原位杂交法在小鼠心脏切片组织特异 miRNA 表达谱分析中的应用

摘要

微 rna (miRNAs) 是短而高度同源的 RNA 序列, 充当信使 rna (基因) 的转录后调节剂。目前 miRNA 检测方法的灵敏度和特异性各不相同。我们描述了一个协议, 结合原位杂交和染色的同时检测 miRNA 和蛋白质分子在小鼠心脏组织切片。

摘要

微 rna (miRNAs) 是单链 RNA 转录, 绑定到信使 rna (基因) 和抑制他们的翻译或促进其退化。到目前为止, miRNAs 已牵连到大量的生物和疾病进程, 这标志着需要可靠的检测方法的 miRNA 记录。在这里, 我们描述了一个详细的协议, 辛标记 (挖掘) 锁定核酸 (低噪声放大) 探针为基础的 miRNA 检测, 结合蛋白染色的小鼠心脏切片。首先, 采用原位杂交技术, 利用探针对控制和心肌肥厚小鼠心脏切片中的 miRNA-182 表达进行鉴别。接下来, 我们进行了染色肌钙蛋白 T (cTnT) 蛋白, 在相同的部分, 共同本地化 miRNA-182 与心肌细胞。使用该协议, 我们能够检测 miRNA-182 通过碱性磷酸酶为基础的比色法, 并通过荧光染色 cTnT。该协议可用于检测任何 miRNA 的表达, 通过挖掘标记的低噪声放大探针和相关蛋白表达的小鼠心脏组织切片。

引言

微 rna (miRNAs) 是短的 (18–25核苷酸), 单链, 非编码 rna, 在转录后水平的基因表达负调节作用, 抑制信使 RNA (mRNA) 翻译和/或促进 mRNA 退化¹. miRNAs 是从编码或非编码基因的内含子或外显子中转录出来的, 并在细胞核中被 DROSHA、前体 miRNAs (前 miRNAs), 后者为70核苷酸²的短茎环结构。在细胞质出口之后, DICER 将 miRNAs 进一步加工成成熟的 miRNAs, 跨度18–25核苷酸^3,4。随后, RNA 诱导的沉默复合体 (RISC) 将这些 miRNAs 作为单链 rna, 允许它们绑定到其目标基因的 3 ' 未翻译区 (3 '-UTR), 以抑制其表达式^3,5.

在过去的三年里, 自从他们第一次被发现以来, miRNAs 已经出现, 掌握基因表达的调控者, 他们自己的表达水平被严密控制⁶。miRNAs 的角色已经在器官发育^{7、8、9、10、11、12}、维持稳态^13、14, 以及包括神经^{15、16、17、18、19}、心血管²⁰、自身免疫状况21的疾病情境 ^,22, 癌症^23,24, 其他²⁵。对 miRNA 表达模式相关性的越来越多的认识, 提出了 miRNA 转录的可靠检测方法的必要性。这些方法包括实时 PCR、微阵列、北印迹、原位杂交等, 它们在灵敏度、特异性和定量能力上各不相同, 主要是由于 miRNA 记录由短而高度同源序列⁶。

我们最近报告了 miRNA-182 在心肌肥厚²⁶的发展中的重要作用, 这一状况描述了心脏的结构适应反应了高血流动力学要求^27,28。心脏肥大的特点是心肌质量的增加, 如果与不良重塑²⁹, 可能导致心力衰竭的风险增加, 一个条件占8.5% 的所有死亡归因于心血管疾病³⁰。

在这里, 我们描述了我们的协议, 结合原位杂交与辛标记 (挖掘) 锁定核酸 (低噪声放大) 探针和染色同时检测 miRNA 和蛋白质分子在小鼠心脏组织切片, 在我们的心肌肥厚模型。

