由于多胺类化合物含有多个氨基氮原子，因此基于多胺的肽两亲分子（PPAs）的合成具有较大挑战性，需要审慎使用保护基团来屏蔽这些活性官能团。本文中，我们描述了一种制备这类新型自组装分子的简便方法。
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本文内容
摘要
摘要
基于多胺的肽两亲分子（PPA）是一类新型的可自组装两亲性生物材料，与肽两亲分子（PA）密切相关。传统的PA以带电氨基酸（如赖氨酸、精氨酸）作为增溶基团，这些基团可直接连接到脂质段，也可包含由中性氨基酸组成的连接区域。通过调控PA的肽序列，可以获得多种不同的形貌结构。类似地，PPA也包含疏水段和中性氨基酸，但其水溶性（亲水）基团为多胺分子。与PA一样，当溶解于水中时，PPA也能自组装形成多种不同的纳米结构，包括小棒状结构、扭曲的纳米带以及融合的纳米片层。然而，由于单个多胺分子上同时存在伯胺和仲胺，这给PPA的合成带来了显著挑战。本文中，我们基于已有文献报道，展示了一种简便的合成PPA的实验方案，该方案采用固相肽合成法（SPPS），操作简便。此方法也可推广应用于PA及其他类似体系的合成。我们还详细说明了从树脂上裂解、产物鉴定及纯化所需的各个步骤。
引言
自组装肽两亲分子（PAs）是一类生物材料，通常包含以下结构片段：（a）亲水性头部，（b）连接区，和（c）疏水性尾部。文献中描述的大多数PAs具有由带电荷或极性氨基酸残基组成的亲水性头部。1,2,3,4. 聚酰胺类材料在生物医学领域已得到广泛应用，包括药物递送、疾病诊断、再生医学， 等等。5根据其氨基酸序列，肽两亲物（PAs）可形成多种纳米结构，包括球形胶束和纳米纤维。我们近期报道了一类基于杂化聚胺的肽两亲物，称为PPAs6这些生物材料的形态、自组装动力学及其代谢降解行为被发现与其溶解性头基团相关。此外，PPA纳米结构在测试浓度下对哺乳动物细胞（MiaPaCa2和HeLa细胞系）未表现出毒性。基于PPA的纳米载体是颇具吸引力的药物递送系统，原因在于：（1）已证实癌细胞中多胺的摄取与代谢增强；（2）阳离子型纳米结构可实现内体逃逸。7,8，这会导致其在细胞内的循环和滞留时间更长；（3）与PA相比，应具有明显不同的代谢特征，例如，对人体内存在的蛋白酶具有更高....
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方案
1. 聚磷酸酯合成的通用方案
- 计算合成规模（通常以 mmol 为单位）。该规模基于目标多肽酸（PPA）的质量。需注意，固相肽合成（SPPS）的反应效率随着氨基酸序列长度的增加而逐渐降低，因此难以精确计算实际反应效率。
- 根据树脂的载量计算所需树脂的重量。载量信息可在树脂容器或分析方案上找到，单位为 mmol/g。可使用以下公式计算树脂的重量：
- 准确称取2-氯三苯甲基氯树脂（本实验中载量约为0.85 mmol）
- 将树脂置于规格如下的一次性烧结玻璃合成容器中：容量 – 50 mL，烧结玻璃盘直径 – 25 mm，孔隙度 – 中等。
- 向树脂中加入15 mL二氯甲烷（DCM）。
- 将合成容器固定在可调速机械摇床（烧瓶摇床/搅拌器）上，并将容器调至45°角（或水平）以最大程度地增强振荡效果。
- 让树脂珠溶胀15分钟。溶胀可提高反应产率，因为它有助于分子扩散并增加对活性位点的可及性，从而提升偶联效率。
- 加入8当量（以0.25 mmol为基准，则为2 mmol）所需多胺（Spermine、Spermidine、Diethylenetriamine、1,3-diaminopropane） 等等。) 加入树脂中，反应5小时。
注意：较短的反应时间会降低产率。 - 进行 Kaiser 检测（参见 材料表）以确认多胺....
