由于多胺类化合物含有多个氨基氮原子，因此基于多胺的肽两亲分子（PPAs）的合成具有较大挑战性，需要审慎使用保护基团来屏蔽这些活性官能团。本文中，我们描述了一种制备这类新型自组装分子的简便方法。
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摘要
摘要
基于多胺的肽两亲分子（PPA）是一类新型的可自组装两亲性生物材料，与肽两亲分子（PA）密切相关。传统的PA以带电氨基酸（如赖氨酸、精氨酸）作为增溶基团，这些基团可直接连接到脂质段，也可包含由中性氨基酸组成的连接区域。通过调控PA的肽序列，可以获得多种不同的形貌结构。类似地，PPA也包含疏水段和中性氨基酸，但其水溶性（亲水）基团为多胺分子。与PA一样，当溶解于水中时，PPA也能自组装形成多种不同的纳米结构，包括小棒状结构、扭曲的纳米带以及融合的纳米片层。然而，由于单个多胺分子上同时存在伯胺和仲胺，这给PPA的合成带来了显著挑战。本文中，我们基于已有文献报道，展示了一种简便的合成PPA的实验方案，该方案采用固相肽合成法（SPPS），操作简便。此方法也可推广应用于PA及其他类似体系的合成。我们还详细说明了从树脂上裂解、产物鉴定及纯化所需的各个步骤。
引言
自组装肽两亲分子（PAs）是一类生物材料，通常包含以下结构片段：（a）亲水性头部，（b）连接区，和（c）疏水性尾部。文献中描述的大多数PAs具有由带电荷或极性氨基酸残基组成的亲水性头部。1,2,3,4. 聚酰胺类材料在生物医学领域已得到广泛应用，包括药物递送、疾病诊断、再生医学， 等等。5根据其氨基酸序列，肽两亲物（PAs）可形成多种纳米结构，包括球形胶束和纳米纤维。我们近期报道了一类基于杂化聚胺的肽两亲物，称为PPAs6这些生物材料的形态、自组装动力学及其代谢降解行为被发现与其溶解性头基团相关。此外，PPA纳米结构在测试浓度下对哺乳动物细胞（MiaPaCa2和HeLa细胞系）未表现出毒性。基于PPA的纳米载体是颇具吸引力的药物递送系统，原因在于：（1）已证实癌细胞中多胺的摄取与代谢增强；（2）阳离子型纳米结构可实现内体逃逸。7,8，这会导致其在细胞内的循环和滞留时间更长；（3）与PA相比，应具有明显不同的代谢特征，例如，对人体内存在的蛋白酶具有更高的稳定性（尽管可能对其他酶类，如胺氧化酶敏感）9,10此外，根据单个PPA分子的长度和电荷不同，PPA可表现出多样的形态、理化性质、纳米颗粒刚度以及组装动力学特性。6本文中，我们描述了一种用于合成、鉴定和纯化PPA的详细方案，该方案也可应用于PA或类似杂交肽分子的制备。
由于多胺通常无法在市场上获得其保护形式，且由于在将多胺与氨基酸及其他分子偶联时，保护其伯胺和仲胺至关重要，因此我们概述了实现其保护的合成步骤。本方案的总体目标是提供一种将多胺与氨基酸偶联的简便方法。多胺缺乏羧基，因此无法与Rink Amide或Wang树脂偶联。建议在合成方案中使用2-氯三苯甲基氯等树脂。PPA合成的主要挑战在于多胺分子中存在伯胺和仲胺官能团。在本研究中，我们保护了多胺中的所有仲胺，同时保留多胺上的伯氨基游离，以利于偶联反应的进行。该反应在固相载体上进行，遵循固相多肽合成（SPPS）的原理，以便于每次偶联和去保护步骤后的纯化处理。以下方案适用于PPA的手动和自动合成（尽管在自动系统中某些步骤的验证可能存在困难）。这些分子的合成也可在自动合成仪上进行，或借助微波反应器（全自动或半自动）完成。反应路线已总结于图1中。
图1： (A) PPA合成的通用反应路线图。(B) 可用于合成本文所述PPA的代表性多胺。请点击此处查看该图的放大版本。