方案

本研究的小鼠心脏组织样本是按照相关法律和机构指南获得的, 并经耶鲁大学机构动物护理和使用委员会批准。

1. 解决方案准备

1. RNase 免费 ddH₂o, 用5毫升 0.1% diethylpyrocarbonate (DEPC) 在室温下 (RT) 处理5升的 ddH₂o。高压釜 (121 °c) 停用 DEPC。使用 DEPC 处理的 ddH₂O 进行下游溶液的制备, 如下所示。
   注意: DEPC 是已知的致癌物质, 只有油烟机中的手柄。
2. ddH₂o 型高压釜 (121 摄氏度) 溶出 5 PBS 片, 制备1x 磷酸缓冲盐水 (pbs) 溶液, DEPC 1 升。
3. 0.1% 非离子洗涤剂/PBS (PBST) 稀释1毫升的非离子洗涤剂每1升 1x PBS。
4. 在 DEPC 处理的 ddH₂O 上制备90%、70%、50% 和30% 乙醇。
5. 准备一个10毫克/毫升的蛋白酶 K (普罗克) 溶液在 DEPC 处理 ddH₂o 整除和存储在-20 摄氏度。在50毫升的 DEPC 处理的 ddH₂o 普罗克溶液中稀释 100 ul 的普罗克, 制备20微克/毫升工作溶液。
6. 在50毫升的 1x PBS 中加入2克的粉煤灰, 制备4% 多聚甲醛 (粉煤灰)。热在65°c 与偶尔晃动, 直到溶化。整除和存储在-20 摄氏度。
   注意: 粉煤灰是已知的致癌物质, 只有在油烟机中处理。
7. 在3米氯化钠溶液中加入87.8 克至500毫升的 ddH₂o-蒸压釜 (121 °c)。
8. 1米氯化镁₂溶液添加20.3 克到100毫升的 ddH₂o 蒸压釜 (121 °c)。
9. 1米三 pH 8.0 通过溶解121.1 克在800毫升 ddH₂o 调整 ph 值为8.0 以几滴 1 N HCl, 带来容量到 1 L 和高压釜 (121 °c)。在8.0 毫升的 ddH_47.5O 中稀释2.5 毫升1米三 ph 2, 准备一个 50 mM 8.0 的工作溶液。
10. 1米三 pH 9.5 通过溶解60.6 克在400毫升 ddH₂o 调整 ph 值为9.5 与几滴 1 N HCl, 带来容量到500毫升和高压釜 (121 °c)。
11. 0.13 米 1-甲基咪唑 pH 8.0 通过稀释1.6 毫升 1-甲基咪唑到130毫升 DEPC 处理 ddH₂o 调整 pH 值为 8.0, 约450µL 12 N HCl. 加入16毫升的3米氯化钠, 并使体积达到160毫升。使用前要新鲜。
    注意: 1-甲基咪唑是有害的黏膜, 眼睛和皮肤, 只处理在油烟机。
12. 制备0.16 米 n-(3-Dimethylaminopropyl)-N′ ethylcarbodiimide 盐酸盐 (edc) 稀释176µL 的 EDC 到10毫升0.13 米 1-甲基咪唑。将 pH 值调整为 8.0, 约为100µL 12 N HCl. 使用前要新鲜。
    注意: 对粘膜、眼睛和皮肤有害, 只有在油烟机中处理。
13. 在30% 毫升 1x PBS 中稀释1.5 毫升 2 h 2 o₅₀ , 准备1% 小时₂O₂ 。使用前要新鲜。
14. 通过溶解175.3 克氯化钠和88.2 克柠檬酸钠 (Na₃C₆H 5 O₇) 在800毫升的 ddH₂mL 中制备 20x SSC ph 值 7.0. 用几滴 7.0 N HCl 将 ph 值调整为 1, 把体积带到1升和高压釜 (121 °c)。
    1. 通过稀释20毫升 20x ssc ph 值 7.0, 在180毫升的 ddH₂O, 准备一个 2x ssc ph 值为7.0 的工作溶液。
    2. 通过稀释2.5 毫升 20x ssc ph 值 7.0, 在47.5 毫升的 ddH₂O, 准备一个 1x ssc ph 值为7.0 的工作溶液。
    3. 通过稀释5毫升 2x ssc ph 值 7.0, 在45毫升的 ddH₂O, 准备一个 0.2x ssc ph 值为7.0 的工作溶液。
15. 在0.5 毫升的 DEPC ddH₂microRNA 中稀释0.5 毫升2x 的1x 杂交溶液, 在使用前进行新鲜的处理。
16. 通过添加250毫克至5毫升的 ddH₂o 整除, 并在-20 摄氏度处贮存, 准备200毫米的左旋咪唑的库存溶液。
17. 在9毫升 PBST 中稀释1毫升绵羊血清, 并添加0.1 克 BSA, 为步骤 5 (10% 只绵羊 serum/1%bsa/0.2 毫米 Levamisol) 准备阻塞溶液。使用前添加 10 ul 的左旋咪唑。使用前要新鲜。
18. 在9毫升的 PBST 中稀释1毫升山羊血清, 并添加0.1 克 BSA, 为步骤 6 (10% 山羊 serum/1%bsa) 制备阻断溶液。贮存在4摄氏度, 并在一周内使用。
19. prestaining 溶液稀释3.3 毫升3米氯化钠, 5 毫升1米氯化镁₂, 10 毫升1米三 pH 9.5, 100 µL Tween-20, 100 µL 的左旋咪唑在81.5 毫升 ddH₂o 在使用之前做新鲜。
20. 使用硝基四氮唑 (NBT)/5-溴-4-氯-3-indoly 磷酸 (BCIP) 片剂, 根据制造商的指示, 制备20毫升碱性磷酸酶 (AP) 基质溶液。添加20的左旋咪唑 ul。使用前要新鲜, 并且要保护光线。
21. 在500毫升的 ddH₂o 蒸压釜 (121 摄氏度) 中加入4克的三、4.4 克氯化钠和375毫克氯化钾, 制备 KTBT 溶液。
22. 可选: 准备一个 DAPI 工作解决方案 (1 微克/毫升) 稀释 50 ul DAPI 库存溶液 (1 毫克/毫升) 在50毫升 1x PBS。
    注: 标准溶液, 如3米氯化钠, 1 米氯化镁₂, 1 米三盐酸, 无核酸酶 ddH₂O, 1x PBS 和 20x SSC 可以另购。对于该协议, 使用了50毫升玻璃 Coplin 罐子或20毫升聚丙烯滑动邮件罐。

