小角中子散射实验中用于膜蛋白结构分析的对比度匹配去垢剂 从头算 建模

摘要

本方案演示了如何利用去垢剂反差匹配的小角中子散射技术，获得溶液中去垢剂增溶的膜蛋白的低分辨率ab initio模型及其结构细节。

摘要

位于橡树岭国家实验室高通量同位素反应堆的生物小角中子散射仪器，专门用于研究生物材料、生物燃料加工过程以及仿生材料，涵盖从纳米到微米尺度的结构分析。本文介绍的方法适用于该小角中子散射仪器（以及其他类似仪器），可用于研究膜蛋白（此处为 MmIAP，一种来自 Methanoculleus marisnigri 的膜内天冬氨酰蛋白酶）在胶束形成型去垢剂溶液中的物理性质（即 大小和形状）。其他生物物理表征技术往往受限于无法有效区分去垢剂在蛋白质-去垢剂复合物结构中的贡献。此外，依托生物氘代实验室，可实现大规模培养并表达氘标记蛋白，从而增强来自蛋白质部分的散射信号。尽管该技术无法提供高分辨率的结构细节，但针对膜蛋白的结构知识空白中，仍存在大量可通过该方法研究的重要领域，而无需达到近原子级分辨率。例如，这些研究方向包括寡聚状态的确定、复合物的形成、扰动过程中的构象变化以及折叠/去折叠事件。这些研究均可通过本方法的应用得以顺利实现。

引言

据估计，膜蛋白由所有基因中的约30%编码¹，并构成了现代药物治疗靶点的绝大多数²。这些蛋白执行多种重要的细胞功能³ ，但尽管其数量丰富且功能重要，目前在结构生物信息学研究协作实验室（RCSB）蛋白质数据库中存档的结构中，膜蛋白仅占约1%⁴。由于其部分具有疏水性，膜结合蛋白的结构解析一直极具挑战性^5,6,7

由于许多生物物理技术在测量时需要溶液中具有单一分散性的颗粒，因此从天然膜中分离膜蛋白并将其稳定在模拟天然膜环境的可溶性介质中，已成为近几十年来的研究热点。^8,9,10 这些研究推动了多种新型两亲性组装体系的发展，用于增溶膜蛋白，例如纳米盘（nanodiscs）^11,12,13 、双层微粒（bicelles）^14,15 和两亲聚合物（amphipols）^16,17 。然而，使用去垢剂胶束仍是满足特定蛋白溶解性需求最常见且最直接的方法之一。^{18,19,20,21,22,23,24,25} 遗憾的是，目前尚不存在一种通用的去垢剂或“万能”混合去垢剂能够满足所有膜蛋白的需求；因此，必须针对每种蛋白的独特性质通过实验筛选合适的条件。^26,27

表面活性剂在溶液中的浓度超过其临界胶束浓度时会自发组装，形成称为胶束的聚集体结构。胶束由多个表面活性剂单体（通常为20–200个）组成，其疏水烷基链构成胶束核心，而亲水头部基团则排列在胶束外壳层，朝向水相溶剂。表面活性剂的行为及胶束的形成过程经典地由Charles Tanford在《疏水效应》（The Hydrophobic Effect）一书中进行了描述²⁸ ，常用于膜蛋白研究的表面活性剂所形成的胶束的大小和形状也已通过小角散射技术进行了表征^29,30 。此外，表面活性剂在膜蛋白周围的组织方式也已被研究，通常会形成蛋白-表面活性剂复合物（PDCs），其中表面活性剂分子围绕蛋白排列，结构类似于完整的表面活性剂胶束³¹。

使用去垢剂的一个额外优势在于，可以通过加入其他去垢剂来调控所形成胶束的性质。许多去垢剂表现出理想的混合行为，混合胶束的某些特性甚至可以根据组分及其混合比例进行预测。²² 然而，去垢剂的存在仍可能为生物物理表征带来挑战，因其会贡献整体信号。例如，在X射线和光散射技术中，蛋白-去垢剂复合物（PDC）中的去垢剂信号实际上无法与蛋白质信号区分开来。³² 单颗粒冷冻电子显微镜（cryo-EM）研究通常依赖于被捕获（冷冻）的颗粒；但某些去垢剂或高浓度的去垢剂仍会遮蔽蛋白质的结构细节，并增加背景干扰。³³ 针对解析完整PDC结构（包括去垢剂部分）的替代方法已通过计算手段实现，这些方法旨在重建围绕特定膜蛋白的去垢剂分布。³⁴