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结果
在合成与纯化之后、进行理化或生物学评价之前，建议使用分析型高效液相色谱法（HPLC）重新检测PPA的分子量并确认其纯度。用于材料表征或生物学评价的PPA，其纯度需达到 >95%. 图2 显示高效液相色谱图谱（上图）和基质辅助激光解吸电离质谱图（下图），证实产物的存在。高效液相色谱分析系统将计算曲线下面积（AUC），并给出AUC >95% 可归因于产品纯度。在基于紫外检测的高效液相色谱系统中，应观察到单一且尖锐的峰。基质辅助激光解吸电离质谱图应与聚磷酸腺苷（PPA）的理论分子量在 ±1 Da 范围内相符（具体取决于 MALDI 分析模式）。
PPA的自组装过程可以通过多种技术进行观察和分析，包括透射电子显微镜（TEM）（图3A、B）、原子力显微镜（AFM）（
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讨论
本文所述方案可用于合成PPA以及PA和相关肽类分子（如杂合PA-肽素）。尽管使用固相肽合成法（SPPS）合成肽类分子是一种常规操作，但合成含有生物归巢分子的肽类则尤为困难。多胺类物质如精胺、亚精胺、二乙烯三胺， 等等。，可作为靶向癌细胞的归巢分子13PPA 可以自组装成具有多种形态的纳米结构6其正电荷还有助于延长循环时间（由于内体逃逸作用）并产生不同于传统聚酰胺（PA）的代谢特征。然而，由于分子中存在伯胺和仲胺，合成聚酰胺（PPA）及其类似物可能面临特殊挑战。本文所展示的合成策略通过合理使用正交保护基团克服了这一难题。Dde分子可选择性地仅与伯胺发生反应。11另一方面，Boc 会无差别地与伯胺和仲胺发生反应，因此只能在伯胺被保护后才能加入。需要说明的是，除 Boc 外，也可使用其他保护基。例如，与乙酸酐反应可永久性地乙酰化仲胺（该基团在裂解过程中不会被去除）；同样，使用三氟乙酸酐可获得对碱敏感的保护基团，而苄基氨基甲酸酯（benzylcarbamate）则可提供可通过 H 还原.......
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致谢
本项目由内布拉斯加大学医学中心（启动资金，MC-S）；NIH-COBRE，5P20GM103480（T. Bronich）；以及美国化学会，PRF# 57434-DNI7（MC-S）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 2-氯三苯氯树脂 | AappTec | RTZ001 | |
| SynthwareTM 合成反应器 | Aldrich | SYNP120050M | |
| 二氯甲烷 | Acros | AC406920250 | Fisher Sci. 目录号 |
| 腕式摇床 | Boekel Scientific | 401000-2 | |
| Kaiser 检测试剂盒 | Sigma-Aldrich | 60017 | |
| 2-[(4,4-二甲基-2,6-二氧代环己-1-亚基)乙氨基]-乙醇 | Sigma-Aldrich | CDS004772 | |
| 无水甲醇 | Acros | AC610981000 | Fisher Sci. 目录号 |
| 氯醌检测试剂盒 | TCI | TCC1771-KIT | VWR 目录号 |
| 二叔丁基二碳酸酯 | Acros | AC194670250 | Fisher Sci. 目录号 |
| 二甲基甲酰胺 | Fisher Scientific | BP1160-4 | |
| 肼 | Acros | AC296815000 | Fisher Sci. 目录号 |
| (2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸盐) | p3biosystems | 31001 | |
| 4-甲基哌啶 | Acros | AC127515000 | Fisher Sci. 目录号 |
| 三氟乙酸 | AappTec | CXZ035 | |
| 三异丙基硅烷 | Sigma-Aldrich | 233781 | |
| 乙醚 | Fisher Scientific | E138-1 | |
| α-氰基-4-羟基肉桂酸 | Sigma-Aldrich | C8982 | |
| 9-氨基吖啶 | Sigma-Aldrich | 92817 | |
| Fisherbrand 注射器滤器：PTFE 膜 | Fisher Scientific | 09-730-21 |
参考文献
- Cui, H., Pashuck, E. T., Velichko, Y. S., Weigand, S. J., Cheetham, A. G., Newcomb, C. J., Stupp, S. I. Spontaneous and x-ray-triggered crystallization at long range in self-assembling filament networks. Science. 327, 555-559 (2010).
- Pashuck, E. T., Cui, H., Stupp, S. I.
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