频繁采集小鼠尾尖血样以评估脉动性黄体生成素分泌

摘要

本文介绍了一种在自由活动的小鼠中进行尾尖采血以频繁采集样本的实验方案。该方法可用于评估促黄体生成素脉冲式分泌的模式，也可根据需要调整用于分析其他循环因子。

摘要

在许多内分泌系统中，循环因子或激素并非持续释放，而是作为离散脉冲在释放因子的作用下分泌。单次采样测量无法充分揭示脉冲式分泌激素在正常生理状态或调节紊乱状态下的分泌模式所具有的生物学意义。促黄体生成素（LH）由垂体前叶促性腺激素细胞合成 细胞并以脉冲式分泌，因此需要频繁采集血样以评估脉冲情况。由于近期高灵敏度黄体生成素（LH）检测方法的开发以及频繁采集小体积样本技术的进步，这种情况在小鼠中才得以实现，该技术最初由 Steyn 及其同事描述。¹ 本文介绍了一种在充分适应性操作处理的基础上，从小鼠外周血中频繁采集血样以检测黄体生成素（LH）脉冲式分泌的实验方案。本方案详细描述了延长的适应性驯化周期，可实现对LH在数小时内强健且连续脉冲分泌模式的准确评估。在该方案中，通过剪切小鼠尾尖获取血样 使用手持移液器从尾部采集血液。对于去势小鼠脉冲性黄体生成素（LH）的评估，需每隔5-6分钟连续采样，持续90-180分钟。重要的是，在经过充分的抓握适应训练并尽量减少环境应激因素的前提下，可在清醒、自由活动的小鼠中成功采集血液并检测到显著的LH脉冲。充分的适应训练可在采血前4-5周内完成。本方案强调了方法学上的改进，以确保在小鼠这一神经内分泌研究中的重要动物模型中，连续数小时采集全血样本，用于分析脉冲性LH分泌模式。

引言

哺乳动物的性腺功能依赖于垂体分泌的促性腺激素，即黄体生成素（LH）和卵泡刺激素（FSH）。促性腺激素以脉冲式或激增式模式分泌，这是对下丘脑分泌的促性腺激素释放激素（GnRH）的响应。LH和FSH的合成与分泌受到多种分子的内分泌、旁分泌和自分泌作用的调控，这些分子包括下丘脑的GnRH、性腺类固醇激素以及激活素-抑制素-卵泡抑素系统，同时还受到包括应激和能量平衡在内的多种生理状态的影响。²

血液中黄体生成素（LH）的脉冲式分泌模式源于LH向外周血的相对突然释放，随后呈近似指数形式被清除。该模式的重要特征包括每次LH释放的频率以及LH反应的幅度，这两者部分由促性腺激素释放激素（GnRH）的释放所决定。由于难以采集下丘脑-垂体门脉血以测量脉冲式GnRH分泌，因此通常通过采样和测定LH来 间接反映GnRH对下丘脑-垂体-性腺轴的调控作用。因此，LH脉冲的频率和幅度中包含了关键的生理信息，而这些信息无法通过单次采样获得。

由于较大的血容量以及对频繁采血的耐受性，脉冲式黄体生成素（LH）分泌的分析在历史上仅限于大型哺乳动物（如人类、灵长类和绵羊）。在啮齿类动物中，频繁采血仅限于大鼠，并通过留置心房导管实现^3,4。由于小鼠具有相对低廉的成本，并且易于进行遗传操作（例如 cre-lox、CRISPR）和复杂神经环路操控（例如 光遗传学、化学遗传学），因而成为一种极具吸引力的模式生物；然而，直到最近，仍难以实现对小鼠进行频繁采血并随后检测LH浓度。这一重大技术突破由Steyn及其同事率先实现¹。自此以后，多个实验室已开始采用频繁采血结合超敏LH检测方法，在多种实验范式中评估小鼠的脉冲式LH分泌^5,6,7,8,9。需要指出的是，建立一种从小鼠体内获取多份血液样本的实用方法，已有至少40年的研究历程¹⁰ ，期间经历了多次技术改进^11,12。

黄体生成素脉冲模式的评估（即 频率和振幅）代表了在这一遗传学上易于操作的动物模型中监测基础促性腺激素分泌的重要改进。传统上，小鼠的黄体生成素（LH）浓度是通过单次血液样本测定的。单点取样的一个缺陷在于数据变异较大，因为LH浓度在每次脉冲期间天然波动。另一个缺陷是，孤立的测量本质上会遗漏LH脉冲分泌模式所传递的关键信息。因此，一种能够在自由活动、无束缚的小鼠（仅在采样时进行轻柔操作）中频繁采集血液样本的方法，将提供更丰富的信息，对研究脉冲式激素调控的众多实验室具有重要价值。

