利用小鼠心脏切片进行组织特异性miRNA表达谱分析 原位 杂交

摘要

micro-RNAs（miRNAs）是一类短小且高度同源的RNA序列，可作为信使RNA（mRNAs）的转录后调控因子。目前的miRNA检测方法在灵敏度和特异性方面存在差异。本文描述了一种结合了 原位 小鼠心脏组织切片中miRNA与蛋白质分子的杂交及免疫染色共检测

摘要

micro-RNAs（miRNAs）是单链RNA转录本，可结合信使RNA（mRNAs）并抑制其翻译或促进其降解。迄今为止，miRNAs已被证实参与大量生物学及疾病过程，凸显了建立可靠miRNA转录本检测方法的重要性。本文详细描述了一种基于地高辛标记（DIG）的锁核酸（LNA）探针检测miRNA的方法，并结合小鼠心脏组织切片的蛋白免疫染色技术。首先，我们进行了 原位 利用探针通过杂交技术鉴定对照组和心肌肥厚小鼠心脏切片中miRNA-182的表达。随后，我们在相同切片上对心肌肌钙蛋白T（cTnT）蛋白进行免疫荧光染色，以实现miRNA-182与心肌细胞的共定位。通过本方案，我们可采用基于碱性磷酸酶的比色法检测miRNA-182，同时通过荧光染色检测cTnT。该方案可用于利用地高辛标记的锁核酸（LNA）探针，在小鼠心脏组织切片中检测任意目标miRNA的表达，以及相关蛋白的表达情况。

引言

micro-RNAs（miRNAs）是一类短链（18–25个核苷酸）、单链、非编码RNA，可通过抑制信使RNA（mRNA）的翻译和/或促进mRNA降解，在转录后水平负向调控基因表达¹。miRNAs由编码或非编码基因的内含子或外显子转录而来，在细胞核内被DROSHA切割生成前体miRNAs（pre-miRNAs），后者为长约70个核苷酸的茎环结构²。pre-miRNAs经输出至细胞质后，由DICER进一步加工为成熟miRNAs，长度为18–25个核苷酸^3,4。随后，RNA诱导的沉默复合体（RISC）将这些miRNAs以单链RNA形式整合，使其能够结合靶mRNA的3'非翻译区（3'-UTR），从而抑制其表达^3,5。

在过去的三十年中，自首次被发现以来，miRNA 已逐渐成为调控基因表达的主导分子 基因表达的调控因子，其自身的表达水平受到严格调控⁶. 已有研究描述了miRNA在器官发育中的作用^7,

方案

本研究中的小鼠心脏组织样本的获取符合相关法律法规和机构指南，并经耶鲁大学机构动物护理和使用委员会批准。

1. 溶液配制

1. 准备无RNase的ddH₂O₂O，通过处理5 L的ddH₂O₂用 5 mL 0.1% 焦碳酸二乙酯（DEPC）在室温（RT）下处理过夜（O/N）。经高压灭菌（121 °C）以灭活 DEPC。使用经 DEPC 处理的 ddH₂O₂用于后续溶液的制备，具体如下所述。
   警告：DEPC 是已知致癌物，仅可在通风橱中操作。
2. 通过将 5 片 PBS 片剂溶解于 1 L DEPC 处理的 ddH₂O 中，制备 1× 磷酸盐缓冲盐水（PBS）溶液。₂O. 高压灭菌（121 °C）。
3. 通过将1 mL非离子型去污剂加入1 L 1× PBS中，配制0.1%非离子型去污剂/PBS（PBST）。
4. 配制90%、70%、50%和30%的乙醇溶液，使用DEPC处理的ddH₂O₂O.
5. 配制 10 mg/mL 蛋白酶 K（ProK）储存液：将蛋白酶 K 溶于经 DEPC 处理的 ddH₂O 中₂O. 分装并保存于 -20 °C。通过将 100 μL ProK 储存液加入 50 mL 经 DEPC 处理的 ddH₂O 中，配制 20 μg/mL 的 ....

