小角中子散射实验中用于膜蛋白结构分析的对比度匹配去垢剂 从头算 建模

摘要

本方案演示了如何利用去垢剂反差匹配的小角中子散射技术，获得溶液中去垢剂增溶的膜蛋白的低分辨率ab initio模型及其结构细节。

摘要

位于橡树岭国家实验室高通量同位素反应堆的生物小角中子散射仪器，专门用于研究生物材料、生物燃料加工过程以及仿生材料，涵盖从纳米到微米尺度的结构分析。本文介绍的方法适用于该小角中子散射仪器（以及其他类似仪器），可用于研究膜蛋白（此处为 MmIAP，一种来自 Methanoculleus marisnigri 的膜内天冬氨酰蛋白酶）在胶束形成型去垢剂溶液中的物理性质（即 大小和形状）。其他生物物理表征技术往往受限于无法有效区分去垢剂在蛋白质-去垢剂复合物结构中的贡献。此外，依托生物氘代实验室，可实现大规模培养并表达氘标记蛋白，从而增强来自蛋白质部分的散射信号。尽管该技术无法提供高分辨率的结构细节，但针对膜蛋白的结构知识空白中，仍存在大量可通过该方法研究的重要领域，而无需达到近原子级分辨率。例如，这些研究方向包括寡聚状态的确定、复合物的形成、扰动过程中的构象变化以及折叠/去折叠事件。这些研究均可通过本方法的应用得以顺利实现。

引言

据估计，膜蛋白由所有基因中的约30%编码¹，并构成了现代药物治疗靶点的绝大多数²。这些蛋白执行多种重要的细胞功能³ ，但尽管其数量丰富且功能重要，目前在结构生物信息学研究协作实验室（RCSB）蛋白质数据库中存档的结构中，膜蛋白仅占约1%⁴。由于其部分具有疏水性，膜结合蛋白的结构解析一直极具挑战性^5,6,7

由于许多生物物理技术在测量时需要溶液中具有单一分散性的颗粒，因此从天然膜中分离膜蛋白并将其稳定在模拟天然膜环境的可溶性介质中，已成为近几十年来的研究热点。^8,9,10 这些研究推动了多种新型两亲性组装体系的发展，用于增溶膜蛋白，例如纳米盘（nanodiscs）^11,12,

方案

1. 准备并提交中子设施机时及仪器使用申请

1. 查阅在线资源，以确定提供通用用户中子束时间访问权限的中子散射设施，例如橡树岭国家实验室（Oak Ridge National Laboratory, ORNL）。全球中子设施的地图及中子研究相关信息可在线获取。⁴⁶ 请注意，这些设施通常会定期发布项目申请通知，这决定了下一次中子束时间的可用时间。中子可用于多种应用，应查找小角中子散射（SANS）仪器，特别是具备生物样品研究能力的仪器。
2. 利用中子设施提供的资源，协助完成中子束时间申请提案的提交流程。与您所申请仪器相关的中子散射科学家（Neutron Scattering Scientist, NSS）进行咨询。查阅该中子设施关于提案征集、截止日期及提交建议的最新信息；橡树岭的相关信息可在线获取。⁴⁷ 请严格遵循所有指南提交中子束时间申请提案。
3. 若需要氘代蛋白质（见2.2节），请注意中子散射设施通常由专门从事氘代材料制备的实验室和技术支持团队提供支持。如需申请使用橡树岭国家实验室的生物氘代实验室（Bio-Deuteration Lab, BDL），请在提案系统中将BDL选为第二台仪器。SANS提案将由科学评审委员会进行可行性及科学性评审，而BDL的申请仅进行可行性筛查。为协助BDL的可行性评审，请提交一份完整的资料申请表⁴⁸

结果

申请中子束时间及仪器使用提案时，应清晰传达评审委员会所需的所有信息，以便对所提议的实验进行有效评估。对于缺乏经验的用户，强烈建议与中子科学专员（NSS）进行沟通。NSS 可评估实验的初步可行性，并指导提案的提交，以突出实验的可行性、安全性以及产生高影响力科学成果的潜力。提案中应包含的研究信息包括：研究意义的背景与依据；预期获得的知识及其对相关科学领域当前认知的影响；拟开展工作的描述，包括样品、方法和实验步骤；如适用，还应提供团队在该设施以往的工作成果，包括相关出版物和研究结果。用户可通过中子科学用户门户（neutrons.ornl.gov/users）获取有用的资源，例如提案模板以及撰写提案的实用建议。

