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方法文章

利用小鼠心脏切片进行组织特异性miRNA表达谱分析 原位 杂交

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DOI：

10.3791/57920

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2018年9月15日

 ,  , 
1Department of Cell and Developmental Biology, University College London, 2Yale Cardiovascular Research Group, Section of Cardiovascular Medicine, Yale School of Medicine, 3Yale Cardiovascular Research Center, Section of Cardiovascular Medicine, Yale School of Medicine

本文内容

摘要

micro-RNAs（miRNAs）是一类短小且高度同源的RNA序列，可作为信使RNA（mRNAs）的转录后调控因子。目前的miRNA检测方法在灵敏度和特异性方面存在差异。本文描述了一种结合了 原位 小鼠心脏组织切片中miRNA与蛋白质分子的杂交及免疫染色共检测

摘要

micro-RNAs（miRNAs）是单链RNA转录本，可结合信使RNA（mRNAs）并抑制其翻译或促进其降解。迄今为止，miRNAs已被证实参与大量生物学及疾病过程，凸显了建立可靠miRNA转录本检测方法的重要性。本文详细描述了一种基于地高辛标记（DIG）的锁核酸（LNA）探针检测miRNA的方法，并结合小鼠心脏组织切片的蛋白免疫染色技术。首先，我们进行了 原位 利用探针通过杂交技术鉴定对照组和心肌肥厚小鼠心脏切片中miRNA-182的表达。随后，我们在相同切片上对心肌肌钙蛋白T（cTnT）蛋白进行免疫荧光染色，以实现miRNA-182与心肌细胞的共定位。通过本方案，我们可采用基于碱性磷酸酶的比色法检测miRNA-182，同时通过荧光染色检测cTnT。该方案可用于利用地高辛标记的锁核酸（LNA）探针，在小鼠心脏组织切片中检测任意目标miRNA的表达，以及相关蛋白的表达情况。

引言

micro-RNAs（miRNAs）是一类短链（18–25个核苷酸）、单链、非编码RNA，可通过抑制信使RNA（mRNA）的翻译和/或促进mRNA降解，在转录后水平负向调控基因表达1。miRNAs由编码或非编码基因的内含子或外显子转录而来，在细胞核内被DROSHA切割生成前体miRNAs（pre-miRNAs），后者为长约70个核苷酸的茎环结构2。pre-miRNAs经输出至细胞质后，由DICER进一步加工为成熟miRNAs，长度为18–25个核苷酸3,4。随后，RNA诱导的沉默复合体（RISC）将这些miRNAs以单链RNA形式整合，使其能够结合靶mRNA的3'非翻译区（3'-UTR），从而抑制其表达3,5。

在过去的三十年中，自首次被发现以来，miRNA 已逐渐成为调控基因表达的主导分子 基因表达的调控因子，其自身的表达水平受到严格调控6. 已有研究描述了miRNA在器官发育中的作用7,8,9,10,11,12，稳态的维持13,14，以及包含神经学的疾病背景15,16,17,18,19心血管20，自身免疫性疾病21,22，癌症23,24以及其他人员25。随着人们对miRNA表达模式相关性认识的不断加深，对miRNA转录本可靠检测方法的需求日益凸显。这些方法包括实时PCR、微阵列、Northern印迹杂交， 原位 杂交等方法，这些方法在灵敏度、特异性和定量能力上存在差异，主要原因是miRNA转录本由短且高度同源的序列组成6.

我们最近报道了miRNA-182在心肌肥厚发展中的重要作用26，心肌肥厚是一种心脏在血流动力学负荷增加时发生的结构适应性改变27,28。心肌肥厚的特征是心肌质量增加，若伴随不良适应性重构29，则会增加心力衰竭的风险，而心力衰竭占所有心血管疾病相关死亡的8.5%30。

在此，我们描述了将以下内容结合的实验方案 原位 使用地高辛标记（DIG）的锁核酸（LNA）探针进行杂交，并结合免疫染色，以在小鼠心脏肥厚模型的心脏组织切片上同时检测miRNA和蛋白质分子。