对于中子散射而言，胶束中去垢剂的核-壳结构会产生一种影响观测散射的形状因子。幸运的是，可以通过调整溶液组分，使其对总的观测散射无贡献。这种"对比度匹配"过程通过用氘替代氢，使散射长度密度与背景（缓冲液）相匹配来实现。必须审慎选择去垢剂（需有可获得的氘代对应物）及其混合比例。对于去垢剂胶束，可使用具有相同亲水头基但带有氘代烷基链（d-尾而非h-尾）的去垢剂来进行这种替换。由于去垢剂充分混合，³⁵ 其聚集体的散射长度密度为两种组分（h-尾和d-尾）按摩尔分数加权的平均值。当该平均对比度与头基的对比度一致时，均匀的聚集体结构可实现完全匹配，从而消除所有对观测散射的贡献。

本文介绍了一种通过引入烷基链氘代标记但化学性质相同的去垢剂分子，来调控去垢剂胶束中子对比度的实验方案。^19,36,37 该方法可实现胶束核心与壳层的同时完全对比度匹配，这是中子散射技术所独有的能力。^35,38 借助这一显著提升的细节分辨水平，对比度匹配技术能够推动原本难以实现的膜蛋白结构研究。此外，这种对比度匹配策略还可拓展至其他涉及去垢剂的体系，例如聚合物交换反应³⁹和油水分散剂⁴⁰ ，甚至其他增溶剂，如bicelles⁴¹ 、nanodiscs⁴² 或嵌段共聚物⁴³ 。近期已有文献报道了与此文中所述类似的方法，但仅使用单一去垢剂种类，并在其烷基链和/或头部基团上进行部分氘代取代。³⁷ 尽管预期该方法相比本文所介绍的方法可使氢与氘在去垢剂分子中的分布更为随机，但由于可用于取代的位点数量有限，且需要两步法合成去垢剂，因此在实际应用中仍面临额外挑战。

以下方案的步骤1和步骤2通常存在重叠，因为必须在提交高质量提案之前完成初步的实验规划。然而，本文将提案提交视为第一步，以强调该过程应远早于中子实验开始之前启动。还应注意，提案中应体现的一个先决条件是：样品需具备生化和物理表征（包括纯度和稳定性），以证明开展中子研究的必要性。本文不涉及对小角中子散射（SANS）的全面讨论，相关简明而详尽的介绍可参见参考文献 材料表征 由 Kaufmann 等人⁴⁴ 最近出版了一本专注于生物小角溶液散射的综合性教科书。⁴⁵ 进一步推荐阅读见讨论部分。小角散射以所谓的散射矢量 Q 作为描述散射过程的核心物理量。本文采用广泛接受的定义 Q = 4π sin(θ)/λ，其中 θ 为入射束与散射束之间夹角的一半，λ 为中子辐射的波长（单位为埃）。也存在其他定义，可能使用不同的符号（如用“s”表示散射矢量），或在因子 2π 上存在差异，或以纳米替代埃作为单位（另见讨论部分） 图10).

方案

1. 准备并提交中子设施机时及仪器使用申请

1. 查阅在线资源，以确定提供通用用户中子束时间访问权限的中子散射设施，例如橡树岭国家实验室（Oak Ridge National Laboratory, ORNL）。全球中子设施的地图及中子研究相关信息可在线获取。⁴⁶ 请注意，这些设施通常会定期发布项目申请通知，这决定了下一次中子束时间的可用时间。中子可用于多种应用，应查找小角中子散射（SANS）仪器，特别是具备生物样品研究能力的仪器。
2. 利用中子设施提供的资源，协助完成中子束时间申请提案的提交流程。与您所申请仪器相关的中子散射科学家（Neutron Scattering Scientist, NSS）进行咨询。查阅该中子设施关于提案征集、截止日期及提交建议的最新信息；橡树岭的相关信息可在线获取。⁴⁷ 请严格遵循所有指南提交中子束时间申请提案。
3. 若需要氘代蛋白质（见2.2节），请注意中子散射设施通常由专门从事氘代材料制备的实验室和技术支持团队提供支持。如需申请使用橡树岭国家实验室的生物氘代实验室（Bio-Deuteration Lab, BDL），请在提案系统中将BDL选为第二台仪器。SANS提案将由科学评审委员会进行可行性及科学性评审，而BDL的申请仅进行可行性筛查。为协助BDL的可行性评审，请提交一份完整的资料申请表⁴⁸，其中需描述蛋白质表达方案及预估产量（可在线获取表格）。
4. 在中子束时间提案通过同行评审后，应在实验前尽早确认获批的中子束使用日期。确保提案中准确列出所有样品和缓冲液的详细信息及配方，以便顺利通过评审。任何对原定实验计划的修改，包括样品和缓冲液成分的变化，均需及时通知设施方。
   注意：所有变更应尽快与指定的中子散射科学家（NSS）进行讨论。

