本文介绍了一种设计和制备斑马鱼胚胎排列模板的方案，随后详细阐述了如何利用该模板将斑马鱼胚胎高通量排列至96孔板中的操作步骤。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
斑马鱼是一种全球公认的淡水生物，广泛应用于发育生物学、环境毒理学以及人类疾病相关研究领域。得益于其独特的特性，包括繁殖力强、胚胎透明、发育快速且同步等优势， 等等。斑马鱼胚胎常用于化学品的大规模毒性评估以及药物/化合物筛选。典型的筛选流程包括成年斑马鱼产卵、胚胎筛选，并将胚胎排列至多孔板中。随后，通过表型观察可相对快速地评估化学物质的毒性或药物/化合物的药效。在上述流程中，胚胎排列是限制通量水平的最耗时且劳动强度最大的步骤之一。本实验方案介绍了一种创新方法，利用3D打印的排列模板结合真空操作技术，以加快这一繁琐步骤。本文详细描述了排列模板的整体设计、具体的实验装置与逐步操作流程，并展示了代表性实验结果。该方法在以斑马鱼胚胎为测试对象的多种研究应用中具有广泛的应用价值。
引言
作为一种常用的模式生物，斑马鱼被广泛应用于医学和毒理学领域1,2,3,4与……相比 体外 平台相比，斑马鱼提供了远超单一或两种细胞类型所能提供的生物学复杂性。除了作为完整的生物体模型外，斑马鱼还具有繁殖力强、胚胎发育快速且同步、器官透明度高等特点，使其在大规模毒性测试或药物/化合物筛选中具有独特优势。5一对成年斑马鱼每周可产生数百枚胚胎，其数量远超其他整体动物模型，因此非常适合高通量筛选。
利用斑马鱼进行典型筛选实验通常涉及大量人工操作，例如成年斑马鱼的产卵、胚胎筛选，以及将胚胎排列至合适的容器中，并通过水体浸没方式进行暴露处理。胚胎发育过程需进行监测，通常以死亡率、孵化率和畸形率等可观察终点作为化学物质毒性的初步判断依据，或作为药物及化合物有效性的初步指标。为加快筛选流程，已有研究探索采用自动成像和计算机辅助图像分析等方法。例如，已将具备高内涵成像能力的显微镜应用于96孔或384孔板中斑马鱼胚胎在不同发育阶段的自动明场或荧光成像6。微流控装置与显微镜联用，可通过调控液流操控斑马鱼幼鱼的位置，实现脑神经元的成像7。相比传统人工操作，这些方法可显著提高图像采集效率。此外，面对大量图像数据的生成，研究人员也开发了图像分析工具以加速数据处理，如Liu et al. 和 Tu et al. 所示8,9。
随着成像和图像分析通量水平的提高，人们逐渐认识到，筛选过程中的限速步骤在于斑马鱼胚胎暴露前的制备流程，这通常意味着将胚胎排列至96孔或384孔板中。为解决这一瓶颈，Mandrell et al.10 和我们团队11此前已开发出基于视觉引导的机器人技术以替代人工操作，但这些仪器较为复杂，且应用此类技术的学习曲线较陡。因此，提供一种易于使用的方法成为进一步提高斑马鱼筛选通量水平的重要因素，也是本研究的主要目标。
在本研究中，我们通过3D打印设计并制作了一种胚胎排列模板。该排列模板可将斑马鱼胚胎捕获至与标准96孔板相匹配的孔中。使用此方法，无需逐个挑选胚胎并将其手动移入各个孔内，而是可一次性完成96个胚胎的捕获与排列，直接将其加载至多孔板中。通过使用该模板及以下操作流程，可显著提高将胚胎排列至多孔板的效率，相较于人工操作，筛选通量至少可提升十倍。下述操作流程包括排列模板的整体设计、斑马鱼产卵、胚胎收集以及排列过程。图1展示了排列模板的整体设计。图2概述了在第3和第4部分中所述模板使用的分步操作流程。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
1. 斑马鱼胚胎排列模板的设计与制备
- 设计一个符合标准96孔板的12×8阵列模板。使用图1A中所示的上部胚胎捕获腔尺寸（另见补充文件）。
- 使用图1B和1D中所示的捕获孔尺寸。
- 使用图1C中所示的底部真空腔尺寸。
- 使用图1B中所示的进气/出气口尺寸。
- 使用精度为0.1 mm的3D打印机打印该模板；推荐使用的树脂材料见材料表。
注：建议使用精度为0.1 mm的3D打印机制造阵列模板（见材料表）。建议模板表面颜色为深灰色或黑色。