2. 组织准备

注: 这里使用的鼠标心脏部分是由耶鲁病理组织服务, 从福尔马林固定/石蜡嵌入组织, 削减5微米, 并放置在带电的幻灯片。

1. 组织补液。
   1. 将60摄氏度的滑梯加热10分钟, 在杂交烤箱中, 直到石蜡明显融化。
   2. 在玻璃 Coplin 罐中孵化出含有50毫升商业上可用的清洁剂 (见材料表) 10 分钟, 两次的幻灯片。
   3. 将50毫升100% 乙醇的玻璃 Coplin 罐孵化成2分钟, 两次, 后跟90% 乙醇2分钟, 70% 乙醇为2分钟, 两次, 50% 乙醇为2分钟, 30% 乙醇为2分钟。
   4. 在玻璃 Coplin 罐中孵化出含有50毫升 DEPC 的 ddH₂O 5 分钟的玻片。
   5. 在装有50毫升 1x PBS 的玻璃 Coplin 罐子中孵化出5分钟的幻灯片。
2. 组织脱 proteinating。
   1. 在含有50毫升20微克/毫升普罗克工作溶液的玻璃 Coplin 罐子中孵化幻灯片, 在杂交烤箱中, 37 摄氏度为15分钟。
      注意: 消化不足可能导致信号的发育不良或没有, 而过度消化可能导致组织退化和背景染色的发展。此步骤可能需要优化 (1–20微克/毫升普罗克, 5–20最小孵化, RT-37 °c)。
   2. 将50毫升 1x PBS 的玻璃 Coplin 罐中的幻灯片洗净5分钟, RT 两次。
3. 组织固定。
   1. 用疏水笔在每张幻灯片的组织周围画一个防水圈。
   2. 应用500µL 4% 粉煤灰溶液的长度每张幻灯片和孵化幻灯片水平为10分钟, 在 RT。
   3. 将50毫升 1x PBS 的玻璃 Coplin 罐中的幻灯片洗净5分钟, RT 两次。
   4. 将含有50毫升0.13 米 1-甲基咪唑的玻璃 Coplin 罐中的幻灯片洗净, 在 RT 上, 两次进行10分钟。
   5. 对每张幻灯片的长度应用500µL 0.16 米的溶液, 并在室温下以1小时的水平孵化幻灯片, 在一个加湿室中。
   6. 将50毫升50毫米的玻璃 Coplin 罐中的幻灯片冲洗一遍, 在 RT 中含有8.0 的 pH 值。
   7. 将50毫升 1x PBS 的玻璃 Coplin 罐中的幻灯片冲洗一次, 两次。
      注: miRNA 交联需要使用粉煤灰和固定步骤, 不应省略。³¹
4. 内源性过氧化物酶阻滞。
   1. 在50毫升1% 小时₂O₂的玻璃 Coplin 罐子中孵化出一张在 RT 中的30分钟的幻灯片。
   2. 将50毫升 1x PBS 的玻璃 Coplin 罐中的幻灯片冲洗一次, 两次。

3. 杂交

1. 预热杂交溶液 (每张500µL) 在50°c 在杂交烤箱, 直到目标温度, 达到 (10–15分钟)。
2. 将2片过滤器或纸巾放在会议厅底部, 用 50% formamide/1x SSC 润湿纸张, 以制备杂交室。
   注意: 甲酰胺对黏膜、眼睛和皮肤有害, 只在油烟机中处理。
3. 对每张幻灯片的长度应用200µL 杂交溶液。在湿室中, 在50°c 水平上孵化出 1–3 h 的幻灯片。
4. 通过将0.5 µL 探针 (25 µM) 混合在250µL ofhybridization 溶液 (最终浓度 50 nM) 中的1.5 毫升管中, 准备探头溶液。
   注意: 不同的 miRNAs 在不同的层次上表达, 因此对于这个步骤 (1–50 nM), 可能需要对探针浓度进行优化, 以避免信号或高背景的发展。
5. 对每张幻灯片的长度应用250µL 探针解决方案, 并将 RNase 自由盖玻片放在顶部。避免气泡的形成。
6. 小心地封住杂交室与 parafilm 和孵化 O/N 在50摄氏度。
   注: 杂交温度应设置约30摄氏度以下的 RNA 熔化温度 (Tm) 的每个探针。可能需要优化。在这里, 50 °c 用作杂交/洗涤温度为 miRNA-182, 相应地调整为不同的探针。