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方案

本研究中的小鼠心脏组织样本的获取符合相关法律法规和机构指南，并经耶鲁大学机构动物护理和使用委员会批准。

1. 溶液配制

  1. 准备无RNase的ddH₂O2O，通过处理5 L的ddH₂O2用 5 mL 0.1% 焦碳酸二乙酯（DEPC）在室温（RT）下处理过夜（O/N）。经高压灭菌（121 °C）以灭活 DEPC。使用经 DEPC 处理的 ddH₂O2用于后续溶液的制备，具体如下所述。
    警告：DEPC 是已知致癌物，仅可在通风橱中操作。
  2. 通过将 5 片 PBS 片剂溶解于 1 L DEPC 处理的 ddH₂O 中，制备 1× 磷酸盐缓冲盐水（PBS）溶液。2O. 高压灭菌（121 °C）。
  3. 通过将1 mL非离子型去污剂加入1 L 1× PBS中，配制0.1%非离子型去污剂/PBS（PBST）。
  4. 配制90%、70%、50%和30%的乙醇溶液，使用DEPC处理的ddH₂O2O.
  5. 配制 10 mg/mL 蛋白酶 K（ProK）储存液：将蛋白酶 K 溶于经 DEPC 处理的 ddH₂O 中2O. 分装并保存于 -20 °C。通过将 100 μL ProK 储存液加入 50 mL 经 DEPC 处理的 ddH₂O 中，配制 20 μg/mL 的 ProK 工作液。2O. 使用前新鲜配制。
  6. 将2 g多聚甲醛（PFA）加入50 mL 1×PBS中，配制成4% PFA溶液。65 °C加热并间歇振荡至完全溶解。分装后于-20 °C保存。
    注意：PFA 是一种已知致癌物，仅可在通风橱中操作。
  7. 将 87.8 g NaCl 加入 500 mL ddH₂O 中，配制 3 M NaCl 溶液2O. 高压灭菌（121 °C）。
  8. 配制 1 M MgCl₂ 溶液2 通过将20.3 g加入100 mL ddH₂O中制备溶液2O. 高压灭菌（121 °C）。
  9. 将121.1 g Tris溶解于800 mL去离子水中，配制1 M Tris pH 8.02O. 加入几滴 1 N HCl 将 pH 调至 8.0，定容至 1 L 后高压灭菌（121 °C）。通过将 2.5 mL 1 M Tris pH 8.0 加入 47.5 mL ddH₂O 中，配制 50 mM Tris pH 8.0 的工作液。2O.
  10. 将 60.6 g Tris 溶解于 400 mL 去离子水中，配制 1 M Tris pH 9.52O. 加入几滴 1 N HCl 将 pH 调至 9.5，加水定容至 500 mL，随后进行高压灭菌（121 °C）。
  11. 将1.6 mL 1-甲基咪唑用DEPC处理的去离子水定容至130 mL，配制0.13 M、pH 8.0的1-甲基咪唑溶液2O. 加入约 450 µL 12 N HCl 将 pH 调至 8.0。加入 16 mL 3 M NaCl，并加水定容至 160 mL。使用前新鲜配制。
    注意：1-甲基咪唑对黏膜、眼睛和皮肤有害，仅可在通风橱中操作。
  12. 将176 µL的N-(3-二甲基氨基丙基)-N′-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）溶于10 mL的0.13 M 1-甲基咪唑溶液中，配制成0.16 M EDC溶液。用约100 µL的12 N HCl将pH调节至8.0。现用现配。