2. 斑马鱼胚胎产卵
- 在繁殖前一天，将两对雄性和雌性鱼放入每个交配盒中，用透明塑料隔板将雄鱼和雌鱼隔开。
- 早晨移除隔板，使雄鱼和雌鱼混合。
- 取出雄鱼和雌鱼，使用细网筛收集斑马鱼胚胎，并用250 mL卵水（见材料表）清洗胚胎。
- 将收集的胚胎转移至含有霍尔特弗雷特溶液（见材料表）的培养皿（直径90 mm）中，使用体视显微镜去除死亡和未受精的胚胎。
- 将胚胎置于28.5 °C的培养箱中。受精后4小时（hpf），观察胚胎并移除任何死亡或发育异常的胚胎。此时胚胎已准备好进行下一步操作。
3. 点样模板的制备
- 用 500 mL 去离子水清洗模板 2–3 次，然后放入干燥烘箱（45 °C）中干燥 5 分钟。
- 用一片密封膜将底部腔室封住（图 2，步骤 1）。
- 通过模板底部的出气口连接真空泵。
注意：建议真空泵的最大真空度为 0.1 MPa。需注意所用真空强度。如果负压过强，可在密封膜上剪一个十字形小孔以降低压力。
4. 将斑马鱼胚胎排列至96孔板中
- 使用塑料移液管将约150个胚胎放入模板中，如图2，步骤2所示。
- 将真空泵连接至出气口，以在步骤3.3中由密封膜密封的腔室内产生负压。
- 水平摇动整个模板，直至每个孔中均捕获一个胚胎（图2，步骤3）。
注意：若在胚胎被各孔捕获前霍尔特弗雷特溶液已干涸，请向捕获腔内补充适量霍尔特弗雷特溶液，并重复此步骤。 - 弃去未被捕获在孔中的多余霍尔特弗雷特溶液及胚胎（图2，步骤4）。
- 关闭并断开真空泵的连接。
- 将标准96孔板倒置贴合于模板上（图2，步骤5），同时旋转两者（图2，步骤6）。
- 轻敲模板底部，或将出气口连接至压缩气体除尘罐，以将所有被捕获的胚胎从模板转移至96孔板中（图2，步骤6）。
- 重复步骤4.1至4.8，以制备额外的多孔板。
- 移除密封膜，并用500 mL去离子水自上而下清洗模板3次，以备后续使用。
注意：请勿使用任何有机溶剂（如乙醇）清洁模板。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
图3展示了一个典型的3D打印排列模板。该模板以光敏树脂为原料，通过3D打印机制造而成；表面涂有一层黑色油漆，以增强与胚胎颜色的对比度。96个孔（12×8）的位置设计与标准的96孔板相匹配。类似地，也可采用相同方法设计和制作384孔（24×16）的模板。上方腔室略大于标准96孔板，以实现更好的贴合。模板还设计有凹槽，用于在排列过程中容纳多余的胚胎。
以适中的速度，使用3D打印的阵列模板可在30分钟内制备20块平板，而手动操作仅能制备2至3块平板。 表1 展示了手动、机器人和阵列模板操作之间的比较。 图4 展示了使用3D打印阵列模板排列的平板与手工制备的平板之间的比较。利用该阵列模板，随胚胎转移的液体量极微，也便于后续的暴露实验。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
在本方案中，有两个关键步骤需要特别注意，以确保斑马鱼胚胎阵列用3D打印模板的成功实施。
阵列模板设计中最关键的因素是捕获孔。为确保每个孔中仅捕获一个胚胎，必须仔细考虑捕获孔的直径和深度，以及通孔的直径。推荐的捕获孔直径应为典型胚胎直径（包括绒毛膜）的1.5至2倍之间。捕获孔的深度应不超过典型胚胎直径（包括绒毛膜）的2倍，以避免胚胎在同一个孔内堆叠。通孔的直径应约为典型胚胎直径（包括绒毛膜）的一半，以防止负压将胚胎挤压穿过孔。由于设计较为复杂，建议采用3D打印技术来制备阵列模板。
阵列模板的核心在于将单个胚胎捕获并固定在指定位置，即与96孔或384孔板相匹配的位置。i.e. 为了产生适当的负压，以在不损伤胚胎的前提下将其稳定固定，必须调节真空装置所产生的负压。负压过大可能破坏胚胎，而负压过小则可能导致胚胎无法被有效捕获在孔中。因此，强烈建议在将胚胎转移至多孔板之前，在体视显微镜下观察模板中已被捕获的胚胎。此外，在捕获过程中，胚胎可能会暴露于空气中。若发生此情况，请根据步骤4.3向捕获室中补充霍尔特弗雷特（Hol...