2. 确定蛋白质测量所需的中子对比度匹配点及必要对比度

1. 收集信息（来自供应商的产品信息、在线数据库、已发表的数值， 等等。) 与去垢剂体系组分的原子组成和体积相关的信息。这些信息用于确定中子散射长度密度（SLDs）以及溶液中的对比度匹配点（CMPs），这对于在磷脂去垢剂胶束（PDC）环境中获得目标膜蛋白的高质量小角中子散射（SANS）数据和结构信息至关重要。文中包含一个表格，总结了常用于膜蛋白生物物理研究的去垢剂的物理性质及其对比度匹配点（表1).
2. 使用网络应用程序 MULCh：用于分析对比度变化数据的模块，确定中子散射长度密度（SLD）⁴⁹ （可在线获取）⁵⁰ 免费提供）。用户手册的链接位于主页上。访问网站并阅读相关文档。 图1 和 图2 为两个相关示例提供对比模块输入与输出的概述。
   注意： 其他可用于计算散射长度密度（SLD）的网站也存在，例如由美国国家标准与技术研究院（NIST）中子研究中心维护的网站。⁵¹
   1. 单击左侧导航窗格中的“Contrast”以打开对比模块。输入项目标题文本，并在下方输入两个组件的详细信息例如， 将去污剂的头部基团和尾部称为“亚基1”和“亚基2”。
   2. 在“分子式”文本框中输入每种组分的分子式。
      注意在“物质类型”下必须选择单选按钮“M”以输入分子式。此外，在分子式中使用字母“X”表示可快速交换的氢原子。若选择相应的单选按钮“P”、“R”或“D”，则可输入蛋白质、RNA或DNA序列。如果亚基内存在多个相同组分，可相应地调整“Nmolecules”的数值。一个实际示例涉及含有两条相同尾链的类脂去垢剂，此时可输入一条尾链的分子式，并将Nmolecules设为2。
   3. 在“体积 (ų)”下方的框中输入每个组分的立方埃体积³）”。使用Tanford公式²⁸ 对于长度为的烷基链 n V_尾部 = 27.4 + n 26.9，用于计算尾部体积的近似值，或从产品信息或文献中已发表的数值获取分子体积。
   4. 输入缓冲液组分的详细信息。使用下拉菜单调整“溶剂中溶解物种的数量”，以增加或删除每个缓冲液组分的行。对于形成胶束的去垢剂，需在去垢剂的临界胶束浓度（CMC）下，将游离的去垢剂单体作为独立的缓冲液组分列出。
   5. 点击“提交”以执行中子对比度计算，并生成结果页面，该页面提供散射长度密度和对比度匹配点的表格，以及用于确定任意给定D百分比下这些参数的公式₂缓冲液中的 O。重点审查散射参数，特别是组件 CMP 的参数。如果匹配点相近（在 10% D 以内）₂当自由胶束浓度较低时，可使用平均临界胶束浓度（CMP）来匹配去垢剂的散射贡献。在大多数情况下，去垢剂头部基团与尾部的CMP差异会超过10–15%，这将在小角中子散射（SANS）数据中产生核-壳型散射因子，从而掩盖仅来自蛋白质的散射信号的直接获取。
3. 评估去垢剂头部基团与尾部之间的对比度。当去垢剂的头部基团与烷基链尾部的对比度匹配不佳时，引入氘代去垢剂可调节特定组分的散射长度密度。大多数情况下，这需要通过掺入具有氘代烷基链的相同去垢剂来形成混合胶束。氘的加入会提高由烷基链尾部形成的胶束核心的散射长度密度。在此情况下，理想的目标是使头部基团壳层的CMP与烷基链核心的CMP近似相等。
   1. 通过确定 h-tail 与 d-tail 混合的适当比例，使去污剂胶束核心的对比度匹配点（CMP）与头部基团壳层的 CMP 大致相等，从而实现头部基团的完全对比度匹配。进行此测定的前提是已知氘代烷基链尾部的 CMP。 commercially-available 的正十二烷基-β-D-麦芽糖苷（DDM）对应物中，所有烷基链上的氢均被氘取代（d25-DDM）。将步骤 2.1 中所述的对比度计算过程重复应用于“d-tail”以替代“h-tail”。
   2. 计算为实现与头部基团 CMP 的对比度匹配所需的 h-tail 与 d-tail 的摩尔比。以下公式可辅助确定该比值：
      CMP_头部 CMP_h-尾 * χ_h-尾 + CMP_d-尾 * χ_d-尾
      其中，CMP 为散射长度密度，χ 为去垢剂头部、h-尾链或 d-尾链组分的体积分数。对于 DDM 的缓冲溶液，将总去垢剂中按重量计 44%（按摩尔计 43%）替换为烷基链氘代的 d25-DDM 时，在 48.5% D 条件下可获得单一的 CMP₂O，适用于头部和尾部组件。
4. 考虑膜蛋白的氘代程度。为了从蛋白中测量到足够的散射信号，蛋白的氘代摩尔百分比（CMP）应至少达到15% D₂O在溶液中远离去垢剂CMP及测量条件时，信号强度随该百分比差异的平方而增加。由于未标记蛋白质的CMP通常出现在约42% D处₂在溶液中（CMP 与许多去污剂的头部基团相似），蛋白质的氘代标记几乎总是必需的。⁵²

