抗菌肽定位的细菌 Spheroplasts 和原生质体的生产与可视化

摘要

在这里, 我们提出了一个生产革兰氏阴性大肠杆菌 (大肠杆菌) spheroplasts 和革兰氏阳性芽孢杆菌巨大(巨大) 原生质体的协议, 以清楚地形象化和快速表征多肽-细菌的相互作用。这为定义膜定位和转运肽提供了系统的方法。

摘要

用共焦显微镜作为一种评估细菌内肽定位模式的方法, 通常被常规光学显微镜的分辨率限制所抑制。由于给定显微镜的分辨率不能很容易地增强, 我们提出了改变小棒状革兰氏阴性大肠杆菌 (大肠杆菌) 和革兰阳性芽孢杆菌巨大(巨大) 的协议 .成更大, 容易成像的球形形式称为 spheroplasts 或原生质体。这种转变使观察者能够迅速、清楚地确定肽是否进入细菌膜 (即膜定位) 或穿过细胞膜进入细胞 (即转运)。利用这种方法, 我们还提出了一种系统的方法来表征多肽作为膜定位或转运。这种方法可用于各种膜活性肽和细菌菌株, 我们通过观察 Buforin II P11A (BF2 P11A)、抗菌肽 (AMP) 与大肠杆菌的相互作用, 证明了本协议的实用性.spheroplasts 和B. 巨大原生质体。

引言

抗菌肽 (安培) 得到了重视, 因为他们的潜在用途作为替代传统抗生素^1,2,3,4,5。安培杀死细菌的转运通过细胞膜, 并与细胞内的成分, 如核酸, 或通过 permeabilizing 膜导致细胞含量的泄漏⁶。除了用作抗生素外, 转运安培还可用于药物传递应用, 因为它们可以无中断地穿过不透水细胞膜^7、8。因此, 我们寻求了解基本的 AMP 作用机制, 为其在药物设计中的应用打下基础。

共焦显微镜为评估细菌细胞中荧光标记安培的定位模式提供了一种方法, 提供了对其作用机制^{9、10、11、12}

方案

1. 解决方案准备

注: 准备步骤1.1–1.9 和1.8–1.11 中描述的解决方案, 以便分别生产大肠杆菌spheroplasts 和巨大原生质体。

1. 制备1米三氯, pH 7.8 通过溶解10.34 克三盐酸和 4.17 g 的三 OH 在50毫升的 dH 2O 在125毫升瓶。通过25毫米注射器过滤器进行消毒, 用0.2 µm 膜, 在室温下贮存在锥形管中。
2. 20毫米氯化镁₂, 0.7 米蔗糖, 10 毫米三氯, pH 7.8), 通过溶解0.10 克氯化镁₂ (95.2 克/摩尔) 和11.98 克蔗糖 (342.3 克/摩尔) 25 毫升 dH 在2毫升的瓶中。添加500µL 1 M 三氯 (pH 7.8) 和调整体积为50毫升。通过25毫米注射器过滤器进行消毒, 用0.2 µm 膜, 在室温下贮存在锥形管中。
3. 10毫米氯化镁₂, 0.8 米蔗糖, 10 毫米三氯, pH 7.8), 通过溶解0.05 克氯化镁₂ (95.2 克/摩尔) 和13.69 毫升的蔗糖 (342.3 克/摩尔) 在 25 ml dH₂毫升瓶中。添加500µL 1 M 三氯 (pH 7.8) 和调整体积为50毫升。通过25毫米注射器过滤器进行消毒....

结果

通过扩大细菌和使它们球状, 我们可以很容易地区分是否多肽定位到细菌膜或容易植物常常将跨细菌膜。常规光学显微镜的分辨率限制使它具有挑战性, 以区分是否在正常细菌的细胞膜或细胞内空间出现多肽信号, 因为在膜上定位的信号似乎会与细胞内空间 (图 3A)。相比之下, spheroplasts (2–5µm) 和原生质体 (2–3µm) 的扩大大小与正常的细菌相比, 通常只有1µm 的直径, 结果在膜标记和细胞内空间之间的清晰分辨率, 使其更容易区分肽的定位 (图 3B)。

在这里, spheroplasts 和原生质体用于显示 N 终端 FITC 标记为安培 BF2 P11A 的本地化模式。我们观察 FITC 标记的 BF2 P11A 的两个局部的膜和植物常常将跨细胞膜的大肠杆菌spheroplasts 和B. 巨大.......

讨论

这里提出的协议使研究人员能够更快地获得更大的细菌图像样本量, 因为扩大的球形细菌更容易定位、定位和图像。这种提高收集数据的能力在几个方面是有价值的。首先, 它能够对多肽定位模式进行更系统的定量分析。虽然从较小的图像集可以证明质量趋势, 但只有大量高质量图像的样本集显示了本地化模式中更微妙的趋势, 如肽 translocates 与本地化的细胞百分比膜。此外, 能够更好地解决内部荧光的膜定位, 使它更容易执行时间课程研究, 以评估如何快速肽与细菌细胞的互动, 以及如何本地化模式变化随着时间的推移。改进后的分辨率还允许研究人员考虑在小细菌中不可能出现的肽定位的趋势。例如, 在我们观察到的一些 spheroplasts 和原生质体中, 肽似乎定位到膜的特定部分,即,肽信号并不形成一个完整的, 在细菌周围的凝聚力环, 而是显示一些点标签。在其他情况下, 多肽可能不会完全均匀分布在细菌膜内,即,肽信号不能完全填充细菌的内部空间。虽然我们没有在目前的分析中追求这些趋势, 但考虑到当成像 spheroplasts 和原生质体而不是标准的细菌细胞时, 这种定位趋势变得可行。这些优势也适用于确定除安培以外的多肽的定位,.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Trizma 氢氯化物 （Tris HCl）	Sigma	T3253
Trizma 碱基 （Tris OH）	Sigma	T1503
氯化镁	Sigma	M8266
蔗糖	Sigma	S7903
溶菌酶		Sigma L6876
脱氧核糖核酸酶 I	Sigma	D4527
乙二胺四乙酸	Sigma	106361	在原始方案开发中使用了 Sigma 106361;106361已停产，用 ED2SS 作为头
孢氨苄水合物	Sigma	C4895
氨苄青霉素	Fisher Scientific	BP1760
BBL 胰蛋白酶大豆肉汤	Fisher Scientific	B11768
BF2 P11A FITC	NeoScientific	定制订购
di-8-ANEPPS	Biotium	61012
DMSO	Sigma	34869	在原始方案开发中使用了 Sigma D8779;D8779 已停产，以 34869 作为替代品
马来酸	Sigma	M0375
Acrodisc 25 毫米注射器过滤器，带 0.2 微米;m HT Tuffryn 膜	颇尔公司	4192
激光扫描共聚焦显微镜	徕卡显微系统	TCS SP5 II	用于图像采集
徕卡应用套件， 高级荧光	徕卡显微系统		用于图像处理