本文介绍了一种制备革兰氏阴性大肠杆菌（Escherichia coli，E. coli）球状体和革兰氏阳性巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium，B. megaterium）原生质体的实验方案，以清晰观察并快速表征肽与细菌之间的相互作用。该方法为定义定位于膜及跨膜转运的肽提供了一种系统性的研究手段。
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本文内容
摘要
摘要
共聚焦显微镜作为评估肽在细菌内定位模式的方法，常受限于传统光学显微镜的分辨率。由于特定显微镜的分辨率难以轻易提升，本文提供了将小型杆状革兰氏阴性菌进行改造的实验方案 大肠杆菌 (E. coli以及革兰氏阳性 Bacillus megaterium (B. megaterium）转化为更大、易于成像的球形结构，称为球状体或原生质体。这种转化使观察者能够快速而清晰地判断肽是否嵌入细菌膜中即， 膜定位）或穿越膜进入细胞（即， 转位）。通过该方法，我们还提供了一种系统性表征肽类分子是否具有膜定位或转位能力的策略。尽管该方法适用于多种膜活性肽和细菌菌株，但我们通过观察抗菌肽Buforin II P11A（BF2 P11A）与 E. coli 原生质球和 B. megaterium 原生质体
引言
抗菌肽（AMPs）因其作为传统抗生素替代品的潜力而受到广泛关注1,2,3,4,5。AMPs通过两种机制杀灭细菌：一种是跨膜转位后与核酸等细胞内组分相互作用，另一种是破坏细胞膜通透性，导致细胞内容物泄漏6。除了作为抗生素的应用外，由于转位型AMPs能够非破坏性地穿过不通透的细胞膜，因此也可被改造用于药物递送领域7,8。因此，我们致力于阐明AMPs作用的基本机制，为其在药物设计中的应用奠定基础。
共聚焦显微镜可用于评估荧光标记的抗菌肽（AMPs）在细菌细胞中的定位模式，从而揭示其作用机制9,10,11,
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方案
1. 溶液配制
注意：请按顺序准备步骤 1.1–1.9 和 1.8–1.11 中所述的溶液，分别用于制备 E. coli 球状体和 B. megaterium 原生质体。
- 将10.34 g Tris HCl和4.17 g Tris OH溶解于50 mL去离子水中，配制pH 7.8的1 M Tris-Cl溶液2O 在125 mL锥形瓶中。使用25 mm注射器滤器过滤除菌 0.2 µm 膜并置于锥形管中，室温保存。
- 配制溶液A（20 mM MgCl₂）2，0.7 M 蔗糖，10 mM Tris-Cl，pH 7.8）通过溶解 0.10 g MgCl2 （95.2 g/mol）和 11.98 g 蔗糖（342.3 g/mol）溶于 25 mL dH₂O2在125 mL锥形瓶中加入O。 500 µL 1 M Tris-Cl (pH 7.8) 定容至 50 mL。使用 25 mm 注射器滤器过滤除菌 0.2 µm 膜并置于锥形管中，室温保存。
- 配制溶液 B（10 mM MgCl₂）2，0.8 M 蔗糖，10 mM Tris-Cl，pH 7.8）通过溶解 0.05 g MgCl2 （95.2 g/mol）和 13.69 g 蔗糖（3....
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结果
通过使细菌膨胀并呈球形化，我们可以轻松区分肽是定位于细菌膜上，还是易于跨膜转运进入细菌内部。由于常规光学显微镜的分辨率有限，难以区分肽信号来自正常细菌（直径通常仅为1 µm）的膜上还是胞内空间，因为定位于膜上的信号会与胞内信号重叠（图3A）。相比之下，球状体（2–5 µm）和原生质体（2–3 µm）的尺寸明显大于正常细菌，使得膜标记物与胞内空间之间具有清晰的分辨度，从而更易于判断肽的定位（图3B）。
在此，利用球状体和原生质体来展示N端FITC标记的抗菌肽BF2 P11A的定位模式。我们观察到FITC标记的BF2 P11A既定位于细胞膜，又可跨细胞膜易位 E. coli 原生质球和 B. megaterium 原生质体 (图4）。虽然已观察.......
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讨论
本文所展示的实验方案使研究人员能够更快地获取更大样本量的细菌图像，因为膨胀后的球形细菌更易于定位、定向和成像。这种增强的数据采集能力在多个方面具有重要价值。首先，它使得对肽段定位模式进行更系统的定量分析成为可能。虽然较小的图像集已能展示定性趋势，但只有高质量的大样本图像集才能揭示定位模式中更为细微的趋势，例如肽段发生跨膜转运与仅定位于膜上的细胞所占的百分比。此外，由于能够更清晰地区分细胞内部荧光与膜上的定位信号，研究人员可以更方便地开展时间序列研究，以评估肽段与细菌细胞相互作用的速度以及定位模式随时间的变化情况。分辨率的提升还使研究人员能够观察在较小细菌中无法识别的肽段定位趋势。例如，在我们观察到的部分球状体和原生质体中，肽段似乎特异性地定位于细胞膜的某些特定区域。 即， 肽信号未在细菌周围形成完整、连续的环状结构，而是呈现部分点状标记。在其他情况下，肽可能未在细菌膜内完全均匀分布。 即， 肽信号并未完全充满细菌的内部空间。尽管在当前分析中我们未深入探讨这些分布趋势，但在成像球状体和原生质体而非标准细菌细胞时，研究此类定位趋势变得可行。这些优势同样适用于确定除抗菌肽（AMPs）以外其他肽类（如细胞穿透.......
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
本研究由美国国家过敏与传染病研究所（NIH-NIAID）资助，项目编号 R15AI079685。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 盐酸三羟甲基氨基甲烷（Tris HCl） | Sigma | T3253 | |
| 三羟甲基氨基甲烷碱（Tris OH） | Sigma | T1503 | |
| 氯化镁 | Sigma | M8266 | |
| 蔗糖 | Sigma | S7903 | |
| 溶菌酶 | Sigma | L6876 | |
| 脱氧核糖核酸酶 I | Sigma | D4527 | |
| 乙二胺四乙酸 | Sigma | 106361 | 原始方案开发中使用 Sigma 106361；该产品已停产，由 ED2SS 替代 |
| 头孢氨苄水合物 | Sigma | C4895 | |
| 氨苄青霉素 | Fisher Scientific | BP1760 | |
| BBL 胰蛋白胨大豆肉汤 | Fisher Scientific | B11768 | |
| BF2 P11A FITC | NeoScientific | 定制订购 | |
| di-8-ANEPPS | Biotium | 61012 | |
| DMSO | Sigma | 34869 | 原始方案开发中使用 Sigma D8779；该产品已停产，由 34869 替代 |
| 马来酸 | Sigma | M0375 | |
| Acrodisc 25 mm 注射器滤器，带 0.2 μm HT Tuffryn 膜 | Pall Corporation | 4192 | |
| 激光扫描共聚焦显微镜 | Leica Microsystems | TCS SP5 II | 用于图像采集 |
| Leica Application Suite, Advanced Fluorescence | Leica Microsystems | 用于图像处理 |
参考文献
- Baltzer, S. A., Brown, M. H. Antimicrobial peptides: promising alternatives to conventional antibiotics. Journal of Molecular Microbiology Biotechnology. 20 (4), 228-235 (2011).
- Hancock, R. E., Sahl, H. G. Antimicr....
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重印与许可