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方案
1. 聚磷酸酯合成的通用方案
- 计算合成规模（通常以 mmol 为单位）。该规模基于目标多肽酸（PPA）的质量。需注意，固相肽合成（SPPS）的反应效率随着氨基酸序列长度的增加而逐渐降低，因此难以精确计算实际反应效率。
- 根据树脂的载量计算所需树脂的重量。载量信息可在树脂容器或分析方案上找到，单位为 mmol/g。可使用以下公式计算树脂的重量：
- 准确称取2-氯三苯甲基氯树脂（本实验中载量约为0.85 mmol）
- 将树脂置于规格如下的一次性烧结玻璃合成容器中：容量 – 50 mL，烧结玻璃盘直径 – 25 mm，孔隙度 – 中等。
- 向树脂中加入15 mL二氯甲烷（DCM）。
- 将合成容器固定在可调速机械摇床（烧瓶摇床/搅拌器）上，并将容器调至45°角（或水平）以最大程度地增强振荡效果。
- 让树脂珠溶胀15分钟。溶胀可提高反应产率，因为它有助于分子扩散并增加对活性位点的可及性，从而提升偶联效率。
- 加入8当量（以0.25 mmol为基准，则为2 mmol）所需多胺（Spermine、Spermidine、Diethylenetriamine、1,3-diaminopropane） 等等。) 加入树脂中，反应5小时。
注意：较短的反应时间会降低产率。 - 进行 Kaiser 检测（参见 材料表）以确认多胺成功连接至树脂。伯胺成功连接会产生紫色/蓝色，表明存在游离胺。
- 使用4当量的1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代环己-1-亚基)乙基（Dde）溶于无水甲醇（15 mL）中，过夜振荡反应混合物以保护伯胺基团11.
注意：反应时间较短会降低产率。 - 进行凯撒试验。若树脂珠无蓝色出现，则表明伯胺保护成功。若伯胺保护未成功，请重复上一步操作。
- 除去二氯甲烷，并用二氯甲烷与N,N-二甲基甲酰胺的混合液（2:1，15 mL）洗涤树脂两次。
- 将20当量（5 mmol）二叔丁基二碳酸酯（Boc）溶于二氯甲烷（DCM，20 mL）中，反应持续3小时。
- 进行氯醌试验（参见 材料表）以确认仲胺的完全保护。阳性结果（已保护）呈无色或淡黄色。游离的仲胺呈深绿色/蓝色，而伯胺则呈红色。
- 除去溶剂混合物，并用二氯甲烷与N,N-二甲基甲酰胺的混合液（2:1，15 mL）洗涤两次。
- 加入10 mL含2%水合肼的DMF溶液，振荡反应1小时。
- 进行凯撒试验以确认伯胺的脱保护反应成功。
- 以与书写或绘制顺序相反的序列添加所需的氨基酸。肽链通常从N端向C端绘制，但其合成方向相反，即从C端到N端。例如，若要制备含有核心肽序列-GLFD-的PPA，应依次添加天冬氨酸（D）、苯丙氨酸（F）、亮氨酸（L），最后添加甘氨酸（G）。
注意：对于大多数氨基酸，以下偶联混合液适用于与负载多胺的树脂进行连接。- 将4当量（1 mmol）Fmoc保护的氨基酸、3.95当量的1-羟基苯并三唑-六氟磷酸盐（HBTU）和15当量的N,N-二异丙基乙胺（DIPEA）混合。
- 用二氯甲烷与DMF的混合液（1:1，15 mL）溶解，超声处理混合液2分钟（直至完全溶解）。
- 等待额外的3–5分钟，以确保氨基酸上的羧基被充分活化。
- 将反应混合物加入反应容器中，在室温下反应2-4小时。
注意：我们发现以下试剂可作为 HBTU 的有效替代品（通常需要更少的氨基酸和缩合剂）：COMU、PyBOP、HATU、DIC/Oxima。 - 进行凯撒试验以确认偶联成功。