    警告：EDC 对黏膜、眼睛和皮肤有害，仅可在通风橱中操作。
  13. 制备1% H2O2 通过将1.5 mL的30% H2O2 在50 mL的1×PBS中配制，使用前新鲜配制。
  14. 通过将175.3 g NaCl和88.2 g柠檬酸钠（Na3C6H5O7) 加入 800 mL ddH₂O 中2O. 加入几滴 1 N HCl 将 pH 调至 7.0，定容至 1 L，高压灭菌（121 °C）。
    1. 通过将20 mL的20x SSC pH 7.0用180 mL的ddH₂O稀释，配制2x SSC pH 7.0工作液2O.
    2. 通过将 2.5 mL 的 20x SSC pH 7.0 用 47.5 mL 的 ddH₂O 稀释，配制 1x SSC pH 7.0 的工作液2O.
    3. 将5 mL的2x SSC pH 7.0用45 mL的ddH₂O稀释，配制0.2x SSC pH 7.0的工作液2O.
  15. 通过将0.5 mL的2x microRNA ISH缓冲液与0.5 mL的DEPC处理过的ddH₂O混合，配制1x杂交溶液2O. 使用前新鲜配制。
  16. 通过将250 mg左旋咪唑加入5 mL去离子水中，配制200 mM的左旋咪唑储存液。2O. 分装后于 -20 °C 保存。
  17. 为第5步制备封闭液（10% 羊血清/1% BSA/0.2 mM Levamisole）：将1 mL 羊血清加入9 mL PBST中稀释，再加入0.1 g BSA。使用前添加10 μL Levamisole。现配现用。
  18. 在9 mL PBST中加入1 mL山羊血清和0.1 g BSA，配制步骤6所需的封闭液（10%山羊血清/1% BSA）。4 °C保存，一周内使用。
  19. 通过将 3.3 mL 的 3 M NaCl 和 5 mL 的 1 M MgCl₂ 稀释来配制预染溶液2，81.5 mL 去离子水中加入 10 mL 1 M Tris（pH 9.5）、100 µL Tween-20 和 100 µL 左旋咪唑2O. 使用前新鲜配制。
  20. 使用硝基蓝四唑（nitroblue tetrazolium, NBT）/5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸（5-bromo-4-chloro-3-indoly phosphate, BCIP）片剂，按照生产商说明书配制20 mL碱性磷酸酶（Alkaline Phosphatase, AP）底物溶液。加入20 μL左旋咪唑（Levamisole）。现用现配，并避光保存。
  21. 通过将 4 g Tris、4.4 g NaCl 和 375 mg KCl 加入 500 mL ddH₂O 中，配制 KTBT 溶液2O. 高压灭菌（121 °C）。
  22. 可选：将50 μL DAPI储备液（1 mg/mL）加入50 mL 1×PBS中，稀释制成DAPI工作液（1 μg/mL）。
    注意：诸如 3 M NaCl、1 M MgCl 的标准溶液2，1 M Tris-HCl，无核酸酶的ddH₂O2O、1× PBS 和 20× SSC 也可直接购买。本方案中使用了 50 mL 玻璃 Coplin 染色缸或 20 mL 聚丙烯切片邮寄瓶。