3. 表达并纯化目标膜蛋白

1. 制备LB（Luria-Bertani）培养基并培养 大肠杆菌 (大肠杆菌（E. coli） 携带可诱导表达载体以表达目标蛋白序列的细胞。
   1. 制备最小培养基。在H₂O 或 D₂O，溶解7.0 g/L (NH₄)₂SO₄，5.25 g/L Na₂HPO₄，1.6 g/L KH₂PO₄，0.50 g/L 磷酸氢二铵，5.0 g/L 甘油，1.0 mL/L 20% w/v MgSO₄₄·7H₂O，以及1.0 mL/L的Holme微量金属溶液（0.50 g/L CaCl₂）₂·2H₂O，0.098 g/L CoCl₂，0.102 g/L CuSO₄₄，16.7 g/L FeCl₃·6H₂O，0.114 g/L MnSO₄₄·H₂O，22.3 g/L Na₂EDTA·2H₂O 和 0.112 g/L ZnSO₄₄·H₂O^53,54
   2. 使用 H 配制合适的抗生素储备液₂O 或 D₂O.
   3. 使用 H 制备异丙基-β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷储备液₂O 或 D₂O.
   4. 使用0.22微米孔径的瓶顶式真空滤器和注射器滤器，将所有溶液无菌过滤至干燥、无菌的容器中。
2. 适应 大肠杆菌 在扩增以过表达氘代蛋白之前，将细胞转入氘标记的培养基中。
   1. 从溶菌肉汤（Lysogeny Broth, LB）琼脂平板上挑取单菌落，或取冻存的甘油菌种接种于3 mL LB培养基中。在37 °C、250 RPM条件下于摇床培养箱中培养细胞；若需过夜培养，可将温度降至30 °C或更低，以避免菌液过度生长。
      注意： 适应程序可以有所变化。^55,56,57
   2. 当LB培养物在600 nm处的光密度（OD₆₀₀) 约为 1，用 3 mL H 将其稀释 1:20₂O最小培养基中培养至OD₆₀₀ ~1. 使用含有 50%、75% 和 100% D 的最低培养基重复进行 1:20 稀释₂O（或直至达到所需的 D₂O 百分比）。
      注意：随着D₂O含量增加时，生长速率将下降。D之间的关系₂文献中已有关于培养基中氧的同位素百分比及蛋白质中氘取代的报道。^58,59,60
   3. 继续在生物反应器中培养，以提高氘代细胞生物量的产量（图3).
      注意： 生物反应器操作的逐步流程已在其他地方综述。^61,62,63,64
3. 收获并裂解 大肠杆菌 用于膜提取和蛋白质纯化的细胞
   1. 在 4 °C 条件下，以约 6,000 x g 离心约 30–45 分钟，使细胞沉淀。
   2. 将细胞沉淀在冰上用缓冲液浸泡约30分钟以软化。然后，用血清移液管轻轻吹打，或在二维摇床上轻轻摇动，将细胞沉淀重悬于缓冲液中，终浓度约为1克湿细胞质量/10毫升缓冲液。
      注意例如缓冲液为50 mM HEPES（4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸），pH 7.5，含200 mM NaCl并添加蛋白酶抑制剂片。
   3. 在冷却流出液的条件下，使用高压均质机以10,000 psi的压力对重悬细胞进行三次裂解。
      注意： 根据所需的规模，可采用其他裂解方法（例如， 通过法国压榨法或超声处理）。
   4. 在 4 °C 条件下，以约 4,000 - 5,000 × g 离心 15 分钟，沉淀细胞碎片。重复此步骤直至上清液澄清。
   5. 将上一步骤的上清液（含有可溶性组分和膜组分）进行超速离心（约150,000 × g，30–45分钟）。超速离心后的沉淀含有膜组分。
   6. 在大型Dounce匀浆器中重悬膜沉淀，并通过超速离心（步骤3.3.5）再次分离膜组分。重复此步骤至少一次，以去除松散结合的蛋白质。
   7. 在含有适合纯化的去垢剂的缓冲液中，于 4 °C 轻柔摇动孵育约 30 分钟以溶解膜。当悬液由浑浊变为透明时，表明膜已溶解。通过超速离心（约 150,000 × g，离心 30–45 分钟）去除不溶性物质。
      注意： 一种示例缓冲液为 50 mM HEPES，pH 7.5，500 mM NaCl，20 mM 咪唑和 4% (w/v) DDM，用于 Ni 柱纯化²⁺ 亲和层析
4. 按照先前为质子化形式开发的方案纯化蛋白质。
   注意： See Naing 等 用于六组氨酸标签蛋白的纯化示例方案 M. marisnigri JR1 膜内天冬氨酸蛋白酶（d-MmIAP）。⁶⁵ 最终产量约为 1 mg 的氘代样品，来自 5 L 氘代细胞培养物，全部用于 SANS 实验图4).
5. 将纯化后的蛋白质置换到“最终置换缓冲液”中以进行对比度匹配。
   1. 配制 200 mL 含有正确对比度匹配混合物的“最终置换缓冲液”， 例如，20 mM HEPES，pH 7.5，250 mM NaCl，以及0.05%总DDM（0.028% DDM和0.022% d25-DDM）溶于49% D₂O.
   2. 用平衡尺寸排阻色谱柱 >使用快速蛋白液相色谱（FPLC）系统，以3.5.1中的“终交换缓冲液”冲洗2个柱体积（CV）。
   3. 注射样品后，运行层析柱并收集目标蛋白对应的组分。
   4. 将蛋白质浓缩至所需的终浓度（2 - 5 mg/mL）。
      注意： 填充用于小角中子散射（SANS）的1 mm圆柱形石英比色皿需要约300 μL的体积。
   5. 为SANS背景扣除保留一份匹配缓冲液的等分试样。
      注意： 分装样品可直接取自配制好的缓冲液，或理想情况下取自FPLC运行结束时的纯净洗脱组分。