- 通过向氨基酸中加入20%的4-甲基哌啶（10 mL）DMF溶液，脱除Fmoc保护基。重复操作两次，每次振荡反应混合物15分钟。
注意：去除Fmoc的一个高效替代方法是使用哌嗪/DBU12.- 每次添加之间用二氯甲烷（15 mL）洗涤。
- 进行凯撒试验以确认氨基酸的脱保护反应成功。
- 用 DMF（10 mL）洗涤树脂两次，每次 5 分钟，以彻底去除 4-甲基的残留；最后用 DCM（10 mL）洗涤 10 分钟。
- 通过依次重复偶联和脱保护步骤，加入所有剩余的氨基酸。
- 最后，在连接完所有必需的氨基酸后，将疏水性尾部与多胺-肽结构的最后一个氨基酸进行偶联：
- 将10当量的目标羧酸官能团加入到溶于DCM与DMF混合液（1:1，20 mL）的9.5当量HBTU和12当量DIPEA中。
注意：某些尾段可能需要不同比例的溶剂（通常增加二氯甲烷的比例）或添加其他溶剂，如N-甲基吡咯烷酮（NMP）。 - 将混合物超声处理5–10分钟，直至完全溶解（我们观察到尾部完全溶解所需时间可能更长），然后加入容器中。
注意：对于含有多个反应位点的尾链，在偶联前需要对其进行保护。 - 至少反应5小时，但建议过夜反应以获得最高产率。
- 将10当量的目标羧酸官能团加入到溶于DCM与DMF混合液（1:1，20 mL）的9.5当量HBTU和12当量DIPEA中。
2. 固相载体上PPA的裂解
此步骤的目的是将PPA从树脂上裂解下来，并去除氨基酸和多胺残基上的Boc保护基团。
- 用 DMF 洗涤树脂（8 mL，2 分钟），再用 DCM 洗涤两次（每次 8 mL，5 分钟）。每次添加洗涤液前，将容器中的溶剂排尽。最后一次洗涤完成后，在真空条件下干燥树脂 15 分钟。
- 使用以下混合比例配制裂解溶液：28:1:1 三氟乙酸（TFA）: H2O：三异丙基硅烷（TIPS）。配制15 mL裂解鸡尾酒溶液时，将14 mL三氟乙酸（TFA）与0.5 mL H2O 和 0.5 mL TIPS。
- 将此裂解液加入树脂中，在室温下振荡反应2–4小时。
- 将溶液收集至25或50 mL的圆底烧瓶中。
- 浓缩 TFA 在真空中 在40 °C下加热混合物，同时使用旋转蒸发仪在减压条件下浓缩至1–2 mL（温度不得超过55 °C，以避免PPA分解）。
- 蒸发后，将所得的TFA溶液（逐滴）加入含有无水冷乙醚（15 mL）的圆底烧瓶中。此时PPA将立即沉淀析出。
- 此外，向原先浓缩TFA的烧瓶中加入无水冷乙醚（5 mL）。
- 超声处理该烧瓶以回收更多固体，并与步骤 2.6 中的乙醚溶液合并。
注意：可使用少量二氯甲烷（DCM）清洗转移用移液管。避免在操作过程中引入N,N-二甲基甲酰胺（DMF），因其易形成凝胶状物质。 - 将烧瓶（加盖）放入冰箱，静置过夜，以最大程度促进沉淀。
- 使用烧结玻璃砂芯漏斗通过真空过滤收集沉淀物。理想的孔径为细孔或中孔。
- 用冷乙醚（5–10 mL）洗涤沉淀物两次，以去除残留的有机物。
3. 使用基质辅助激光解吸电离干燥液滴法鉴定粗产物
- 正离子模式下分析用基质的制备：
- 为开始使用基质辅助激光解吸电离（MALDI）质谱进行分子量分析，取10至20 mg的α-氰基-4-羟基肉桂酸加入微量离心管中。
- 加入含0.1%三氟乙酸（TFA）的水/乙腈溶液（1:1，1.0 mL），并通过涡旋充分混匀。
注意：该基质适用于带正电荷的肽段。MALDI负离子模式操作类似，但需使用含0.1%氨水的9-氨基吖啶作为基质，并以氨水作为溶剂添加剂。 - 取1–2 µL样品点加至MALDI不锈钢靶板上，空气中自然干燥；再加入1–2 µL基质溶液，再次干燥。
