因子注射后第1天，导管区域已出现明显的脱髓鞘。（C）在第3天，同侧皮层出现更广泛的PLP免疫反应性丧失，（D）对侧皮层也出现类似现象。在第15天，双侧半球均观察到PLP免疫反应性的广泛丧失，其中（E）该图显示同侧皮层，（F）该图显示对侧皮层。（G）该图展示了第15天双侧半球的整体情况，显示PLP免疫反应性的广泛丧失。至第30天，（H）该图显示同侧皮层，（I）该图显示对侧皮层，仍存在显著的脱髓鞘，但也可见部分再髓鞘化区域。（J）该图显示脱髓鞘程度的定量分析（每半球PLP丢失面积，单位为mm2）。采用厚度为1.5 - 2 µm的脑冠状切片，使用MS抗PLP抗体（稀释比例1:500）进行PLP检测。切片经苏木精复染以显示细胞核。有关免疫组织化学的详细信息，请参见Ucal et al.43。图G和J经修改自Ucal et al.43。请点击此处查看该图的放大版本。

用于解剖学比较和分析的脑组织病理切片显微图像 A、B。
图 7：第二次细胞因子注射后的脑萎缩。（A）该图显示对照组小鼠（MOG致敏）在第15天注射PBS后的脑组织。（B）在首次细胞因子注射后第15天进行第二次注射，可在15天内导致脑萎缩。使用1.5 - 2 µm厚的冠状脑切片，以1:500稀释的抗PLP单克隆抗体（MS anti-PLP）进行PLP检测。细胞核经苏木精复染。有关免疫组织化学的详细信息，请参见Blakemore37。比例尺 = 500 µm。请点击此处查看该图的放大版本。

啮齿类动物饲养装置；用于动物行为研究的垫料笼具；实验环境。
图8：经改造的笼具，用于防止动物自行拔除导管。 在标准笼具中，网格上的饲料架空间靠近笼底，形成一个危险的狭窄区域，容易导致导管与网格缠绕，从而增加导管被拔除的风险。为避免此情况，需对笼具进行改造。该狭窄空间已用一块透明板封堵，同时仍可观察动物状态。在这些改造后的笼具中，饲料需直接放置于笼内。 请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

本方法使用DA大鼠。若改用小鼠，可能需要使用更小的导管和螺钉。还应注意到，如果使用不同物种或品系，疾病进程、炎症反应以及脱髓鞘程度可能与本文所述情况存在差异。在使用不同小鼠品系的经典EAE模型中已观察到此类差异。例如，来源于大鼠的MOG92-106肽段在A.SW小鼠中引发原发进展型或继发进展型EAE，而在SJL/J小鼠中则诱导出复发-缓解型EAE46。因此，应使用相同品系的动物。既往多项研究也报道了EAE表现中的性别差异24。对于本方案中是否存在此类性别效应，虽可合理预期，但仍需通过进一步实验加以验证。

通过腹腔（IP）注射由 0.02 mg/mL 芬太尼、0.4 mg/mL 咪达唑仑和 0.2 mg/mL 美托咪啶组成的麻醉混合物，用于实施手术。体重为 270 - 300 g 的成年雄性 DA 大鼠通常需要注射约 0.4 - 0.6 mL 该混合物（即，约 1.5 mL/kg），以诱导持续 60 - 90 分钟的麻醉效果。手术结束后，可通过皮下注射解毒剂来拮抗麻醉作用，解毒剂包含 0.07 mg/mL 氟马西尼和 0.42 mg/mL 阿替米唑的生理盐水（0.9% NaCl）溶液。按 1 - 1.5 mL/kg 剂量给药可在 5 分钟内拮抗麻醉作用。 alternatively，也可让动物通过生理代谢自然清除麻醉药物而自发苏醒，但在此情况下，需持续观察动物直至其完全恢复意识。

其他常用于动物手术的麻醉方法，例如腹腔注射氯胺酮和赛拉嗪47或戊巴比妥钠48，或吸入挥发性麻醉剂如异氟烷49和氟烷50，也可考虑用于本实验所述的手术。然而，关键在于选择一种不会干扰预期后续干预措施的麻醉剂。

在免疫和脑内细胞因子注射过程中，使用5%异氟烷进行麻醉。本文所述模型采用大鼠建立，因此所列实验细节专门适用于大鼠。导管植入坐标的选择旨在实现对可能的白质变化的同步分析（导管尖端位于胼胝体）。虽然导管插入部位在前后和外侧位置上可以调整，但选择中央沟时必须避免损伤上矢状窦。