4. 为光束时间做好最终准备并采集小角中子散射数据

1. 在提案获得批准且现场访问权限已获准后，须在指定的机时开始前完成所有必要的培训。这包括出发前的在线培训，以及现场的辐射安全、实验室操作和特定仪器的培训。
   注意：培训要求可能规定首次使用者需提前到达。更多详细信息可在线获取。⁶⁶
2. 装载用于数据采集的样品和缓冲液。
   注意：生物小角中子散射（Bio-SANS）仪器样品环境区域的概览如图5所示。
   1. 将样品和缓冲液装入石英比色皿中。石英比色皿可向仪器科学家或设施方申领。使用凝胶加样吸头以进入大多数样品比色皿的狭窄开口。
   2. 确认光束快门已关闭，然后接近样品环境区域，将石英比色皿放入样品更换器中。记录每个样品比色皿在样品更换器中的位置。
   3. 检查该区域，确保光束路径无任何遮挡物，然后离开样品环境区域并打开光束快门。
      注意：请严格遵守设施的所有规章制度，服从所有公告内容，并听从仪器科学家的建议。样品在暴露于光束后，未经特殊防护措施，不得将其移出光束区域进行操作。在执行此类操作前，请务必咨询放射控制技术人员（RCT）。
3. 执行表格扫描以进行自动数据采集
   1. 通过基于自定义控制LabVIEW软件——谱仪仪器控制环境（SpICE）来操作仪器。请遵循中子散射科学家提供的仪器操作说明。表格扫描操作窗口的概览见图6。
   2. 在相应区域输入所需信息后，启动表格扫描，自动数据采集过程将开始。可通过“表格扫描状态”标签页监控进度。