注意：靶板表面具有圆形标记，呈网格状排列，有助于定位特定点样位置。
- 使用MALDI仪器分析样品以确认其身份。电喷雾电离（ESI）是验证PPA身份的有效替代方法。
4. 使用制备型反相高效液相色谱（HPLC）纯化PPA
- 将PPA沉淀物溶解于最小量的乙腈和水中。
- 经验法则：将100 mg干燥粗品PPA溶解于少于5 mL的乙腈和水混合溶剂中。疏水性更强的PPA可能需要更高比例的乙腈才能溶解，且总体可能需要更大的溶剂体积，具体取决于PPA的净电荷（表1）。
- 若未能完全溶解，可加入1%三氟乙酸（TFA）（溶于乙腈或H2O）。也可加入少量其他相容性溶剂，如二甲基亚砜、甲醇或异丙醇（含量限制在5%以内）。
| 溶剂 | 带正电荷的PPA | 带负电荷的PPA | ||
| 含0.1% TFA的水溶液 | 含0.1% NH3的水溶液 | |||
| 含0.1% TFA的乙腈溶液 | 含0.1% NH3的乙腈溶液 | |||
表1：溶剂体系。 针对带正电荷和负电荷的PPA推荐的溶剂体系。
- 使用探头超声仪对PPA进行超声处理，以48%振幅进行20分钟、每次10秒的脉冲处理；或者在超声清洗槽中处理2-3小时。
- 随后，先用0.45 μm针筒过滤器过滤，再用0.20 μm聚四氟乙烯（PTFE）针筒过滤器过滤。PPA溶液应澄清，不含任何颗粒物质。
- 如果过滤困难，可延长超声时间。强烈建议在针筒过滤后立即进行PPA溶液的纯化，因为长期储存可能导致其聚集或形成凝胶，从而需要重新超声，甚至重新过滤。
- 在纯化过程中及纯化后，使用HPLC级溶剂，或通过0.25 μm针筒过滤器/膜过滤的溶剂。
注：纯化PPA最常用的溶剂条件为H2O与ACN的梯度洗脱体系。 - 本方案应使用标准的反相高效液相色谱（HPLC）仪器，需配备洗脱梯度程序控制器、二元溶剂输送系统、可在220 nm和254 nm波长下检测的紫外检测器，以及可编程的组分收集器。最大流速应达到50 mL/min。
- 使用C-18反相色谱柱进行分离。可根据待纯化固体的质量及PPA的净电荷，选用以下尺寸的色谱柱（表2）。
| PPA 电荷 | 颗粒大小 | 色谱柱尺寸 | 粗提 PPA 质量 |
| + ve 电荷 | 5 μm | 150 x 30 mm | 170 mg |
| - ve 电荷 | 5 μm | 150 x 30 mm | 170 mg |
| + ve 电荷 | 5 μm | 150 x 21.2 mm | 90 mg |
| - ve 电荷 | 5 μm | 150 x 21.2 mm | 90 mg |
表2：建议的色谱柱参数：C18反相高效液相色谱柱的柱尺寸、颗粒大小及每次进样的最大载样量
- 根据色谱柱的载样量和高效液相色谱仪进样环的体积确定PPA的进样体积。按照表3中的设置运行高效液相色谱梯度洗脱程序（洗脱时间为40分钟）。
| 时间 | 溶剂 A（乙腈） | 溶剂 B（水） | 流速 (mL/min) |
| 0 | 5% | 95% | 流速取决于色谱柱填料及其尺寸。 |
| 2 | 5% | 95% | |
| 35 | 95% | 5% | |
| 38 | 100% | 0% | |
| 40 | 5% | 95% |
表3：建议的梯度： 建议的反相梯度，显示在一段时间内水与乙腈的相对组成。流速将取决于色谱柱的规格。
- 使用 MALDI 分析收集在各个试管中的组分，并确定哪个（或哪些）试管含有 PPA。通过研究每个试管中检测到的分子量来评估。
- 在分析型 HPLC 上检测各组分的纯度。使用配备在 220 nm 处设置的紫外检测器的 HPLC 梯度系统。
