细菌球状体和原生质体的制备与可视化以表征抗菌肽的定位

摘要

本文介绍了一种制备革兰氏阴性大肠杆菌（Escherichia coli，E. coli）球状体和革兰氏阳性巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium，B. megaterium）原生质体的实验方案，以清晰观察并快速表征肽与细菌之间的相互作用。该方法为系统性定义定位于膜及跨膜转运的肽类提供了有效手段。

摘要

共聚焦显微镜作为评估肽在细菌内定位模式的方法，通常受限于传统光学显微镜的分辨率。由于特定显微镜的分辨率难以轻易提升，我们提供了一套实验方案，可将杆状的革兰氏阴性菌Escherichia coli（E. coli）和革兰氏阳性菌Bacillus megaterium（B. megaterium）转化为更大、易于成像的球形结构，即球状体（spheroplasts）或原生质体（protoplasts）。这种转化使观察者能够快速而清晰地判断肽是嵌入细菌膜中（即膜定位）还是穿过膜进入细胞内部（即转位）。通过该方法，我们还提出了一种系统性策略，用于将肽分类为膜定位型或转位型。尽管该方法适用于多种膜活性肽和细菌菌株，但我们通过观察抗菌肽Buforin II P11A（BF2 P11A）与E. coli球状体及B. megaterium原生质体的相互作用，展示了本实验方案的应用价值。

引言

抗菌肽（AMPs）因其作为传统抗生素替代物的潜力而受到广泛关注^1,2,3,4,5。AMPs通过两种机制杀灭细菌：一种是跨膜转运后与核酸等细胞内组分相互作用，另一种是破坏细胞膜通透性，导致细胞内容物泄漏⁶。除了作为抗生素的应用外，由于转位型AMPs能够无破坏性地穿过不通透的细胞膜，因此也可被改造用于药物递送领域^7,8。因此，我们致力于阐明AMPs作用的基本机制，为其在药物设计中的应用奠定基础。

共聚焦显微镜可用于评估荧光标记的抗菌肽（AMPs）在细菌细胞中的定位模式，从而揭示其作用机制^{9,10,11,12,13,14}。通过标记细菌的膜结构，可以判断荧光标记的肽是定位于细菌细胞膜还是细胞内区域。然而，由于细菌体积小且呈杆状，加之其在载玻片上的取向多变，常规光学显微镜的分辨率限制使得成像较为困难，因此该技术的应用受到一定限制¹⁵。

本方法的目的是通过共聚焦显微镜增强对荧光标记肽定位模式的可视化效果。通过将微小、细长、杆状的革兰氏阴性 Escherichia coli（E. coli）和革兰氏阳性 Bacillus megaterium（B. megaterium）细菌转化为增大的球形结构——即所谓的球状体（spheroplasts，适用于革兰氏阴性菌株）和原生质体（protoplasts，适用于革兰氏阳性菌株）——从而提升可视化效果^{16,17,18,19,20,21}。由于球状体和原生质体尺寸更大且形状对称，因此在成像时无需考虑细菌在载玻片上的方向，更易于观察。此外，我们提出了一种系统性的方法，用于对共聚焦显微镜数据进行定量分析，以区分抗菌肽（AMPs）是定位于细胞膜还是发生跨膜转运。应用这些方法可更清晰地区分荧光标记肽的定位模式。本文所述的实验方案也可用于评估除抗菌肽之外的多种膜活性物质的定位情况，包括细胞穿透肽。

该技术的一个显著优势在于，它能够在单细胞水平上揭示抗菌肽（AMPs）的作用机制，从而可能发现细胞间的异质性¹⁵，而不同于其他常用于研究AMPs作用机制的荧光检测方法，后者仅能提供整体水平的估计值^{9,22,23,24,25}。使用球状体和原生质体来评估AMP进入细胞的情况具有特殊意义²⁶ ，因为与用于评估细胞摄取的其他模型（如脂质体）相比，它们在生理上更具相关性^15 24。

方案

1. 溶液配制

注意：请按步骤 1.1–1.9 和 1.8–1.11 中所述配制溶液，分别用于制备大肠杆菌（E. coli）球状体和巨大芽孢杆菌（B. megaterium）原生质体。