实验规划是一个动态过程，通常始于项目申请的初期阶段，但可能要到实验开始前才能完全确定。然而，请注意，任何显著偏离申请书中描述的变更（包括缓冲液条件或样品组成的更改）都必须在实验开始前获得设施管理部门的批准。

讨论

结构生物学研究人员利用互补的结构技术（如溶液散射）来获取溶液中生物大分子的生化和结构细节（例如整体尺寸和形状）。小角中子散射（SANS）是一种特别有吸引力的技术，可用于测定膜蛋白的低分辨率结构，而膜蛋白正是现代结构生物学和生物化学的核心研究对象。SANS 所需的纯化蛋白量与晶体学实验相当（1 mg/样品）。近年来，与膜蛋白研究相关的高纯度氘代去垢剂在商业上的可获得性不断扩大，使得研究人员能够调控膜蛋白-去垢剂复合物中的氢/氘含量，从而在 SANS 实验中直接记录蛋白信号。若实验成功，仅需数小时采集的数据即可计算出从头（ab initio）分子包络模型。因此，膜蛋白生物化学家、生物物理学家和结构生物学家可便捷地利用 SANS 获得溶液中膜蛋白的珍贵初始三维结构模型，包括与结合伴侣或底物形成的复合物结构；此外，通过 SANS 获得的模型还可用于衍射数据的相位确定。若 SANS 能够常规用于膜蛋白的表征，将对膜蛋白生物化学领域产生变革性影响，并进一步波及从基础结构功能研究到药物发现与开发的广泛领域。利用氘取代实现中子对比度匹配的额外优势，使 SANS 成为研究蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA 或其他生物分子复合物的有力技术，这.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Amicon Ultra MWCO 50KDa 浓缩管	EMD Millipore	UFC905096	实验耗材
二碱式柠檬酸铵	Fisher Scientific	A663	培养基组分
硫酸铵	EMD Millipore	2150	培养基组分
Bioflo 310 生物反应器系统	Eppendorf	M1287-2110	设备
二水氯化钙	Acros	423525000	培养基组分
羧苄西林	IBI Scientific	IB02025	抗生素
氯霉素	EMD Millipore	3130	抗生素
氯化钴(II)	Acros	AC21413-0050	培养基组分
硫酸铜(II)	Acros	AC19771-1000	培养基组分
重水	Sigma-Aldrich	756822	培养基组分
Drierite 气体纯化器	W.A. Hammond Drierite Co. Ltd.	27068
EDTA 二钠盐二水合物	EMD Millipore	4010	培养基组分
Emulsiflex-C3	Avestin	EF-C3	设备
Äkta Purifier UPC100	GE Healthcare		设备
甘油	Sigma-Aldrich	G5516	培养基组分
HEPES	Sigma-Aldrich	H4034
HiPrep 16/60 Sephacryl S-300 HR 柱	GE Healthcare	17116701
咪唑	VWR	97064-622
IPTG	Teknova	I3325
六水三氯化铁	MP Biochemicals	ICN19404590	培养基组分
LB 琼脂（Miller）	Fisher Scientific	BP1425-2
七水硫酸镁	VWR	97062-134	培养基组分
一水硫酸锰(II)	Acros	AC20590-5000	培养基组分
MaxQ 6000 恒温/制冷摇床	Thermo Scientific	SHKE6000-7	设备
n-十二烷基-d25-β-D-麦芽糖吡喃糖苷	Anatrace	D310T
n-十二烷基-β-D-麦芽糖吡喃糖苷	Anatrace	D310A
磷酸二氢钾	VWR	97062-346	培养基组分
RC 6 Plus 离心机	Thermo Scientific Sorvall	46910	设备
SIGMAFAST 蛋白酶抑制剂混合片剂（无 EDTA）	Sigma-Aldrich	S8830
氯化钠	Sigma-Aldrich	S3014
氢氧化钠	Sigma-Aldrich	795429
磷酸氢二钠	Sigma-Aldrich	S7907	培养基组分
带 0.2µm PES 膜的无菌 25 mm 注射器滤器	VWR	28145-501	实验耗材
带 0.2µm PES 膜的无菌一次性瓶顶滤器	Thermo Scientific	596-4520	实验耗材
Superdex 200 10/300 GL	GE Healthcare	17517501
Superose-12 10/300 GL 柱	GE Healthcare	17517301
Ultrospec 10 细胞密度计	GE Healthcare	80211630	设备
一水硫酸锌	Acros	AC38980-2500	培养基组分