- 如果存在杂质，需通过 HPLC 进行额外一轮纯化。上述用于制备型 HPLC 的梯度可通过在线柱转换软件缩小比例后用于分析型 HPLC。每个组分在进行物理表征或生物学评价前，纯度必须 ≥95%。
- 将收集的组分转移至一个大容量的圆底烧瓶或蒸发烧瓶中，去除全部乙腈和大部分水。最终的 PPA 溶液体积不应超过 10 mL。
- 将此浓缩液转移至一个 50 mL 离心管中。请注意，PPA 是类似去污剂的物质，因此在溶剂蒸发过程中会产生气泡。我们发现加入乙醇可减少气泡的形成。
- 对浓缩液进行真空浓缩。在真空蒸发过程中，大量 PPA 可能会黏附在容器壁上。可通过反复用 HPLC 级水冲洗瓶壁来回收这部分物质。浓缩后的 PPA 溶液与冲洗液的总体积不应超过 30 mL。
- 将水溶液置于一个 50 mL 管中。
- 用液氮对 PPA 溶液进行速冻：
注意：速冻可形成较小的冰晶，从而在冻干过程中更快升华。此外，缓慢冷冻可能导致自组装的超分子结构形成。另一种可选但不推荐的方法是逐步在 -80 °C 冰箱中冷冻，或使用干冰加丙酮混合物进行冷冻。- 在将离心管放入冻干机前，应刺破或松开管盖，以使样品中的水分能够逸出并被冷凝单元收集。将冻干机设置为 -54 °C 和 0.016 mbar。
注意：也可选择取下管盖，并在管口覆盖一层擦拭纸（用橡皮筋固定）。此外，我们发现将样品倾斜冷冻或将冰打碎成小块，可因增大表面积而实现更快、更充分的冻干。 - 如果固体开始融化，可能表明样品中残留有有机溶剂（通常为乙腈）。应重复冷冻步骤，并评估冻干状态。
- 如果融化现象持续存在，有两种可能的解决方案：
- 将样品分为两份（分别置于两个管中），加水稀释后再次冷冻。此方法不宜频繁使用，因为大量有机溶剂可能损坏设备。
- 或者，将样品置于烧瓶中，在真空下进一步蒸发去除有机溶剂。直接对液态样品进行冻干通常会导致暴沸和 PPA 化合物的损失。
- 在将离心管放入冻干机前，应刺破或松开管盖，以使样品中的水分能够逸出并被冷凝单元收集。将冻干机设置为 -54 °C 和 0.016 mbar。
5. PPAs 的储存
- 将PPA储存于-20 °C，管盖拧紧并用Parafilm密封，试管上贴好适当标签。
- 使用前，将PPA置于真空室中恢复至室温，以避免水蒸气在PPA上冷凝。
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结果
在合成与纯化之后、进行理化或生物学评价之前，建议使用分析型高效液相色谱法（HPLC）重新检测PPA的分子量并确认其纯度。用于材料表征或生物学评价的PPA，其纯度需达到 >95%. 图2 显示高效液相色谱图谱（上图）和基质辅助激光解吸电离质谱图（下图），证实产物的存在。高效液相色谱分析系统将计算曲线下面积（AUC），并给出AUC >95% 可归因于产品纯度。在基于紫外检测的高效液相色谱系统中，应观察到单一且尖锐的峰。基质辅助激光解吸电离质谱图应与聚磷酸腺苷（PPA）的理论分子量在 ±1 Da 范围内相符（具体取决于 MALDI 分析模式）。
PPA的自组装过程可以通过多种技术进行观察和分析，包括透射电子显微镜（TEM）（图3A、B）、原子力显微镜（AFM）（
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讨论