结果

miRNA 原位 使用随机序列miRNA和U6-snRNA分别作为阴性与阳性对照，在小鼠心脏切片上优化了杂交条件。阳性染色呈蓝色，阴性结果则表现为无显色反应。图1A-1B）。通过对照组和PlGF过表达小鼠心脏切片评估心肌细胞特异性miRNA-182的表达。在αMHC启动子驱动下携带PlGF转基因的小鼠，在转基因激活后6周内因血管生成增加而出现继发性心肌肥厚。²⁶我们进行了 原位 杂交结果显示，与对照组相比，PlGF 小鼠心脏中 miRNA-182 的表达升高（图2A-2H），由蓝色染色指示。为了确定表达miRNA-182的细胞类型，我们随后对相同切片进行cTnT免疫染色。结果显示，在对照组和PlGF小鼠心脏切片中，miRNA-182均与cTnT阳性心肌细胞以及DAPI染色的细胞核共定位。

讨论

miRNA转录本的检测可通过多种技术实现，这些技术在灵敏度、特异性和定量能力方面各不相同。本文中，我们展示miRNA的耦合检测方法 原位 与免疫染色相结合的杂交方法，并描述一种可在同一心脏切片上同时检测miRNA与蛋白质分子表达水平的实验方案。我们首先展示如何进行 原位 在石蜡包埋的心脏切片上进行地高辛标记的锁核酸miRNA探针杂交。接着，我们描述如何在同一组织切片上进行cTnT的免疫染色。最后，我们展示如何将获得的显色图像与荧光图像进行合并。本方案已针对经福尔马林固定（4 °C，过夜）及石蜡包埋的小鼠心脏组织，使用地高辛标记的锁核酸miRNA探针和cTnT抗体进行了优化。对于不同类型的组织、探针或抗体，可能需要进一步优化，具体如下所述。

在进行探针杂交前的所有步骤中，应严格实施无RNase污染的条件，因为RNase污染会严重损害实验结果。所有溶液均应使用经DEPC处理的ddH₂O配制，所有考林瓶（Coplin jars）均需用RNase去污染溶液处理。此外，在使用不同DIG标记的LNA miRNA探针时，还应考虑以下因素：.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
焦碳酸二乙酯	Sigma Aldrich	D5758	DEPC
磷酸盐缓冲液	Sigma Aldrich	P4417	PBS
吐温-20	American Bioanalytical	AB02038	非离子型表面活性剂
Histoclear	National Diagnostics	HS-200
蛋白酶K，重组，PCR级	Sigma Aldrich	3115879001	ProK
多聚甲醛	Sigma Aldrich	P6148	PFA
氯化钠	ThermoFisher	S271	NaCl
六水合氯化镁	ThermoFisher	M33	MgCl2
Tris	Sigma Aldrich	T6066
盐酸溶液，1 N	ThermoFisher	SA48	HCl
盐酸溶液，12 N	ThermoFisher	S25358	HCl
1-甲基咪唑	Sigma Aldrich	336092
N-(3-二甲基氨基丙基)-N′-乙基碳二亚胺盐酸盐	Sigma Aldrich	39391	EDC
过氧化氢溶液 H2O2	Sigma Aldrich	216763	H2O2
二水合柠檬酸三钠	Sigma Aldrich	S1804	柠檬酸钠
miRCURY LNA miRNA ISH Buffer Set (FFPE)	Qiagen	339450	乱序miRNA/U6 snRNA
miRCURY LNA mmu-miR-182 检测探针	QIagen	YD00615701	5'-DIG 和 3'-DIG 标记
盐酸左旋咪唑	Sigma Aldrich	31742
牛血清白蛋白	Sigma Aldrich	A9647	BSA
NBT/BCIP 片剂	Sigma Aldrich	11697471001	NBT-BCIP
氯化钾	ThermoFisher	P217	KCl
DAPI 溶液 (1mg/ml)	ThermoFisher	62248	DAPI
玻璃盖玻片	ThermoFisher	12-545E	玻璃盖玻片
塑料盖玻片	Grace Bio-Labs	HS40 22mmX40mmX0.25mm	无RNA酶塑料盖玻片
抗地高辛-碱性磷酸酶，Fab片段	Sigma Aldrich	11093274910	DIG 抗体
疏水屏障笔	Vector Laboratories	H-4000	记号笔
抗心肌肌钙蛋白T抗体	Abcam	ab92546	cTnT 抗体
山羊抗兔IgG (H+L) 交叉吸附二抗，Alexa Fluor 568	ThermoFisher	A-11011	抗兔-568 抗体
Dako 荧光封片剂	DAKO	S3023	封片剂
绵羊血清	Sigma Aldrich	S3772
山羊血清	Sigma Aldrich	G9023
去离子甲酰胺	American Bioanalytical	AB00600
杂交炉	ThermoFisher	UVP HB-1000 Hybridizer