正常人成纤维细胞在癌基因诱导衰老过程中活性氧与衰老相关分泌表型的定量检测

摘要

细胞内活性氧（ROS）已被证明在细胞衰老的诱导过程中发挥重要作用。本文介绍了一种用于定量细胞衰老过程中ROS水平的高灵敏度检测方法。同时，我们还提供了检测衰老相关分泌表型的实验方案，该表型据称与多种与年龄相关的功能障碍有关。

摘要

细胞衰老被认为是在增殖能力耗尽或暴露于各种应激因素后出现的一种不可逆的生长停滞状态。近年来的研究已将细胞衰老的作用扩展到多种生理过程，包括发育、伤口愈合、免疫监视以及与年龄相关的组织功能障碍。尽管细胞周期阻滞是细胞衰老的关键特征之一，但已有研究表明细胞内活性氧（ROS）生成增加在细胞衰老的诱导过程中也发挥着重要作用。此外，最近的研究发现，衰老细胞可通过一种称为衰老相关分泌表型（SASP）的机制，对邻近细胞和组织产生强烈的旁分泌作用。目前对针对细胞衰老的治疗策略兴趣迅速增长，这凸显了精确理解衰老机制（包括细胞内ROS和SASP）的必要性。本文中，我们描述了利用ROS敏感性荧光染料结合流式细胞术，定量检测H-Ras诱导的细胞衰老过程中细胞内ROS水平的实验方案。此外，我们还介绍了用于分析SASP因子mRNA表达诱导及其分泌的高灵敏度技术。这些方案可应用于多种细胞衰老模型。

引言

50 多年前，Hayflick 和 Moorhead 发现，正常细胞在经过一定次数的分裂后，当其增殖潜能耗尽时，会进入不可逆的生长停滞状态¹。这一现象如今被称为复制性衰老，被认为与机体衰老密切相关²。尽管端粒的进行性缩短被认为是导致复制性衰老的主要原因，但已有研究报道，多种细胞应激（如 DNA 损伤、癌基因激活和氧化应激）可诱导另一种类型的细胞衰老，称为"早熟性衰老"或"应激诱导的衰老"。有趣的是，在 H-Ras 和 BRAF 等癌基因激活时，早熟性衰老表现出强大的抑瘤作用。对小鼠模型和人类组织的研究提供了有力证据，表明细胞衰老的生物标志物主要存在于癌前病变中，这些病变中癌基因 Ras 和 BRAF 被激活，但在由这些病变发展而来的恶性肿瘤中则显著减少^3,4,5。除了在衰老和抑瘤中的作用外，先前的研究还表明，细胞衰老在多种生理过程中发挥作用，包括伤口愈合、组织修复、免疫监视以及胚胎发育⁶。

尽管生长停滞已被广泛研究并作为细胞衰老的一个标志性特征⁷，但大量证据表明，细胞内活....

方案

1. 诱导癌基因诱导的衰老

1. 制备 H-RasV12 逆转录病毒
   1. 在室温下，向 100 mm 培养皿中加入 2 mL 0.001% 多聚赖氨酸/磷酸盐缓冲液（PBS），孵育 5 分钟以包被培养皿。
   2. 使用连接真空泵的玻璃移液管吸除多聚赖氨酸溶液，并加入 2 mL 1× PBS 洗涤培养皿。
   3. 在包被后的培养皿中接种 3 × 10⁶ 个嗜同种型 BOSC-23 包装细胞，使用含 10% 胎牛血清（FBS）和 1% 青霉素/链霉素的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM），于 37 °C、CO₂ 细胞培养箱中培养 1 天。
   4. 次日，按照生产商说明书，使用转染试剂将 2 µg pBabe puro-H-RasV12 DNA 与逆转录病毒包装质粒 DNA（2 µg pGAG/pol 和 0.25 µg pVSVG）共转染，转染时间为 8 小时。
   5. 移除转染培养基，加入 8 mL 新鲜培养基。
   6. 48 小时后，收集含有病毒颗粒的培养基，并在 500 × g 条件下离心 5 分钟，去除细胞碎片。
   7. 使用 0.45 µm 注射器滤器过滤含有 H-Ras 病毒的培养基。
      注意：为确保高效的病毒感染，应避免病毒上清液的反复冻融。为获得最佳感染效率，建议使用当天收集的病毒进行感染。