5. 将SANS数据从2D图像约化为1D图谱

1. 根据记录的扫描编号识别每个样品和缓冲液的数据文件。每次测量将被分配一个唯一的扫描编号。此信息在数据约化过程中有助于识别每个对应的样品和缓冲液配对。
2. 使用 MantidPlot 软件和 Python 脚本进行约化
   1. 中子散射用户将获得访问远程分析集群上数据的账户信息。⁶⁷ 登录远程分析集群，并在命令行中执行“MantidPlot”。图7 和 图8 可辅助完成这些步骤。
   2. 从中子散射科学家处获取用户约化脚本（通常在实验期间完成）；该脚本基于 Python，包含将二维散射图像约化为散射强度随散射角变化的一维图谱 I(Q) 所需的所有校准和标度调整参数。
   3. 在 MantidPlot 中打开提供的用户约化脚本，并将样品和缓冲液配对的相应扫描编号或标识填入适当的列表中。
   4. 执行脚本，以在指定位置生成约化后的四列文本文件（列顺序为 Q、I(Q)、I(Q) 误差、Q 误差）。在 MantidPlot 中右键单击相应的数据工作区，选择“带误差绘图…”以初步检查散射谱线。

6. 分析散射颗粒的结构参数数据

1. 使用安全FTP文件传输将分析服务器上的已处理数据文件转移至本地计算机。可使用FileZilla或CyberDuck等软件完成此操作。有关连接分析服务器文件系统的详细说明和附加信息，请参见analysis.sns.gov登录页面。
2. 下载 ATSAS 软件套件^65,68 （完整的 ATSAS 套件）⁶⁹ 单独的程序⁷⁰ 也可在线获取用于分析SANS数据的工具，即确定结构参数和 从头算 模型
   注意： 可用于生物大分子SANS数据分析的方法有很多。⁴⁵
3. 使用 PRIMUS⁷¹ 用于数据绘图、缓冲液标度调整与扣除，以及Guinier分析。
   1. 启动 ATSAS “SAS 数据分析” 应用程序，并加载与样品和缓冲液配对对应的约化数据文件。
      1. 为正确缩放缓冲液，需在高Q值（Q > 0.5 Å^-1）两个曲线相似且平坦，点击“操作”选项卡下方的“缩放”按钮。系统将应用一个缩放因子，使缓冲液的这两个平坦区域与样品重叠。注意：必须存在合理的物理依据，才能通过缩放缓冲液强度来匹配样品。如果差异较大，请咨询仪器科学家以获取有效的背景扣除方法。^44,45,72
      2. 扩大数据范围以查看所有数据点。点击“Subtract”执行此操作。在图例中右键单击扣除缓冲液后的数据文件，并保存该文件以供后续分析。 图9 概述了“操作”选项卡的使用方法。
   2. 使用“SAS 数据分析”应用程序中的“分析”选项卡，对扣除缓冲液背景后的样品数据进行桂尼尔（Guinier）分析。
      1. 确保在列表中选择了正确的文件，然后点击“回转半径”。点击“Autorg”按钮将自动尝试进行Guinier拟合。
      2. 扩展所用数据范围以包含所有低Q值数据，并通过逐步剔除高Q值数据点来缩小数据范围，直至Qmax*R_g 极限低于1.3。利用残差图验证数据在拟合范围内呈线性。Guinier拟合可得到一个近似的R_g 我₀ 用于散射粒子。
      3. 对拟合区域进行微调，并监测这些数值对拟合所用数据范围的敏感性。 图10A 演示了“回转半径”工具的使用。
4. 在 GNOM 中获取概率分布函数（P(r)）。⁷³ 此处生成的输出文件将用作输入 从头算 建模过程。
   1. 在“分析”选项卡中启动距离分布向导。获得与数据良好拟合的结果对于构建高质量模型至关重要。有关获得精确拟合的更多信息，请参阅综述⁷⁴ 由 Putnam 等人 等
      注意GNOM 程序提供的信息超出了距离分布向导所涵盖的内容。 图10B 演示“距离分布”工具的正确使用方法，以及 图11 展示了一些常见的错误情况。
   2. 确定分子内的最大原子间距 Dmax。
      1. 通过取消勾选强制 Rmax=0 的选项，并输入一个较大的 Dmax 值（例如 150 Å），来估算 Dmax 的数值。P(r) 曲线图中的第一个 x 轴截距即给出该估算值。
      2. 逐步调整该 Dmax 值以及拟合所用数据的范围或拟合所用的数据点数量，以优化 GNOM 对数据的拟合效果及所得的 P(r) 曲线。
   3. 继续优化 GNOM 拟合，并保存具有优良拟合参数的 GNOM 输出文件，以供后续使用 从头算 建模步骤
5. 使用 CRYSON 程序从高分辨率 PDB 模型模拟小角中子散射（SANS）谱图。⁷⁵
   1. 打开程序并选择选项“0”。在弹出的文件浏览器中选择PDB文件名。除指定链的氘代分数和D的分数外，其余均按默认设置，按回车键确认。₂溶剂中的 O 以获得适当的对比度参数。
   2. 通过输入“Y”并在弹出的文件浏览器中选择数据文件，将模型拟合到实验数据集。接受其余默认值后，输出文件将写入PDB文件所在位置。“.fit”文件包含由高分辨率三维模型预测的散射曲线信息。