在此，我们介绍一种从清醒、未束缚的小鼠中频繁采集（每6分钟一次）血液样本的实验方案。重要的是，本方案包含了一项操作适应性训练流程，可使小鼠 稳健且连续的检测 在一段时间内采集全血样本，以检测促黄体生成素（LH）的脉冲式分泌，并评估急性刺激前后的变化，例如对固定和束缚所致心理社会应激的反应。此前已有文献报道过一种用于测定全血样本中LH浓度的有效检测方法；¹ 本方案重点介绍一种用于采集黄体生成素（LH）脉冲测定所需血样的方法。

方案

本文所述方法符合美国国立卫生研究院动物护理与使用指南，并已获得加利福尼亚大学圣地亚哥分校机构动物护理与使用委员会的批准。

1. 适应性处理

1. 操作流程
   1. 将小鼠笼盒放入生物安全柜中。取出第一只小鼠并置于合适的表面上（例如 生物安全柜内的一个干净笼盒盖）
   2. 用一只手的拇指和食指轻轻抓住小鼠尾根部，将其固定在工作台面上。然后，用另一只手的拇指和食指从尾根向尾尖方向，沿腹面牢固地摩擦尾部。重复此摩擦动作6次（即 1 套），然后将小鼠放回笼中。
   3. 等待6分钟，然后重复步骤1.1.2。
      注意：每只小鼠总共需重复步骤 1.1.2 四次（即 4 组，每组 6 次划动），使每只小鼠在每次操作当天共接受 24 次尾部划动。
2. 每日处理的频率
   1. 从计划采血日前五周开始，至采血日前两周为止，按照步骤1.1所述方法对小鼠进行操作，每周五天（在适应期的最后两周之前，小鼠在周六和周日不进行操作）。
   2. 如果在采样期间的实验处理包括任何额外的操作（例如 在每次抓取操作期间，让小鼠适应这种抓取方式（如抓颈背或腹腔注射）。
      注意：为使动物适应注射操作，可使用钝化针头进行假注射。
   3. 在计划采血日前两周内，按照1.1节所述方法对小鼠进行处理，每周7天持续进行。
   4. 至少在计划采血日前两周，将小鼠两两同笼饲养，以尽量减少采样过程中对小鼠的干扰。

2. 血液采集管的准备

1. 在玻璃瓶中配制超敏LH测定缓冲液：PBS中含0.2%牛血清白蛋白和0.05% Tween-20 [0.2 g KCl，8 g NaCl，1.44 g Na₂HPO₄ （无水），0.24 g KH₂PO₄，超纯水定容至1 L，pH 7.4，过滤并高压灭菌，4°C保存。¹
   注意：超敏LH检测缓冲液体积的配制量可根据样本数量及每个样本所需体积按如下说明（2.2）进行计算 & 讨论
2. 准备血液采集管（0.6 mL 微型离心管）。标记试管，并分装检测缓冲液（每管 57 µL 缓冲液；注意，此体积可能根据采集的血液体积或所需血液与缓冲液的比例而有所调整）。试管可在采样前数天预先准备，于 4°C 保存。