结果

H-Ras 诱导的衰老示例如图1所示。用 H-RasV12 逆转录病毒感染正常人成纤维细胞 WI-38 后，细胞出现显著的形态学改变（图1B）。此外，如图1C所示，SA β-半乳糖苷酶染色活性在表达 H-RasV12 后显著增强。在 H-RasV12 逆转录病毒感染 6 天后，超过 70% 的细胞呈现 SA β-半乳糖苷酶染色阳性，表明 H-RasV12 的表达可有效诱导 WI-38 细胞发生细胞衰老，这与我们及其他研究团队此前的报道一致^21,22。

图2展示了利用DCF-DA染色分析监测H-Ras诱.......

讨论

本文介绍了在H-Ras诱导的WI-38正常人成纤维细胞衰老过程中监测细胞内活性氧（ROS）水平的方法。利用细胞可渗透性试剂DCF-DA结合流式细胞术，可对活细胞内的ROS水平进行定量测定。DCF-DA进入细胞后，被细胞内酯酶去乙酰化，随后被ROS氧化，生成高度荧光的2',7'-二氯荧光素（DCF）。DCF的荧光信号可通过流式细胞仪的FL1检测器（绿色荧光）进行检测。采用DCF-DA染色法，我们成功检测到H-Ras诱导WI-38正常人成纤维细胞衰老过程中ROS水平的升高。该方法可用于多种细胞衰老模型，以监测ROS水平的变化。除DCF-DA染色外，其他已用于检测ROS诱导的方法还包括检测氧化蛋白的水平²³以及利用ROS依赖性荧光染料进行共聚焦显微镜分析²⁴。因此，建议结合其他方法进一步验证ROS水平的变化。

最近，我们已证明在p53诱导的衰老以及H-Ras诱导的衰老过程中，癌细胞内的活性氧（ROS）水平均升高²¹。细胞内ROS水平的升高早于SA.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
试剂
poly-L-lysine	Sigma-Aldrich	P2636
BOSC 23	ATCC	CRL-11269
FBS	GIBCO	16000-044
青霉素/链霉素	wellgene	LS202-02
PBS	Hyclone	SH30013.02
DMEM	GIBCO	12800-082
OPTI-MEM	GIBCO	31985-070
pBabe puro-H-RasV12	Addgene	1768
pGAG/pol	Addgene	14887
pVSVG	Addgene	1733
Turbofect	Thermo Fisher Scientific	R0531
polybrene	Sigma-Aldrich	H9268	8 mg/mL
嘌呤霉素	Sigma-Aldrich	P8833	2 mg/mL
甲醛	Sigma-Aldrich	F8775
5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖吡喃糖苷（X-gal）	Sigma-Aldrich	B4252
亚铁氰化钾	Sigma-Aldrich	B4252
铁氰化钾	Sigma-Aldrich	P9387
胰蛋白酶-EDTA	wellgene	LS015-01
DCF-DA	Thermo Fisher Scientific	D6883	10 mM
Trizol	Thermo Fisher Scientific	15596026
MMLV 逆转录酶	Promega	M1701
SYBR Green PCR 2x 混合液	Takara	PR820A
随机引物	Promega	C118A
Tween-20	Sigma-Aldrich	P9416
超纯蒸馏水	Invitrogen	10977015
人 IL-6 ELISA 检测试剂盒	PeproTech	#900-TM16
人 IL-8 ELISA 检测试剂盒	PeproTech	#900_TM18
仪器
0.45 μm 注射器滤器	sartorius	16555
封口膜	BEMIS	PM-996
显微镜	NIKON	TS100
流式细胞仪	BD Bioscience	LSR Fortessa
Amicon Ultra-4ml	Merk Millipore	UFC800324
NanoDrop 分光光度计	BioDrop	80-3006-61
实时荧光定量 PCR 系统	Applied Biosystems	ABI Prism 7500
ELISA 酶标仪	Molecular Devices	EMax microplate reader