方法文章

自组装多胺基多肽 Amphiphiles (PPAs) 及相关生物材料的简易合成协议

DOI：

10.3791/57908

⸱

2018年6月25日

 ,  ,  , 
1Department of Pharmaceutical Sciences, University of Nebraska Medical Center

本文内容

摘要

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多胺基肽 amphiphiles (PPAs) 的合成是一个重要的挑战, 由于存在多种胺氮, 这需要明智地使用保护组来掩盖这些反应功能。本文介绍了一种简便的制备这些新型自组装分子的方法。

摘要

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多胺基多肽 Amphiphiles (PPAs) 是一种新型的自组装的两亲性生物材料-与肽 Amphiphiles (PAs) 有关。传统的 PAs 有被充电的氨基酸作为溶出的小组 (赖氨酸, 精氨酸), 直接地连接到油脂片断或可能包含由中性氨基酸制成的链接器区域。调谐肽序列的 PAs 可以产生不同的形态。同样, PPAs 具有疏水性段和中性氨基酸, 但也含有多胺分子作为溶水 (亲水性) 基团。与 PAs 的情况一样, PPAs 也可以自组装成不同的形貌, 包括小棒, 扭曲纳米带, 和熔融纳米片, 当溶解在水中。然而, 在单个多胺分子上存在主要和次要胺, 在合成 PPAs 时会带来重大挑战。在本文中, 我们展示了一个简单的协议, 基于文献先例, 以实现一个简便的合成 PPAs 使用固相肽合成 (许可证)。该议定书可扩展到考绩制度和其他类似系统的综合。我们还说明了从树脂, 鉴定和纯化所需的步骤。

引言

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自组装肽 amphiphiles (PAs) 是一类生物材料, 通常由以下部分组成: (a) 亲水性头, (b) 链接器区域, (c) 疏水尾。文献中描述的大多数 PAs 具有亲水性的头, 由带电或极性氨基酸残留物1,2,3,4组成。PAs 已经在生物医学中发现了广泛的应用, 包括药物传递, 疾病诊断, 再生医学等5。在氨基酸序列的基础上, PAs 可以形成各种各样的纳米结构, 包括球形胶束和纳米丝。我们最近报告了一类混合多胺基肽 amphiphiles, 称为 PPAs6。这些生物材料的形貌、自组装动力学和代谢降解都与它们的溶出头组有关。此外, 苯丙醇纳米结构并没有对哺乳动物细胞 (MiaPaCa2 和 HeLa 细胞系) 在经过测试的浓度上表现出毒性。基于苯丙醇的 nanocarriers 是有吸引力的药物运载工具, 因为: (1) 多胺的摄取和新陈代谢已被证明在癌细胞中增加, (2) 阳离子纳米结构可以实现细胞膜逃逸7,8,这导致细胞内的循环和....

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方案

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1. PPAs 合成通用议定书

  1. 计算合成的尺度 (通常为毫摩尔)。此刻度基于目标 PPA 金额的质量。请记住, 随着氨基酸序列的增加, 许可证的反应效率逐渐降低。因此, 准确的反应效率是难以计算的。
  2. 根据树脂的载荷计算出所用树脂的重量。装载在树脂的容器或分析协议被发现并且表达在毫摩尔/g。以下公式可用于计算树脂的重量:
  3. 仔细权衡 2-chlorotrityl 氯树脂 (在我们的情况下, 负载是 ~ 0.85 毫摩尔)
  4. 将树脂置于烧结合成容器中, 其规格如下: 容量-50 毫升, 烧结盘-25 毫米, 孔隙度-介质。
  5. 向树脂中添加15毫升二氯甲烷 (DCM)。
  6. 将合成容器粘贴到变速机械振动筛 (烧瓶式振动筛/搅拌器) 上, 并将容器转到45°角 (或水平) 以最大程度地搅拌。
  7. 允许树脂珠膨胀15分钟, 提高反应的屈服率, 因为它有利于分子扩散和可进入活性部位, 提高耦合效率。
  8. 将所需多胺 (胺、胺、Diethyelenetriamine、13丙烷等) 的8当量 (2 毫摩尔) 添加到树脂上, 并允许其对 5 h 进行反应。
    注意: 一个较小的反应期会降低产量。
  9. 做一个凯撒测试 (见材料表), 以确认多胺与树脂的成功耦合。主要胺的成功的联结产生紫罗兰色或蓝色, 对应于自由胺。
  10. 用4....