所述方法的另一个特点是同侧和对侧半球的脱髓鞘程度相当，这可能是由于细胞因子混合物通过脑实质液从皮层区域向蛛网膜下腔的生理流动所致51。因此，脱髓鞘在整个大脑皮层的发生是由注射方式而非导管位置引起的，故选择右侧或左侧顶叶皮层在此方面应无实质影响。

该方案使用26 G导管，其尺寸足够小，可避免造成严重的创伤性损伤，同时又足够大，可在实验的长期过程中避免导管尖端堵塞率的增加。当然，导管的植入及其存在本身会引起星形胶质细胞和小胶质细胞的活化，这在仅接受导管植入的对照动物中也同样存在；然而，与注射细胞因子的动物相比，这种活化程度较轻。43 为避免对后续分析产生任何干扰，我们使用了由聚醚醚酮（PEEK）制成的磁共振成像兼容导管。

事实上，采用所述方法在同侧和对侧区域产生的脱髓鞘深度相似。这表明导管插入深度/长度可能对皮层脱髓鞘的模式和范围影响不大。因此，可考虑调整导管长度以减小导管引起的损伤体积。然而，导管长度显著缩短可能导致皮层脱髓鞘程度略有减轻，但只有通过专门针对导管长度进行的实验才能得出明确结论。

该模型的一个优势在于，植入的导管可实现对皮层给药的潜在治疗剂进行测试 通过 在治疗设置中，可在组织学可检测到的皮层脱髓鞘达到峰值时或之后（第15天或更晚）给予治疗药物，以促进髓鞘再生；而在预防性治疗设置中，则是在免疫接种后、细胞因子注射前给药。因此，治疗药物给药时间的选择将取决于具体的研究问题及所关注的药物。

导管植入后，应将动物单独饲养在改良的（最好是高顶的）笼具中，以防止其在研究结束前拔除导管（图8）。动物有时可能会拧开带有入口的导管帽，尽管这种情况很少发生。应每天观察动物，若发现导管帽脱落，需及时更换新的导管帽，以避免在无入口的情况下导致导管尖端堵塞，并确保脑内注射时药物能准确递送至脑实质。动物最早可在导管植入术后2周进行免疫，以确保血脑屏障已充分愈合并闭合。

免疫后应检测血清中抗MOG抗体滴度。剂量反应实验表明，在成年雄性DA大鼠中，使用5 µg MOG1-125（溶于IFA中）免疫可在4周内产生充分的免疫反应。抗体滴度达到5,000 µg/mL或更高即为足够，但实际结果将取决于多种因素，包括MOG抗原的制备方式以及动物品系等，因此需根据具体情况单独确定。应避免使用过高的抗原剂量，以防在注射细胞因子之前即出现典型的EAE表型，表现为后肢瘫痪。

每只动物免疫接种5 µg重组髓鞘少突胶质细胞糖蛋白（rMOG1-125），该蛋白用200 µL不完全弗氏佐剂（IFA）乳化。由于在制备过程中注射器内会损失部分乳剂，因此建议为每只动物准备略多于该剂量的量。我们使用的重组MOG为来源于大鼠MOG N端的（1-125）片段，该蛋白在Escherichia coli中表达，随后通过螯合层析纯化至均一，溶于6 M尿素中，并对磷酸盐缓冲液（PBS）透析以获得生理状态的制剂52,53。然而，也可使用 commercially available MOG。

其他抗原制剂，如 MOG1-116、MOG35-55 或 PLP139-151，已被用于多种实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）模型中，已知抗原类型和动物品系的差异可在这类模型中诱导出不同的疾病表型20。这些抗原制剂尚未在 DA 大鼠中进行测试，若优先使用这些制剂而非 rMOG1-125，可能诱导出与本文所述不同的疾病表型或组织病理学结果。