2. 组织制备

注意：此处使用的小鼠心脏切片由耶鲁病理学组织服务部门制备，组织来源于甲醛固定/石蜡包埋样本，切片厚度为 5 μm，并置于带电荷的载玻片上。

  1. 组织复水。
    1. 将切片置于杂交炉中，在 60 °C 下加热 10 分钟，直至石蜡明显熔化。
    2. 将切片放入盛有 50 mL 商品化透明剂（见材料表）的玻璃染色缸中，每次 10 分钟，重复两次。
    3. 将切片放入盛有 50 mL 100% 乙醇的玻璃染色缸中，每次 2 分钟，重复两次；随后依次放入 90% 乙醇中 2 分钟、70% 乙醇中 2 分钟（重复两次）、50% 乙醇中 2 分钟以及 30% 乙醇中 2 分钟。
    4. 将切片放入盛有 50 mL 经 DEPC 处理的双蒸水（ddH2O）的玻璃染色缸中，孵育 5 分钟。
    5. 将切片放入盛有 50 mL 1× PBS 的玻璃染色缸中，孵育 5 分钟，室温下重复两次。
  2. 组织去蛋白处理。
    1. 将切片放入盛有 50 mL 浓度为 20 μg/mL 的蛋白酶 K 工作液的玻璃染色缸中，在杂交炉中 37 °C 孵育 15 分钟。
      注意：消化不足可能导致信号弱或无信号，而过度消化则可能导致组织降解和背景染色。此步骤可能需要优化（蛋白酶 K 浓度 1–20 μg/mL，孵育时间 5–20 分钟，室温至 37 °C）。
    2. 将切片放入盛有 50 mL 1× PBS 的玻璃染色缸中，室温下孵育 5 分钟，重复两次。
  3. 组织固定。
    1. 使用疏水笔在每张切片的组织周围画出防水圈。
    2. 在每张切片上加入 500 µL 4% 多聚甲醛（PFA）溶液，水平放置切片，在室温下孵育 10 分钟。
    3. 将切片放入盛有 50 mL 1× PBS 的玻璃染色缸中，室温下孵育 5 分钟，重复两次。
    4. 将切片放入盛有 50 mL 0.13 M 1-甲基咪唑的玻璃染色缸中，室温下孵育 10 分钟，重复两次。
    5. 在每张切片上加入 500 µL 0.16 M EDC 溶液，置于湿盒中，室温下水平孵育 1 小时。
    6. 将切片放入盛有 50 mL 50 mM Tris（pH 8.0）的玻璃染色缸中，室温下冲洗。
    7. 将切片放入盛有 50 mL 1× PBS 的玻璃染色缸中，室温下冲洗，重复两次。
      注意：PFA 和 EDC 固定步骤对于 miRNA 的交联均属必需，不可省略。31
  4. 内源性过氧化物酶封闭。
    1. 将切片放入盛有 50 mL 1% H2O2 的玻璃染色缸中，室温下孵育 30 分钟。
    2. 将切片放入盛有 50 mL 1× PBS 的玻璃染色缸中，室温下冲洗，重复两次。

3. 杂交

  1. 在杂交炉中将杂交液（每张切片500 µL）预热至50 °C，直至达到目标温度（10–15分钟）。
  2. 在杂交盒底部放置两片滤纸或擦镜纸，并用50%甲酰胺/1x SSC溶液浸湿。
    注意：甲酰胺对黏膜、眼睛和皮肤有害，仅可在通风橱中操作。
  3. 在每张切片表面加入200 µL杂交液，于50 °C湿润环境中水平孵育1–3小时。
  4. 在1.5 mL离心管中，将0.5 µL探针储备液（25 µM）与250 µL杂交液混合，配制探针工作液（终浓度为50 nM）。
    注意：不同miRNA的表达水平存在差异，因此该步骤可能需要优化探针浓度（1–50 nM），以避免无信号或背景过高。
  5. 在每张切片表面加入250 µL探针工作液，并覆盖无RNase的盖玻片，避免产生气泡。
  6. 用封口膜小心密封杂交盒，于50 °C过夜孵育。
    注意：杂交温度应设置为各探针RNA熔解温度（Tm）约低30 °C的条件，可能需要进行优化。此处针对miRNA-182采用50 °C作为杂交/洗涤温度，使用其他探针时应相应调整。

4. 严谨性洗涤

  1. 在杂交炉中将 200 mL 的 2x SSC 预热至 50 °C，直至达到目标温度（20–40 分钟）。
  2. 将载玻片放入含有 50 mL 50 °C 2x SSC 的玻璃染色缸中，洗涤 5 分钟，或直至盖玻片松动。
  3. 将载玻片放入含有 50 mL 室温 2x SSC 的玻璃染色缸中，每次洗涤 5 分钟，重复两次。
  4. 将载玻片放入含有 50 mL 室温 0.2x SSC 的玻璃染色缸中，洗涤 5 分钟。
  5. 将载玻片放入含有 50 mL 室温 PBST 的玻璃染色缸中，洗涤 5 分钟。
  6. 将载玻片放入含有 50 mL 室温 1x PBS 的玻璃染色缸中，洗涤 5 分钟。
    注意：由于 RNA-RNA 杂交体已视为稳定，不再需要使用 RNase-free 条件。