1. 将10.34 g Tris HCl和4.17 g Tris OH溶解于50 mL去离子水中，配制pH 7.8的1 M Tris-Cl溶液₂在125 mL锥形瓶中。使用带有0.2 µm滤膜的25 mm注射器滤器过滤除菌，室温下储存于锥形管中。
2. 配制溶液 A（20 mM MgCl₂）₂，0.7 M 蔗糖，10 mM Tris-Cl，pH 7.8）通过溶解 0.10 g MgCl₂ （95.2 g/mol）和 11.98 g 蔗糖（342.3 g/mol）溶于 25 mL dH₂O₂在125 mL锥形瓶中，加入500 µL 1 M Tris-Cl（pH 7.8），加水定容至50 mL。使用带有0.2 µm膜的25 mm注射器滤器过滤除菌，室温下储存于锥形管中。
3. 配制溶液B（10 mM MgCl₂）₂，0.8 M 蔗糖，10 mM Tris-Cl，pH 7.8）通过溶解 0.05 g MgCl₂ （95.2 g/mol）和 13.69 g 蔗糖（342.3 g/mol）溶于 25 mL dH₂O₂在125 mL锥形瓶中，加入500 µL 1 M Tris-Cl（pH 7.8），加水定容至50 mL。使用带有0.2 µm膜的25 mm注射器滤器过滤除菌，室温下储存于锥形管中。
4. 通过将13.69 g蔗糖（342.3 g/mol）溶解于50 mL dH₂O中，配制0.8 M蔗糖溶液₂在125 mL锥形瓶中。使用带有0.2 µm滤膜的25 mm注射器滤器过滤除菌，室温下储存于锥形管中。
5. 将0.015 g脱氧核糖核酸酶I（DNase I）溶于3 mL去离子水（dH₂O）中，配制成5 mg/mL的DNase I溶液₂在50 mL锥形瓶中。使用带有0.2 µm滤膜的25 mm注射器滤器过滤除菌。将溶液分装至微量离心管中，于-20 °C保存。
6. 配制 0.125 M 乙二胺四乙酸（EDTA），pH 8.0：将 0.698 g 乙二胺四乙酸二钠二水合物（372.2 g/mol）溶解于 15 mL dH₂O 中₂在125 mL锥形瓶中。使用带有0.2 µm滤膜的25 mm注射器滤器过滤除菌，室温下储存于离心管中。
7. 通过将 0.03 g 头孢氨苄水合物（365.404 g/mol）溶解于 50 mL dH₂O 中，配制 600 µg/mL 头孢氨苄溶液₂在125 mL锥形瓶中。使用带有0.2 µm滤膜的25 mm注射器滤器过滤除菌，然后在4 °C下储存于锥形管中。
8. 将0.015 g溶菌酶溶解于3 mL去离子水中，配制成5 mg/mL溶菌酶溶液₂在50 mL锥形瓶中。使用带有0.2 µm滤膜的25 mm注射器滤器过滤除菌。将溶液分装至微量离心管中，于-20 °C保存。
9. 通过将30 g TSB溶解于1 L去离子水中，制备3%（w/v）胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）。₂O 在2 L烧瓶中。将溶液分装至含有25 mL或100 mL TSB的烧瓶中，用于后续制备。 E. coli 原生质球或 B. megaterium 原生质体, 分别对锥形瓶进行高压灭菌以消毒液体培养基。灭菌后的TSB可于室温或4 °C保存。
10. 制备溶液C（1 M 蔗糖，0.04 M 丙二酸，0.04 M MgCl₂）₂，pH 6.5）通过溶解 34.23 g 蔗糖（342.3 g/mol）、0.46 g 马来酸（116.07 g/mol）和 0.38 g MgCl₂ (95.21 g/mol) 溶于 100 mL dH₂O 中₂在250 mL锥形瓶中，调节pH至6.5。使用带有0.2 µm滤膜的25 mm注射器滤器过滤除菌，于室温下储存于锥形管中。
11. 在1 L玻璃瓶中混合100 mL 3% w/v TSB和100 mL溶液C，配制200 mL原生质体培养基。经高压灭菌后室温保存。

2. 过夜培养物的制备

注意：执行第2至4节时应采用适当的无菌技术。如需要，可使用含有抗生素抗性质粒的菌株，以减少潜在污染。若使用具有抗生素抗性的菌株，需在步骤2.1、3.1–3.2以及4.1–4.4中加入相应的抗生素。

1. 使用无菌移液器吸头挑取单个细菌菌落，接种于含有 2–3 mL 3% w/v TSB 的 14 mL 培养管中，制备过夜培养物。在 37 °C 条件下振荡培养 16–21 小时。