本文所述方案可用于合成PPA以及PA和相关肽类分子（如杂合PA-肽素）。尽管使用固相肽合成法（SPPS）合成肽类分子是一种常规操作，但合成含有生物归巢分子的肽类则尤为困难。多胺类物质如精胺、亚精胺、二乙烯三胺， 等等。，可作为靶向癌细胞的归巢分子13PPA 可以自组装成具有多种形态的纳米结构6其正电荷还有助于延长循环时间（由于内体逃逸作用）并产生不同于传统聚酰胺（PA）的代谢特征。然而，由于分子中存在伯胺和仲胺，合成聚酰胺（PPA）及其类似物可能面临特殊挑战。本文所展示的合成策略通过合理使用正交保护基团克服了这一难题。Dde分子可选择性地仅与伯胺发生反应。11另一方面，Boc 会无差别地与伯胺和仲胺发生反应，因此只能在伯胺被保护后才能加入。需要说明的是，除 Boc 外，也可使用其他保护基。例如，与乙酸酐反应可永久性地乙酰化仲胺（该基团在裂解过程中不会被去除）；同样，使用三氟乙酸酐可获得对碱敏感的保护基团，而苄基氨基甲酸酯（benzylcarbamate）则可提供可通过 H 还原...
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致谢
本项目由内布拉斯加大学医学中心（启动资金，MC-S）；NIH-COBRE，5P20GM103480（T. Bronich）；以及美国化学会，PRF# 57434-DNI7（MC-S）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 2-氯三苯氯树脂 | AappTec | RTZ001 | |
| SynthwareTM 合成反应器 | Aldrich | SYNP120050M | |
| 二氯甲烷 | Acros | AC406920250 | Fisher Sci. 目录号 |
| 腕式摇床 | Boekel Scientific | 401000-2 | |
| Kaiser 检测试剂盒 | Sigma-Aldrich | 60017 | |
| 2-[(4,4-二甲基-2,6-二氧代环己-1-亚基)乙氨基]-乙醇 | Sigma-Aldrich | CDS004772 | |
| 无水甲醇 | Acros | AC610981000 | Fisher Sci. 目录号 |
| 氯醌检测试剂盒 | TCI | TCC1771-KIT | VWR 目录号 |
| 二叔丁基二碳酸酯 | Acros | AC194670250 | Fisher Sci. 目录号 |
| 二甲基甲酰胺 | Fisher Scientific | BP1160-4 | |
| 肼 | Acros | AC296815000 | Fisher Sci. 目录号 |
| (2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸盐) | p3biosystems | 31001 | |
| 4-甲基哌啶 | Acros | AC127515000 | Fisher Sci. 目录号 |
| 三氟乙酸 | AappTec | CXZ035 | |
| 三异丙基硅烷 | Sigma-Aldrich | 233781 | |
| 乙醚 | Fisher Scientific | E138-1 | |
| α-氰基-4-羟基肉桂酸 | Sigma-Aldrich | C8982 | |
| 9-氨基吖啶 | Sigma-Aldrich | 92817 | |
| Fisherbrand 注射器滤器：PTFE 膜 | Fisher Scientific | 09-730-21 |
参考文献
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