7. 创建 从头算 小角中子散射数据的模型

注意：ATSAS 软件套件中的 DAMMIF⁷⁶ 和 DAMMIN⁷⁷ 可用于根据 GNOM 输出结果（包含 P(r) 数据，即散射粒子内部原子间距的概率或频率信息）通过模拟退火方法重建虚拟原子模型（DAMs）。这些程序可在批处理模式下运行，也可在 ATSAS-Online 网络服务器上运行。

1. 在“SAS 数据分析”的“分析”选项卡中，单击“Dammif”按钮启动 PRIMUS Shape 向导，并手动选择参数。向导的输入设置如图12所示。
   1. 根据拟合结果（步骤 6.3.2）定义 Guinier 范围，并使用导航按钮进入下一步。根据 P(r) 图（步骤 6.4）定义拟合值，并继续进入下一步。
   2. 为ab initio建模过程提供参数。输入模型输出文件名的前缀（例如，SANSEnvelope），选择“快速”或“慢速”建模模式，输入模型数量（建议为17以保证统计显著性），从可用选项中选择粒子对称性、各向异性及角尺度（若已知）。确保勾选选项，以使用 DAMAVER 对模型进行平均，并使用 DAMMIN 对最终模型进行优化。
   3. 单击“commit”按钮启动建模过程。过程完成后，查看并保存工作目录。
      注意：在普通个人计算机上，单个小蛋白的典型建模过程可能需要数小时。文件在保存前将存储在临时目录中。
2. 在 ATSAS 中使用 SUPCOMB 将最终的 SANS 包络模型与相关的高分辨率结构模型进行叠加和比对。将待拟合至 SANS 包络的高分辨率 PDB 模型副本放入工作目录中。在命令行中执行 SUPCOMB，将两个 PDB 文件名作为参数输入，其中模板结构文件名列在第一位：$ supcomb HiRes.pdb SANSEnvelope.pdb
   注意： 第二个文件名对应的输出文件将被重写为一个新文件，文件名末尾添加“r”，并包含用于与模板结构叠加的新坐标。
3. 使用 PyMOL（pymol.org）——一种三维分子图形可视化程序——查看ab initio建模结果。图13概述了 PyMOL 的操作流程。
   注意： 溶液中生物大分子的小角散射数据结构建模有相应的发表指南。⁷⁸
   1. 启动 PyMOL 程序，打开对应于三维 SANS 包络模型和经 SUPCOMB 对齐的高分辨率结构的 .pdb 文件。
   2. 将 SANS 包络模型以表面形式显示，实现其可视化。单击模型旁边的“S”按钮，选择“Show: As: Surface”。
   3. 将高分辨率蛋白骨架结构以卡通形式显示，实现其可视化。单击该模型旁边的“S”按钮，选择“Show: As: Cartoon”。通过单击“C”按钮并选择“By Chain: Chainbows”，将肽链从 N 端到 C 端以彩虹色显示。
   4. 调整表面表示的透明度以提高可视清晰度。在“Setting”菜单栏中，选择“Transparency » Surface » 40%”。
   5. 将背景设置为白色且非不透明。在“Display”菜单栏中，选择“Background »”，取消勾选“Opaque”选项，并选择“White”以设定背景颜色。
      注意：更多 PyMOL 操作和用途可参考 PyMolWiki.org。

结果

申请实验机时和仪器使用提案时，应清晰传达评审委员会所需的所有信息，以便对所提议的实验进行有效评估。对于缺乏经验的用户，强烈建议与中子科学专家（NSS）进行沟通。NSS 可评估初步可行性，并指导提案提交，以突出实验的可行性、安全性以及产生高影响力科学成果的潜力。提案中应包含研究背景及其科学意义的相关信息；预期获得的新知识，以及该知识将如何推动相关科学领域的现有认知；对拟开展的工作、样品、方法和实验步骤的详细描述；如适用，还应包括团队在该设施以往的研究产出，例如已发表的相关论文和研究成果。用户可通过中子科学用户门户（neutrons.ornl.gov/users）获取有用的资源，例如提案模板以及撰写提案的建议与提示。