3. 革兰氏阴性菌的制备 E. coli 原生质球

1. 在250 mL锥形瓶中，将过夜培养物按1:100比例稀释至25 mL含3% w/v TSB的溶液中，于37 °C振荡培养约2.5小时，直至溶液在600 nm处的光密度达到0.5–0.8。使用分光光度计测定光密度。
2. 在250 mL锥形瓶中，将上述培养物按1:10比例稀释至30 mL含3% w/v TSB的溶液中，于37 °C振荡培养2.5小时，同时加入60 µg/mL头孢氨苄（347.4 g/mol），以生成长度约为50–150 µm的单细胞丝状体，可在光学显微镜下以1,000倍放大观察（图1B）。
3. 将细菌溶液在4 °C条件下以1,500 × g离心4分钟，收集丝状体。倾去并弃除上清液，保留沉淀。
4. 轻轻加入1 mL 0.8 M蔗糖溶液洗涤沉淀，注意勿扰动沉淀。孵育1分钟后，弃除上清液，勿扰动沉淀。
5. 按顺序向沉淀中加入150 µL 1 M Tris-Cl（pH 7.8）、120 µL 5 mg/mL溶菌酶、30 µL 5 mg/mL DNase I和120 µL 0.125 M EDTA，并在室温下孵育10分钟。
6. 使用微量移液器在1分钟内将1 mL溶液A缓慢加入步骤3.5制备的溶液中，同时手动轻柔旋转混匀。室温孵育4分钟。
7. 将7 mL 4 °C的溶液B分装至两个15 mL圆锥形离心管中。将步骤3.6制备的溶液等量加入这两个管中。在4 °C条件下以1,500 × g离心4分钟。
8. 使用血清移液器小心移除上清液，仅保留1-2 mL，注意勿扰动沉淀。使用P1000微量移液器轻轻吹打重悬沉淀。在光学显微镜下以1,000倍放大观察样品，目视检查原生质球的形成情况（图1C）。
9. 将原生质球储存于-20 °C，最长可保存一周，或直至经历3次冻融循环。

4. 革兰氏阳性 B. megaterium 原生质体的制备

1. 在250 mL锥形瓶中，将过夜培养物按1:1,000比例稀释于100 mL含3% w/v TSB的培养基中，于37 °C振荡培养约4.5小时，直至溶液在600 nm处的光密度达到0.9–1.0。使用分光光度计测定光密度。
2. 将液体培养物倒入两个50 mL离心管中，在4 °C条件下以2,000 × g离心10分钟。
3. 使用刻度移液管弃去两个离心管中的上清液。将每个沉淀重悬于2.5 mL原生质体培养基中，并将重悬液合并至一个离心管内。用移液管将合并后的重悬液转移至125 mL锥形瓶中。
4. 加入1 mL浓度为5 mg/mL的溶菌酶溶液，在37 °C振荡孵育1小时。
5. 在1,000倍光学显微镜下观察原生质体生长情况，注意是否存在异常形态，例如细菌呈膨胀杆状而非球形（图2）。使用刻度移液管将溶液转移至15 mL离心管中，在4 °C条件下以2,000 × g离心10分钟。
6. 倾去上清液，将沉淀重悬于5 mL原生质体培养基中。将原生质体储存在-20 °C，可保存一周，或直至经历3次冻融循环。

5. 成像用肽溶液和膜染料的制备

1. 肽溶液
   1. 在用铝箔包裹的微量离心管中，将2 mg FITC标记的BF2 P11A溶解于800 µL去离子水（dH₂O）中。使用至少含有一个色氨酸残基的肽，以便进行蛋白质浓度测定。
   2. 使用分光光度法，对肽溶液在280 nm处的吸光度进行三次重复测量。利用色氨酸的摩尔消光系数（5,700/Mcm）计算肽的浓度。
   3. 用去离子水（dH₂O）将肽溶液稀释至终浓度为100–200 µM。将溶液置于微量离心管中，用铝箔包裹后于-20 °C保存，避免光照。
2. 膜染料
   1. 在微量离心管中，通过将5 mg di-8-ANEPPS溶解于843.3 µL DMSO中，配制10 mM的di-8-ANEPPS（分子量592.9 g/mol）储备液。用铝箔包裹后于4 °C保存，避免光照。
   2. 在微量离心管中，取3 µL 10 mM di-8-ANEPPS加入997 µL DMSO中，配制1 mL 0.03 mM的di-8-ANEPPS溶液。用铝箔包裹后于4 °C保存，避免光照。

6. 可视化 E. coli 原生质球和 B. megaterium 使用共聚焦显微镜观察原生质体

1. 取5 µL原生质体或球状体，用移液器滴加到经多聚-L-赖氨酸包被的玻片上。向玻片中加入2 µL FITC标记的抗菌肽（100–200 µM），避光孵育3分钟。
2. 向玻片中加入1 µL膜染料di-8-ANEPPS（0.03 mM），避光孵育3分钟。盖上盖玻片，并用指甲油封片。
3. 开启共聚焦显微镜和氩离子激光器。将氩离子激光器的输出功率和透射率均调节至20%。
4. 分别设置FITC标记肽的发射波长范围为499–532 nm，di-8-ANEPPS标记膜染料的发射波长范围为670–745 nm。
5. 使用63倍物镜对原生质体或球状体进行成像（图1 和 图2）。利用成像软件获取8位、512 × 512的复合z轴层扫图像，图像由覆盖整个原生质体或球状体的0.5 µm切片组成。
   注意：在对原生质体和球状体成像时，应仔细考虑减少发射光串扰。详见讨论部分。