在进行脑内注射前，需准备一根与导管等长的连接套管。可通过使用模板导管进行组装，并将其切割至相同尺寸（长度为2 mm）（图4）。在细胞因子注射过程中，必须确保连接套管内无气泡；由于注射体积仅为2 µL，即使套管尖端存在微小气泡，也会显著减少成功注入脑内的液体量。为此，应在泵持续运行的状态下，待套管尖端出现逐渐增大的液滴时再插入套管。插入套管后，将连接器拧接到导管上，注意避免过度拧紧，以防损坏导管上端尖部，否则将导致注射后难以重新盖紧。采用0.2 µL/min的注射速度，以避免注射引起的组织损伤。此外，缓慢注射结合注射后20分钟的等待时间，可确保注入液体扩散至组织间液并有效引流至脑脊液（CSF）。随后应缓慢拔出套管，以避免产生真空效应。

本方法涉及外科手术干预，因此需要具备立体定位存活手术操作能力的人员。直接接触动物的人员应接受过相应的动物实验培训课程。本方案其余部分可由合格的实验室成员完成。

该方法旨在诱导大脑皮层发生炎症触发的脱髓鞘，但并不能复制人类多发性硬化症（MS）的全部特征（例如，局灶性炎性白质病变的发生，这是人类MS的典型特征）。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者谨此感谢格拉茨医科大学生物医学研究所全体工作人员提供的帮助与合作，同时感谢 Christopher John Wrighton 对手稿的校对。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
成年雄性Dark Agouti大鼠（300 ±25 g） 
芬太尼Hameln pharma plus，德国 以枸橼酸芬太尼形式提供，50 µg/ml
咪达唑仑ERWO Pharma，奥地利500390175 mg/ml
美托咪定 Orion Pharma，芬兰以盐酸美托咪定形式提供，1 mg/ml
氟马西尼 Roche，瑞士0.1 mg/ml
阿替美唑 Orion Pharma，芬兰以盐酸阿替美唑形式提供，5 mg/ml
10%聚维酮碘复合物 Mundipharma，奥地利
牙科水泥 Heraeus Kulzer，德国6603 7633
生理盐水溶液 Fresenius Kabi，奥地利0.9% NaCl
磷酸盐缓冲液（PBS）Sigma-Aldrich，德国P3813
异氟烷 AbbVie，奥地利
润滑性眼药水 Thea Pharma，奥地利
70%乙醇Merck，德国1070172511将无水乙醇用ddH2O稀释配制成70% v/v
2.5%恩诺沙星Bayer，德国预防性抗生素 
卡洛芬Pfizer，美国镇痛药，50 mg/ml 
吐温-20 Sigma-Aldrich，德国P9416
戊巴比妥 Richter Pharma，奥地利戊巴比妥钠，400 mg/ml
干扰素γ PeproTech，美国 400-20
肿瘤坏死因子αR&D Systems，美国510-RT-050/CF
rMOG1-125瑞典卡罗林斯卡研究所分子医学中心自制产品重组大鼠髓鞘少突胶质细胞糖蛋白，N端第1-125位氨基酸，亦可商业购买：AnaSpec，AS-55152-500，美国
抗MOG抗体 Ana Spec/Kaneka Corporation，日本AS-555157ELISA试剂盒标准品；Ana Spec/Kaneka  
不完全弗氏佐剂’s adjuvant Sigma-Aldrich，德国 F5506
辣根过氧化物酶标记的抗大鼠IgG二抗 Ana Spec/Kaneka Corporation，日本AS-555157ELISA试剂盒中的二抗；Ana Spec/Kaneka Corporation
牛血清白蛋白 Sigma-Aldrich，德国A9576
过氧化物酶底物溶液Vector Laboratories，美国SK-45000
立体定位仪 David Kopf Instruments，美国
适用于MRI的导管 PlasticsOne，美国8IC315GPKXXC
假性套管 PlasticsOne，美国8IC315DCNSPC
适用于MRI的塑料螺钉 PlasticsOne，美国8L080X093N01
连接套管 PlasticsOne，美国8IC313CXSPCC
带2 mm尖端的螺丝刀
带柔性轴延长装置的钻机 Proxxon，德国NO 28 472，NO 28 706，NO 28 620，  
圆形钻头，0.5 mm Hager & Meisinger，德国 REF310 104 001 001 009
螺旋钻头，1.3 mm Hager & Meisinger，德国 REF350 104 417 364 013
手术刀片 Braun，德国BB510
手术刀柄 Fine Science Tools，德国91003-12
棉签涂抹器 Henry Schein Medical，奥地利900-3155
手术剪刀Fine Science Tools，德国14101-14，14088-10 
手术镊子Fine Science Tools，德国11002-12，11251-35
动脉夹 Fine Science Tools，德国18050-35
恒温加热毯 TSE systems，德国
红外灯Beurer，德国616.51
牙科光固化灯 桂林啄木鸟医疗器械有限公司，中国
可吸收缝线 Johnson & Johnson，比利时V792E
可编程注射泵 World Precision Instruments，美国AL-1000
检查手套
手术服
电动剃须刀Aesculap，德国GT420
挥发性麻醉气体蒸发器 Rothacher Medical，瑞士CV 30-301-D
挥发性麻醉气体蒸发器用氧气源Air Liquide，奥地利19,113
挥发性麻醉诱导舱 Rothacher Medical，瑞士PS-0347
大鼠用麻醉面罩 Rothacher Medical，瑞士PS-0307-A
1 ml注射器 Codan，丹麦REF 62.1612
26号注射针头 Braun，德国4657683
20号针头，用于细胞因子注射和免疫 Braun，德国4657519
鲁尔锁接头玻璃注射器 Poulten & Graf，德国7.140-37
三通阀 Becton Dickinson，瑞典394600
96孔板 Thermo Fisher Scientific，美国442404
酶标仪 Cole-Parmer，美国EW-1396-00
37°C培养箱Kendro，德国50042301
微量移液器 Gilson，美国F167350