5. DIG 抗体检测

  1. 如有必要，使用疏水笔在每张载玻片的组织周围重新绘制防水圈。
  2. 向每张载玻片的整个长度上加入 500 µL 封闭液。将载玻片水平放置于湿盒中，室温孵育 30 分钟。
  3. 在 1.5 mL 离心管中，将 0.5 μL DIG 抗体加入 500 µL 封闭液中，配制 DIG 抗体溶液（1:1,000）。
    注意：此步骤可能需要优化（1:500–1:2,000）。
  4. 向每张载玻片的整个长度上加入 500 µL DIG 抗体溶液。将载玻片水平放置于湿盒中，室温孵育 1 小时。
  5. 将载玻片置于盛有 50 mL PBST 的玻璃染色缸中，室温洗涤 5 分钟，重复三次。
  6. 将载玻片置于盛有 50 mL 预染液的玻璃染色缸中，室温洗涤 5 分钟，重复两次。
  7. 将载玻片置于含有 20 mL AP 底物溶液的聚丙烯载玻片邮寄盒中，37 °C 孵育 6–24 小时，避光。
    注意：应每隔 2 小时检查一次显色情况。此步骤可能需要优化。
  8. 将载玻片置于盛有 50 mL KTBT 溶液的玻璃染色缸中，室温洗涤 5 分钟，重复两次。
  9. 将载玻片置于盛有 50 mL 1x PBS 的玻璃染色缸中，室温洗涤 5 分钟。

6. cTnT 抗体检测

  1. 如有必要，使用疏水笔在每张载玻片的组织周围重新绘制防水圈。
  2. 向每张载玻片的整个长度上加入 500 µL 封闭液。将载玻片水平置于湿盒中，室温孵育 1 小时。
  3. 在 1.5 mL 离心管中，将 2 μL cTnT 抗体加入 200 μL 封闭液中，配制 cTnT 抗体溶液（1:100）。
  4. 向每张载玻片的整个长度上加入 200 µL cTnT 抗体溶液。将载玻片水平置于湿盒中，4 °C 过夜孵育。
  5. 在室温下，将载玻片放入盛有 50 mL 1x PBS 的玻璃染色缸中洗涤 5 分钟，重复三次。
  6. 在 1.5 mL 离心管中，将 0.5 μL anti-rabbit-568 抗体加入 250 μL 封闭液中，配制 anti-rabbit-568 抗体溶液（1:500）。
  7. 向每张载玻片的整个长度上加入 250 µL anti-rabbit-568 抗体溶液。将载玻片水平置于湿盒中，室温孵育 1 小时。
  8. 在室温下，将载玻片放入盛有 50 mL 1x PBS 的玻璃染色缸中洗涤 5 分钟，重复三次。
  9. 可选：向每张载玻片的整个长度上加入 250 µL DAPI 工作液，避光、室温水平孵育 1 分钟。
  10. 在室温下，将载玻片放入盛有 50 mL 1x PBS 的玻璃染色缸中洗涤 5 分钟，重复两次。

7. 封片与成像

  1. 用 2–3 滴封片剂和一张玻璃盖玻片封片。将载玻片置于 4 °C 避光环境中，平放过夜干燥。
  2. 进行落射荧光显微镜或共聚焦显微镜观察。

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结果

miRNA 原位 使用随机序列miRNA和U6-snRNA分别作为阴性与阳性对照，在小鼠心脏切片上优化了杂交条件。阳性染色呈蓝色，阴性结果则表现为无显色反应。图1A-1B）。通过对照组和PlGF过表达小鼠心脏切片评估心肌细胞特异性miRNA-182的表达。在αMHC启动子驱动下携带PlGF转基因的小鼠，在转基因激活后6周内因血管生成增加而出现继发性心肌肥厚。26我们进行了 原位 杂交结果显示，与对照组相比，PlGF 小鼠心脏中 miRNA-182 的表达升高（图2A-2H），由蓝色染色指示。为了确定表达miRNA-182的细胞类型，我们随后对相同切片进行cTnT免疫染色。结果显示，在对照组和PlGF小鼠心脏切片中，miRNA-182均与cTnT阳性心肌细胞以及DAPI染色的细胞核共定位。