7. AMP 定位的表征

1. 在成像软件中打开复合z轴层叠图像。找到球状体或原生质体最中心的切片，在膜上放置一个圆形感兴趣区域（ROI）（直径0.3 µm）（ROI 1），在球状体或原生质体中心放置第二个ROI（ROI 2），并在远离球状体或原生质体的区域放置第三个ROI以测量背景荧光（ROI 3）（图5）。避免包含饱和像素。各ROI中的荧光强度可由成像软件计算得出。
   注意：当肽未定位于整个膜时，应将ROI 1绘制在肽定位的膜区域。
2. 使用以下公式计算胞内肽荧光强度与膜上肽荧光强度的比值：
   
   注意：从ROI 2和ROI 1的荧光强度中减去ROI 3的荧光强度，以校正背景荧光。

结果

通过使细菌膨胀并呈球形化，我们可以轻松区分肽是定位于细菌膜上，还是能够顺利穿过细菌膜。由于常规光学显微镜的分辨率有限，难以判断肽信号来源于细菌膜还是胞内空间，因为在正常细菌中（直径通常仅为1 µm），定位于膜上的信号会与胞内空间的信号重叠（图3A）。相比之下，球状体（2–5 µm）和原生质体（2–3 µm）比正常细菌更大，膜标记物与胞内空间之间可实现清晰分辨，从而更易于判断肽的定位（图3B）。

在此，利用球状体和原生质体来展示N端FITC标记的抗菌肽BF2 P11A的定位模式。我们观察到FITC标记的BF2 P11A既定位于细胞膜，又可跨过细胞膜进行转位。 E. coli 原生质球和 B. megaterium 原生质体 (图4）。尽管已观...

讨论

本文所述的实验方案使研究人员能够更快速地获取更大样本量的细菌图像，因为增大后的球形细菌更容易定位、定向和成像。这种数据采集能力的提升在多个方面具有重要价值。首先，它使得对肽定位模式进行更系统的定量分析成为可能。虽然较小的图像样本集已可展示定性趋势，但只有高质量的大样本图像集才能揭示定位模式中更为细微的变化趋势，例如肽发生跨膜转运与仅定位于膜上的细胞所占的百分比。此外，由于能够更清晰地区分细胞内部荧光与膜定位信号，研究人员得以更便捷地开展时间序列研究，以评估肽与细菌细胞相互作用的速度以及定位模式随时间的演变。分辨率的提升还使研究人员能够探索在较小细菌中无法观察到的肽定位趋势。例如，在我们观察到的部分球形体和原生质体中，肽似乎特异性地定位于膜的某些特定区域。 即， 肽信号未在细菌周围形成完整、连续的环状结构，而是呈现部分点状标记。在其他情况下，肽可能未在细菌膜内完全均匀分布。 即， 肽信号并未完全充满细菌的内部空间。尽管在当前分析中我们未深入探讨这些分布趋势，但在成像球状体和原生质体而非标准细菌细胞时，研究此类定位趋势成为可能。这些优势同样适用于确定抗菌肽以外的其他肽类（如细胞穿透肽）的定位。通过这些方法...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
盐酸三羟甲基氨基甲烷（Tris HCl）	Sigma	T3253
三羟甲基氨基甲烷碱（Tris OH）	Sigma	T1503
氯化镁	Sigma	M8266
蔗糖	Sigma	S7903
溶菌酶	Sigma	L6876
脱氧核糖核酸酶 I	Sigma	D4527
乙二胺四乙酸	Sigma	106361	原始方案开发中使用 Sigma 106361；该产品已停产，由 ED2SS 替代
头孢氨苄水合物	Sigma	C4895
氨苄青霉素	Fisher Scientific	BP1760
BBL 胰蛋白胨大豆肉汤	Fisher Scientific	B11768
BF2 P11A FITC	NeoScientific	定制订购
di-8-ANEPPS	Biotium	61012
DMSO	Sigma	34869	原始方案开发中使用 Sigma D8779；该产品已停产，由 34869 替代
马来酸	Sigma	M0375
Acrodisc 25 mm 注射器滤器，带 0.2 μm HT Tuffryn 膜	Pall Corporation	4192
激光扫描共聚焦显微镜	Leica Microsystems	TCS SP5 II	用于图像采集
Leica 应用套件，高级荧光模块	Leica Microsystems		用于图像处理