参考文献

  1. MS Prevalence. National Multiple Sclerosis Society. , Available from: http://www.nationalmssociety.org/About-the-Society/MS-Prevalence (2017).
  2. Berkovich, R. Treatment of acute relapses in multiple sclerosis. Neurotherapeutics. 10 (1), 97-105 (2013).
  3. Kalincik, T. Multiple Sclerosis Relapses: Epidemiology, Outcomes and Management. A Systematic Review. Neuroepidemiology. 44 (4), 199-214 (2015).
  4. Feinstein, A., Freeman, J., Lo, A. C. Treatment of progressive multiple sclerosis: what works, what does not, and what is needed. The Lancet Neurology. 14 (2), 194-207 (2015).
  5. Montalban, X., et al. Ocrelizumab versus Placebo in Primary Progressive Multiple Sclerosis. The New England Journal of Medicine. 376 (3), 209-220 (2017).
  6. Dyment, D. A., Ebers, G. C., Sadovnick, A. D. Genetics of multiple sclerosis. The Lancet Neurology. 3 (2), 104-110 (2004).
  7. Ascherio, A. Environmental factors in multiple sclerosis. Expert Review of Neurotherapeutics. 13, 12 Suppl 3-9 (2013).
  8. Allen, I. V., McQuaid, S., Mirakhur, M., Nevin, G. Pathological abnormalities in the normal-appearing white matter in multiple sclerosis. Neurological Sciences. 22 (2), 141-144 (2001).
  9. Kutzelnigg, A., et al. Cortical demyelination and diffuse white matter injury in multiple sclerosis. Brain. 128 (11), 2705-2712 (2005).
  10. Kutzelnigg, A., Lassmann, H. Cortical lesions and brain atrophy in MS. Journal of the Neurological Sciences. 233 (1-2), 55-59 (2005).
  11. Lucchinetti, C. F., et al. Inflammatory cortical demyelination in early multiple sclerosis. The New England Journal of Medicine. 365 (23), 2188-2197 (2011).
  12. Peterson, J. W., Bo, L., Mork, S., Chang, A., Trapp, B. D. Transected neurites, apoptotic neurons, and reduced inflammation in cortical multiple sclerosis lesions. Annals of Neurology. 50 (3), 389-400 (2001).
  13. Kutzelnigg, A., Lassmann, H. Cortical demyelination in multiple sclerosis: a substrate for cognitive deficits. Journal of the Neurological Sciences. 245 (1-2), 123-126 (2006).
  14. Procaccini, C., De Rosa, V., Pucino, V., Formisano, L., Matarese, G. Animal models of Multiple Sclerosis. European Journal of Pharmacology. 759, 182-191 (2015).
  15. Kipp, M., Nyamoya, S., Hochstrasser, T., Amor, S. Multiple sclerosis animal models: a clinical and histopathological perspective. Brain Pathology. 27 (2), 123-137 (2017).
  16. Lebar, R., Lubetzki, C., Vincent, C., Lombrail, P., Boutry, J. M. The M2 autoantigen of central nervous system myelin, a glycoprotein present in oligodendrocyte membrane. Clinical and Experimental Immunology. 66 (2), 423-434 (1986).
  17. Linington, C., Bradl, M., Lassmann, H., Brunner, C., Vass, K. Augmentation of demyelination in rat acute allergic encephalomyelitis by circulating mouse monoclonal antibodies directed against a myelin/oligodendrocyte glycoprotein. The American Journal of Pathology. 130 (3), 443-454 (1988).
  18. Panitch, H., Ciccone, C. Induction of recurrent experimental allergic encephalomyelitis with myelin basic protein. Annals of Neurology. 9 (5), 433-438 (1981).
  19. Tuohy, V. K., Sobel, R. A., Lees, M. B. Myelin proteolipid protein-induced experimental allergic encephalomyelitis. Variations of disease expression in different strains of mice. The Journal of Immunology. 140 (6), 1868-1873 (1988).
  20. Stromnes, I. M., Goverman, J. M. Active induction of experimental allergic encephalomyelitis. Nature Protocols. 1 (4), 1810-1819 (2006).