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者已就所述的3D打印模板申请了专利。
致谢
本工作得到了“"1000plan Youth"”计划、同济大学启动资金以及国家自然科学基金项目编号21607115和21777116（Lin）的资助。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 斑马鱼养殖设施 | 上海海生生物科技有限公司 | Z-A-S5 | |
| 交配盒 | 上海海生生物科技有限公司 | ||
| 洗瓶，500 ml | Sangon Biotech | F505001-0001 | |
| 氯化钠 | Vetec | V900058-500G | |
| 氯化钾 | 国药集团化学试剂有限公司 | 10016318 | |
| 氯化钙 | 国药集团化学试剂有限公司 | 20011160 | |
| 碳酸氢钠 | Vetec | v900182-500G | |
| 亚甲基蓝水合物 | TCI | M0501 | |
| 盐酸 | 国药集团化学试剂有限公司 | 10011008 | |
| 海盐 | Instant Ocean | SS15-10 | |
| 移液器 | Fisherbrand | 13-675M | |
| 可控滴加巴斯德移液管 | Fisherbrand | 13-678-30 | |
| 显微镜 | OLYMPUS | SZ61 | |
| 生化培养箱 | 上海一恒科学仪器有限公司 | LRH-250 | |
| 3D 打印机 | UnionTech | Lite600 | |
| 光敏树脂 | UnionTech | UTR9000 | |
| 真空泵 | 上海佑康科学仪器有限公司 | SHB-IIIA | |
| 粘性 PCR 板密封膜 | Solarbio | YA0245 | |
| 96 孔板 | Costar | 3599 | |
| 8 通道多通道移液器 30 - 300 μl | Eppendorf | 3122000.051 | |
| 压缩气体除尘器 | 上海展图化工有限公司 | ST1005 | |
| 去离子水 | Thermo | GenPure Pro UV/UF | |
| 干燥烘箱 | 上海一恒科学仪器有限公司 | BPG-9106A | |
| 系统用水 | 来自设施’s 水系统的水 | ||
| 卵水 | 在 1 L 去离子水中稀释 60 mg “Instant Ocean” 海盐和 0.25 mg/L 亚甲基蓝 | ||
| Holtfreter’s 溶液 | 将 7.0 g 氯化钠 (NaCl)、0.4 g 碳酸氢钠 (NaHCO3)、0.1 g 氯化钾 (KCl)、0.235 g 氯化钙 (CaCl2.2H2O) 溶解于 1.9 L 去离子水中。用 HCl 调节 pH 至 7，并用去离子水定容至 2 L |
参考文献
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
- Leslie, M. Zebrafish larvae could help to personalize cancer treatments. Science. 357 (6353), 745-745 (2017).
- Lin, S., et al. Understanding the Transformation, Speciation, and Hazard Potential of Copper Particles in a Model Septic Tank System Using Zebrafish to Monitor the Effluent. ACS Nano. 9 (2), 2038-2048 (2015).
- Lin, S., et al. Aspect ratio plays a role in the hazard potential of ceo2 nanoparticles in mouse lung and zebrafish gastrointestinal tract. ACS Nano. 8 (5), 4450-4464 (2014).
- Baraban, S. C., Dinday, M. T., Hortopan, G. A. Drug screening in Scn1a zebrafish mutant identifies clemizole as a potential Dravet syndrome treatment. Nature Communications. 4, (2013).
- Lin, S., et al. High content screening in zebrafish speeds up hazard ranking of transition metal oxide nanoparticles. ACS Nano. 5 (9), 7284-7295 (2011).
- Kuipers, J., Kalicharan, R. D., Wolters, A. H. G., van Ham, T. J., Giepmans, B. N. G. Large-scale Scanning Transmission electron microscopy (nanotomy) of healthy and injured zebrafish brain. Journal of Visualized Experiments. (111), (2016).
- Liu, R., et al. Automated Phenotype Recognition for Zebrafish Embryo Based In vivo High Throughput Toxicity Screening of Engineered Nano-Materials. PLoS One. 7 (4), (2012).
- Tu, X., et al. Automatic Categorization and Scoring of Solid, Part-Solid and Non-Solid Pulmonary Nodules. in CT Images with Convolutional Neural Network. Scientific Reports. 7, 8533(2017).
- Mandrell, D., et al. Automated zebrafish chorion removal and single embryo placement: optimizing throughput of zebrafish developmental toxicity screens. Journal of Laboratory Automation. 17 (1), 66-74 (2012).
- Lin, S., Zhao, Y., Nel, A. E., Lin, S. Zebrafish: An in vivo model for nano EHS studies. Small. 9 (9-10), 1608-1618 (2013).
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