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结果

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在合成纯化后, 在理化或生物评价之前, 建议 PPAs 的质量进行重新检查, 用解析 HPLC 法确定纯度。对于材料表征或生物评价, PPAs 需要纯度 > 95%。图 2显示了 HPLC 示踪 (顶端) 和 MALDI 光谱 (底部) 确认产品的存在。高效液相色谱分析系统将整合曲线下的区域 (联合自卫队), 联合自卫 > 95% 可与产品纯度相关。在紫外基高效液相色谱系统中, 期望看到一个单一的, 尖峰。MALDI 谱应与±1中苯丙醇的计算分子量相对应 (取决于 MALDI 的分析模式)。

PPAs 的自组装可以通过多种技术进行可视化和分析, 包括透射电镜 (图 3A、B)、原子力显微镜 (AFM) (图 3C、.......

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讨论

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这里描述的协议可以用来合成 PPAs 作为 PAs 和相关的肽基分子 (如混合 peptoids)。虽然使用许可证合成肽是一个简单的过程, 但合成含有生物自导分子的肽尤其具有挑战性。多胺如胺、胺、diethyelenetriamine等, 可作为靶向分子定位于肿瘤细胞13。PPAs 可以自组装成具有不同形貌的纳米结构6。他们的正电荷还可以帮助更长的循环时间 (由于细胞膜逃逸) 和不同的代谢剖面 (与传统 PA 相比)。然而, 合成 PPAs 及其类似物可能是一个特殊的挑战, 因为存在的主要和次要胺。通过对正交保护群的合理使用, 提出了综合策略, 克服了这一挑战。Dde 分子有选择地仅发生反应与主要胺11。另一方面, 中行不加区别地与主要和次要胺反应, 因此, 只能添加后, 主胺被保护。我们想指出的是, 其他保护团体可以代替中银使用。例如, 与醋酸酐的反应将永久 acetylate 二胺 (这个组不会被去除在分裂期间)。同样, 使用 trifluoacetic 酸酐将提供一个基敏.......

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披露

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作者没有利益冲突申报

致谢

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该项目由内布拉斯加州大学医学中心 (开办基金, MC) 资助;NIH-COBRE, 5P20GM103480 (t Bronich) 和美国化学学会, PRF 57434 号-DNI7 (MC S)。

....

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
2-氯三苯基树脂 AappTecRTZ001
SynthwareTM 合成容器 AldrichSYNP120050M
二氯甲烷AcrosAC406920250Fisher Sci. 目录 #
Wrist ShakerBoekel Scientific401000-2
Kaiser 测试套件Sigma-Aldrich60017
2-[（4,4-二甲基-2,6-二氧代环己-1-亚基）乙基氨基]-乙醇Sigma-AldrichCDS004772
无水甲醇AcrosAC610981000Fisher Sci. 目录 #
氯苯胺检测试剂盒TCITCC1771-KITVWR 目录 #
二叔丁基二碳酸酯 AcrosAC194670250Fisher Sci. 目录 #
二甲基甲酰胺Fisher ScientificBP1160-4
肼AcrosAC296815000FIsher Sci. 目录 #
（2-（1H-苯并三唑-1-基）-1,1,3,3-四甲基六氟磷酸脲）p3biosystems31001
4-甲基哌啶 AcrosAC127515000FIsher Sci. 目录 #
三氟乙酸AappTecCXZ035
三异丙基硅烷Sigma-Aldrich233781
醚Fisher ScientificE138-1
&α;-氰基-4-羟基肉桂酸Sigma-AldrichC8982
9-氨基吖啶Sigma-Aldrich92817
费舍尔品牌 针式过滤器：PTFE 膜Fisher Scientific09-730-21
9-氨基吖啶 Sigma-Aldrich C8982

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cui, H., Pashuck, E. T., Velichko, Y. S., Weigand, S. J., Cheetham, A. G., Newcomb, C. J., Stupp, S. I. Spontaneous and x-ray-triggered crystallization at long range in self-assembling filament networks. Science. 327, 555-559 (2010).
  2. Pashuck, E. T., Cui, H., Stupp, S. I.

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