  21. Stromnes, I. M., Goverman, J. M. Passive induction of experimental allergic encephalomyelitis. Nature Protocols. 1 (4), 1952-1960 (2006).
  22. Mendel, I., Kerlero de Rosbo, N., Ben-Nun, A. A myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide induces typical chronic experimental autoimmune encephalomyelitis in H-2b mice: fine specificity and T cell receptor V beta expression of encephalitogenic T cells. European Journal of Immunology. 25 (7), 1951-1959 (1995).
  23. McRae, B. L., et al. Induction of active and adoptive relapsing experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) using an encephalitogenic epitope of proteolipid protein. Journal of Neuroimmunology. 38 (3), 229-240 (1992).
  24. Bebo, B. F., Vandenbark, A. A., Offner, H. Male SJL mice do not relapse after induction of EAE with PLP 139-151. Journal of Neuroscience Research. 45 (6), 680-689 (1996).
  25. Oliver, A. R., Lyon, G. M., Ruddle, N. H. Rat and human myelin oligodendrocyte glycoproteins induce experimental autoimmune encephalomyelitis by different mechanisms in C57BL/6 mice. The Journal of Immunology. 171 (1), 462-468 (2003).
  26. Scheld, M., et al. Neurodegeneration Triggers Peripheral Immune Cell Recruitment into the Forebrain. The Journal of Neuroscience. 36 (4), 1410-1415 (2016).
  27. Chanaday, N. L., Roth, G. A. Microglia and astrocyte activation in the frontal cortex of rats with experimental autoimmune encephalomyelitis. Neuroscience. 314, 160-169 (2016).
  28. Pomeroy, I. M., Matthews, P. M., Frank, J. A., Jordan, E. K., Esiri, M. M. Demyelinated neocortical lesions in marmoset autoimmune encephalomyelitis mimic those in multiple sclerosis. Brain. 128 (11), 2713-2721 (2005).
  29. Merkler, D., et al. Differential macrophage/microglia activation in neocortical EAE lesions in the marmoset monkey. Brain Pathology. 16 (2), 117-123 (2006).
  30. Storch, M. K., et al. Cortical demyelination can be modeled in specific rat models of autoimmune encephalomyelitis and is major histocompatibility complex (MHC) haplotype-related. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 65 (12), 1137-1142 (2006).
  31. Ludwin, S. K. Central nervous system demyelination and remyelination in the mouse: an ultrastructural study of cuprizone toxicity. Laboratory Investigation. 39 (6), 597-612 (1978).
  32. Skripuletz, T., et al. Cortical demyelination is prominent in the murine cuprizone model and is strain-dependent. The American Journal of Pathology. 172 (4), 1053-1061 (2008).
  33. Norkute, A., et al. Cuprizone treatment induces demyelination and astrocytosis in the mouse hippocampus. Journal of Neuroscience Research. 87 (6), 1343-1355 (2009).
  34. Acs, P., et al. 17beta-estradiol and progesterone prevent cuprizone provoked demyelination of corpus callosum in male mice. Glia. 57 (8), 807-814 (2009).
  35. Pott, F., et al. Cuprizone effect on myelination, astrogliosis and microglia attraction in the mouse basal ganglia. Brain Research. 1305, 137-149 (2009).
  36. Jeffery, N. D., Blakemore, W. F. Remyelination of mouse spinal cord axons demyelinated by local injection of lysolecithin. Journal of Neurocytology. 24 (10), 775-781 (1995).
  37. Blakemore, W. F. Ethidium bromide induced demyelination in the spinal cord of the cat. Neuropathology and Applied Neurobiology. 8 (5), 365-375 (1982).
  38. Mason, J. L., et al. Oligodendrocytes and progenitors become progressively depleted within chronically demyelinated lesions. The American Journal of Pathology. 164 (5), 1673-1682 (2004).