3. 血液采集

1. 血液采集材料的准备
   1. 准备生物安全柜，并在生物安全柜内或附近推车上摆放以下材料：10 µL移液器（设定为3 µL或所需采血体积）、移液器吸头、废弃吸头垃圾桶、计时器、印有动物编号和样本编号的打印表格（用于记录采样信息或动物相关问题）、装有采血管的冰桶、剪刀和小块纱布（2" × 2").
      注意： "计数增加" 使用实验室计时器的一个优点是它没有声音报警功能，从而不会惊扰小鼠
   2. 使用永久性记号笔在每只小鼠尾巴根部做标记，以便在取样时快速识别对应的小鼠。
2. 尾部剪切及采血前准备
   1. 在开始采血前45分钟，将第一只小鼠从笼中取出，放置于生物安全柜内合适的表面上（干净的笼盖效果较好）。
   2. 使用无菌的锋利剪刀，在无菌准备（即用酒精和碘伏擦拭）后，剪除小鼠尾尖端1-2 mm。
      注意：此操作可在清醒动物轻度固定下完成，或在异氟烷麻醉下进行。  此外，可根据当地IACUC的建议提供镇痛处理。
   3. 按照上述方法（1.1.2；通常1-2次划动即可）轻轻划动小鼠尾部，直至尾尖形成血滴。
   4. 使用带有洁净吸头的移液器从尾尖采集 3 µL 血液，随后丢弃带有血液的吸头。
   5. 在将小鼠放回笼子之前，确保出血已经停止。如有必要，用无菌纱布轻轻按压。
   6. 对所有小鼠重复步骤 3.2.1 - 3.2.5。后续血液样本可通过用力按摩小鼠尾部，直至尾尖形成血滴来采集。
      注意：若经过有力挤压后仍未形成血滴，可用浸有生理盐水的纱布轻拭尾部。在采样频率较低的情况下（即采样间隔较长时），更易形成血凝块。 >15 分钟间隔）。一旦静脉中的血块被清除，即可继续采样。
   7. 在此预采血准备期间，每隔6分钟按照上述方法继续从每只小鼠采集3 µL血液，持续约45分钟。弃去所采集的血液及移液器吸头。
3. 采血
   1. 从尾尖采集3 µL血液，方法如上所述。注意确保整个3 µL样本完全吸入移液器吸头中（避免产生气泡或混入垫料污染物）。将血液样本排入已标记的试管中的检测缓冲液中。通过倒置混匀，并将试管放回冰上。
   2. 在将小鼠放回笼子之前，确保出血已停止。如有必要，用无菌纱布轻轻按压。
   3. 对每只小鼠每隔6分钟重复步骤3.3.1–3.3.2，持续至预定的采样时长。密切观察每只动物是否出现痛苦迹象（例如眼睑部分闭合、蜷缩姿势［非其他处理引起］或对操作无反应），必要时终止采样。
      注意：在我们实验室中，因行为痛苦或其他并发症而需要终止采样的情况极为罕见。
   4. 若动物在采血后未被实施安乐死，需确保尾尖处的出血已完全停止。用纸巾擦拭动物笼内壁上洒落的血液（或更换笼具），然后将动物笼放回饲养架中。

4. 样品处理与分析

1. 将血液样本在 -20 °C 下保存至分析前。
   注意：黄体生成素（LH）在全血样本中用分析缓冲液稀释后进行检测；在储存或分析前无需分离血清或血浆。
2. 按照先前所述方法¹，采用超敏 ELISA 检测血液样本，并根据样本体积在分析缓冲液中的稀释倍数进行校正后，以 ng/mL 全血为单位报告检测值。
3. 在数据集中识别 LH 脉冲。根据数据集特点，计算并比较平均脉冲幅度以及脉冲频率（或脉冲间期）。
   注意：已有发表的标准^13,14 和程序^15,16 可用于检测 LH 脉冲。

结果

4只小鼠的代表性LH脉冲模式如图所示 图1 （数据转载自 Yang） 等，2017）。通过频繁采集血液样本测定黄体生成素（LH），以评估对急性心理社会应激挑战的反应。成年雌性C57/Bl6小鼠经卵巢切除后，按照本方案所述方法进行处理并频繁采血。所有动物在前90分钟内采集血液样本，以建立LH脉冲分泌的治疗前基线。在随后的90分钟采样期间，对照组（非应激）动物保留在原笼中，而束缚应激组动物则被放入啮齿类动物束缚装置中，并转移至新笼子单独隔离。对照组动物在整个采样期间表现出清晰明确的LH脉冲。相比之下，束缚引起的心理社会应激迅速且明确地抑制了LH的脉冲式分泌。

讨论

本文介绍了一种从小鼠尾尖频繁采集全血样本以评估促黄体生成素（LH）脉冲式分泌的实验方案。该方案可用于检测小鼠在经历心理社会应激后脉冲式LH分泌的急性变化，也适用于其他急性或慢性干预条件下LH脉冲的评估。

实现可靠且稳健的LH脉冲谱的关键步骤之一是处理适应期。文献中曾推测，处理应激可能影响激素分泌¹⁷ ，但尚未得到明确验证。然而，对近期发表文献中代表性LH脉冲模式的分析清楚表明，充分的处理适应具有显著优势。在早期研究中，采用10天的处理期，LH脉冲出现的时间间隔不规则，并存在较长时间未检测到LH脉冲的阶段¹。自该开创性论文发表以来，文献中逐渐趋向于采用更长的处理周期（i.e. 每日处理持续3或4周）^5,6,8。本文所述方案共包含5周的处理期，但省略了前3个周末的处理，从而在实现...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
生物安全柜	Lab Products Inc	L/F-B
牛血清白蛋白	Sigma	A5403
Tween-20	Sigma	P2287
KCl	Sigma	P9333
NaCl	Sigma	S7653
Na2HPO4（无水）	Sigma	S7907
KH2PO4	Sigma	P5655
超纯水	Millipore		经过纯化和过滤的水
Broome啮齿类动物固定装置	Harvard Apparatus	52-0460	采血过程中非必需，但在获取代表性数据时使用。
DynPeak	n/a	n/a	http://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0039001