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讨论

miRNA转录本的检测可通过多种技术实现，这些技术在灵敏度、特异性和定量能力方面各不相同。本文中，我们展示miRNA的耦合检测方法 原位 与免疫染色相结合的杂交方法，并描述一种可在同一心脏切片上同时检测miRNA与蛋白质分子表达水平的实验方案。我们首先展示如何进行 原位 在石蜡包埋的心脏切片上进行地高辛标记的锁核酸miRNA探针杂交。接着，我们描述如何在同一组织切片上进行cTnT的免疫染色。最后，我们展示如何将获得的显色图像与荧光图像进行合并。本方案已针对经福尔马林固定（4 °C，过夜）及石蜡包埋的小鼠心脏组织，使用地高辛标记的锁核酸miRNA探针和cTnT抗体进行了优化。对于不同类型的组织、探针或抗体，可能需要进一步优化，具体如下所述。

在进行探针杂交前的所有步骤中，应严格实施无RNase污染的条件，因为RNase污染会严重损害实验结果。所有溶液均应使用经DEPC处理的ddH2O配制，所有考林瓶（Coplin jars）均需用RNase去污染溶液处理。此外，在使用不同DIG标记的LNA miRNA探针时，还应考虑以下因素：...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

我们感谢 Athanasios Papangelis 对本文手稿提出的宝贵意见。FM 由生物技术和生物科学研究中心（BBSRC；BB/M009424/1）资助。IP 由美国心脏协会科学家发展基金（17SDG33060002）资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
焦碳酸二乙酯Sigma AldrichD5758DEPC
磷酸盐缓冲液Sigma AldrichP4417PBS
吐温-20American BioanalyticalAB02038非离子型表面活性剂
HistoclearNational DiagnosticsHS-200
蛋白酶K，重组，PCR级Sigma Aldrich3115879001ProK
多聚甲醛Sigma AldrichP6148PFA
氯化钠ThermoFisherS271NaCl
六水合氯化镁ThermoFisherM33MgCl2
TrisSigma AldrichT6066
盐酸溶液，1 NThermoFisherSA48HCl
盐酸溶液，12 NThermoFisherS25358HCl
1-甲基咪唑Sigma Aldrich336092
N-(3-二甲基氨基丙基)-N′-乙基碳二亚胺盐酸盐Sigma Aldrich39391EDC
过氧化氢溶液 H2O2Sigma Aldrich216763H2O2
二水合柠檬酸三钠Sigma AldrichS1804柠檬酸钠
miRCURY LNA miRNA ISH Buffer Set (FFPE)Qiagen339450乱序miRNA/U6 snRNA
miRCURY LNA mmu-miR-182 检测探针QIagenYD006157015'-DIG 和 3'-DIG 标记
盐酸左旋咪唑Sigma Aldrich31742
牛血清白蛋白Sigma AldrichA9647BSA
NBT/BCIP 片剂Sigma Aldrich11697471001NBT-BCIP
氯化钾ThermoFisherP217KCl
DAPI 溶液 (1mg/ml)ThermoFisher62248DAPI
玻璃盖玻片ThermoFisher12-545E玻璃盖玻片
塑料盖玻片Grace Bio-LabsHS40 22mmX40mmX0.25mm无RNA酶塑料盖玻片
抗地高辛-碱性磷酸酶，Fab片段Sigma Aldrich11093274910DIG 抗体
疏水屏障笔Vector LaboratoriesH-4000记号笔
抗心肌肌钙蛋白T抗体Abcamab92546cTnT 抗体
山羊抗兔IgG (H+L) 交叉吸附二抗，Alexa Fluor 568ThermoFisherA-11011抗兔-568 抗体
Dako 荧光封片剂DAKOS3023封片剂
绵羊血清Sigma AldrichS3772
山羊血清Sigma AldrichG9023
去离子甲酰胺American BioanalyticalAB00600
杂交炉ThermoFisherUVP HB-1000 Hybridizer

参考文献

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利用小鼠心脏切片进行组织特异性miRNA表达谱分析 原位 杂交
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