实验规划是一个动态过程，通常始于项目申请的初期阶段，但有时可能要到实验开始前才得以完善。然而，请注意，任何显著偏离申请书中描述的变更（包括缓冲液条件或样品组成的更改）都必须在实验开始前获得设施管理部门的批准。

讨论

结构生物学研究人员利用互补的结构技术（如溶液散射）来获取溶液中生物大分子的生化和结构细节（例如整体尺寸和形状）。小角中子散射（SANS）是一种特别有吸引力的技术，可用于测定膜蛋白的低分辨率结构，而膜蛋白正是现代结构生物学和生物化学的核心研究对象。SANS 所需的纯化蛋白量与晶体学实验相当（1 mg/样品）。近年来，与膜蛋白研究相关的高纯度氘代去垢剂在商业上的可获得性不断扩大，使得研究人员能够调控膜蛋白-去垢剂复合物中的氢/氘含量，从而在 SANS 实验中直接记录蛋白信号。若实验成功，仅需数小时采集的数据即可计算出从头（ab initio）分子包络模型。因此，膜蛋白生物化学家、生物物理学家和结构生物学家可便捷地利用 SANS 获得溶液中膜蛋白的珍贵初始三维结构模型，包括与结合伴侣或底物形成的复合物结构；此外，通过 SANS 获得的模型还可用于衍射数据的相位确定。若 SANS 能够常规用于膜蛋白的表征，将对膜蛋白生物化学领域产生变革性影响，并进一步波及从基础结构功能研究到药物发现与开发的广泛领域。利用氘取代实现中子对比度匹配的额外优势，使 SANS 成为研究蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA 或其他生物分子复合物的有力技术，这...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Amicon Ultra MWCO 50KDa 浓缩管	EMD Millipore	UFC905096	实验耗材
二碱式柠檬酸铵	Fisher Scientific	A663	培养基组分
硫酸铵	EMD Millipore	2150	培养基组分
Bioflo 310 生物反应器系统	Eppendorf	M1287-2110	设备
二水氯化钙	Acros	423525000	培养基组分
羧苄西林	IBI Scientific	IB02025	抗生素
氯霉素	EMD Millipore	3130	抗生素
氯化钴(II)	Acros	AC21413-0050	培养基组分
硫酸铜(II)	Acros	AC19771-1000	培养基组分
重水	Sigma-Aldrich	756822	培养基组分
Drierite 气体纯化器	W.A. Hammond Drierite Co. Ltd.	27068
EDTA 二钠盐二水合物	EMD Millipore	4010	培养基组分
Emulsiflex-C3	Avestin	EF-C3	设备
Äkta Purifier UPC100	GE Healthcare		设备
甘油	Sigma-Aldrich	G5516	培养基组分
HEPES	Sigma-Aldrich	H4034
HiPrep 16/60 Sephacryl S-300 HR 柱	GE Healthcare	17116701
咪唑	VWR	97064-622
IPTG	Teknova	I3325
六水三氯化铁	MP Biochemicals	ICN19404590	培养基组分
LB 琼脂（Miller）	Fisher Scientific	BP1425-2
七水硫酸镁	VWR	97062-134	培养基组分
一水硫酸锰(II)	Acros	AC20590-5000	培养基组分
MaxQ 6000 恒温/制冷摇床	Thermo Scientific	SHKE6000-7	设备
n-十二烷基-d25-β-D-麦芽糖吡喃糖苷	Anatrace	D310T
n-十二烷基-β-D-麦芽糖吡喃糖苷	Anatrace	D310A
磷酸二氢钾	VWR	97062-346	培养基组分
RC 6 Plus 离心机	Thermo Scientific Sorvall	46910	设备
SIGMAFAST 蛋白酶抑制剂混合片剂（无 EDTA）	Sigma-Aldrich	S8830
氯化钠	Sigma-Aldrich	S3014
氢氧化钠	Sigma-Aldrich	795429
磷酸氢二钠	Sigma-Aldrich	S7907	培养基组分
带 0.2µm PES 膜的无菌 25 mm 注射器滤器	VWR	28145-501	实验耗材
带 0.2µm PES 膜的无菌一次性瓶顶滤器	Thermo Scientific	596-4520	实验耗材
Superdex 200 10/300 GL	GE Healthcare	17517501
Superose-12 10/300 GL 柱	GE Healthcare	17517301
Ultrospec 10 细胞密度计	GE Healthcare	80211630	设备
一水硫酸锌	Acros	AC38980-2500	培养基组分