  39. Franco, P. G., Silvestroff, L., Soto, E. F., Pasquini, J. M. Thyroid hormones promote differentiation of oligodendrocyte progenitor cells and improve remyelination after cuprizone-induced demyelination. Experimental Neurology. 212 (2), 458-467 (2008).
  40. Lassmann, H., Bradl, M. Multiple sclerosis: experimental models and reality. Acta Neuropathologica. 133 (2), 223-244 (2017).
  41. Kerschensteiner, M., et al. Targeting experimental autoimmune encephalomyelitis lesions to a predetermined axonal tract system allows for refined behavioral testing in an animal model of multiple sclerosis. The American Journal of Pathology. 164 (4), 1455-1469 (2004).
  42. Merkler, D., Ernsting, T., Kerschensteiner, M., Bruck, W., Stadelmann, C. A new focal EAE model of cortical demyelination: multiple sclerosis-like lesions with rapid resolution of inflammation and extensive remyelination. Brain. 129, Pt 8 1972-1983 (2006).
  43. Ucal, M., et al. Widespread cortical demyelination of both hemispheres can be induced by injection of pro-inflammatory cytokines via an implanted catheter in the cortex of MOG-immunized rats. Experimental Neurology. 294, 32-44 (2017).
  44. Gardner, C., et al. Cortical grey matter demyelination can be induced by elevated pro-inflammatory cytokines in the subarachnoid space of MOG-immunized rats. Brain. 136, Pt 12 3596-3608 (2013).
  45. Minagar, A., et al. The thalamus and multiple sclerosis: modern views on pathologic, imaging, and clinical aspects. Neurology. 80 (2), 210-219 (2013).
  46. Tsunoda, I., Kuang, L. Q., Theil, D. J., Fujinami, R. S. Antibody association with a novel model for primary progressive multiple sclerosis: induction of relapsing-remitting and progressive forms of EAE in H2s mouse strains. Brain Pathology. 10 (3), 402-418 (2000).
  47. Lifshitz, J., Witgen, B. M., Grady, M. S. Acute cognitive impairment after lateral fluid percussion brain injury recovers by 1 month: evaluation by conditioned fear response. Behavioural Brain Research. 177 (2), 347-357 (2007).
  48. Kabadi, S. V., Hilton, G. D., Stoica, B. A., Zapple, D. N., Faden, A. I. Fluid-percussion-induced traumatic brain injury model in rats. Nature Protocols. 5 (9), 1552-1563 (2010).
  49. Leonard, J. R., Grady, M. S., Lee, M. E., Paz, J. C., Westrum, L. E. Fluid percussion injury causes disruption of the septohippocampal pathway in the rat. Experimental Neurology. 143 (2), 177-187 (1997).
  50. Hare, G. M., et al. Severe hemodilutional anemia increases cerebral tissue injury following acute neurotrauma. Journal of Applied Physiology. 103 (3), 1021-1029 (2007).
  51. Abbott, N. J. Evidence for bulk flow of brain interstitial fluid: significance for physiology and pathology. Neurochemistry International. 45 (4), 545-552 (2004).
  52. Amor, S., et al. Identification of epitopes of myelin oligodendrocyte glycoprotein for the induction of experimental allergic encephalomyelitis in SJL and Biozzi AB/H mice. The Journal of Immunology. 153 (10), 4349-4356 (1994).
  53. Adzemovic, M. Z., Zeitelhofer, M., Hochmeister, S., Gustafsson, S. A., Jagodic, M. Efficacy of vitamin D in treating multiple sclerosis-like neuroinflammation depends on developmental stage. Experimental Neurology. , 39-48 (2013).

重印与许可

标签

通过脑内注射促炎性细胞因子诱导广泛性大脑皮层脱髓鞘的大鼠模型
联系我们
向图书馆推荐

隐私

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。