4. 紧缩清洗

1. Prewarm 200 毫升 2x SSC 在50°c 在杂交烤箱, 直到目标温度达到 (20–40分钟)。
2. 将包含50毫升 2x SSC 的玻璃 Coplin 罐子中的幻灯片洗净5分钟, 或盖玻片松开。
3. 将50毫升 2x SSC 的玻璃 Coplin 罐中的幻灯片洗净5分钟, 两次。
4. 将50毫升 0.2x SSC 的玻璃 Coplin 罐中的幻灯片洗净5分钟。
5. 将50毫升 PBST 的玻璃 Coplin 罐中的幻灯片洗净5分钟。
6. 将50毫升 1x PBS 的玻璃 Coplin 罐中的幻灯片洗净5分钟。
   注意: 不再需要使用 RNase 条件, 因为 rna-rna 混合体被认为是稳定的。

5. 挖掘抗体检测

1. 如果需要, 使用疏水性钢笔在每张幻灯片的组织周围重新绘制一个防水圈。
2. 将500µL 的阻塞解决方案应用于每张幻灯片的长度。在室温下, 在湿润室中, 在 RT 水平上孵化30分钟的幻灯片。
3. 在1.5 毫升管中稀释500µL ofblocking 溶液中 0.5 ul 的挖抗体, 以制备挖掘抗体溶液 (1:1, 000)。
   注意: 此步骤可能需要进行优化 (1:500–1:2, 000)。
4. 应用500µL 的挖抗体溶液的长度每张幻灯片。在室温下, 在一个加湿室中水平地孵化1小时的幻灯片。
5. 将50毫升 PBST 的玻璃 Coplin 罐中的幻灯片洗净5分钟, 三次。
6. 将50毫升 prestaining 溶液的玻璃 Coplin 罐中的幻灯片洗净5分钟, 两次。
7. 在聚丙烯滑动邮件罐中孵化幻灯片, 包含20毫升 ofAP 底物溶液, 37 摄氏度, 6–24 h, 保护免受光照。
   注意: 应该每2小时检查一次颜色开发, 这一步可能需要进行优化。
8. 将50毫升 KTBT 溶液的玻璃 Coplin 罐中的幻灯片洗净5分钟, 两次。
9. 将50毫升 1x PBS 的玻璃 Coplin 罐中的幻灯片洗净5分钟。

6. cTnT 抗体检测

1. 如果需要, 使用疏水性钢笔在每张幻灯片的组织周围重新绘制一个防水圈。
2. 将500µL 的阻塞解决方案应用于每张幻灯片的长度。在室温下, 在一个加湿室中水平地孵化1小时的幻灯片。
3. 在1.5 毫升管中稀释 200 ul ofblocking 溶液中 cTnT 抗体的 2 ul, 制备 cTnT 抗体溶液 (1:100)。
4. 对每张幻灯片的长度应用200µL 的 cTnT 抗体溶液。在湿润室中, 在4摄氏度水平上孵化幻灯片。
5. 将50毫升 1x PBS 的玻璃 Coplin 罐中的幻灯片洗净5分钟, 三次。
6. 在1.5 毫升管中稀释 250 ul ofblocking 溶液中 anti-rabbit-568 抗体的 0.5 ul, 制备 anti-rabbit-568 抗体溶液 (1:500)。
7. 对每张幻灯片的长度应用250µL 的 anti-rabbit-568 抗体溶液。在室温下, 在一个加湿室中水平地孵化1小时的幻灯片。
8. 将50毫升 1x PBS 的玻璃 Coplin 罐中的幻灯片洗净5分钟, 三次。
9. 可选: 对每张幻灯片的长度应用250µL 的 DAPI 工作解决方案, 并在 RT 水平上孵化出1分钟的幻灯片, 防止光线直射。
10. 将50毫升 1x PBS 的玻璃 Coplin 罐中的幻灯片洗净5分钟, 两次。

7. 安装和成像

1. 装上带有2–3滴的安装介质和玻璃罩滑块的幻灯片。允许幻灯片干燥平坦, O/N, 在4摄氏度, 免受光。
2. 进行 epifluorescent 或共焦显微术。

结果

利用 miRNA 和 U6-snRNA 对小鼠心脏切片进行 miRNA原位杂交, 分别作阴性和阳性对照。阳性染色用蓝色表示, 而阴性染色则是由于缺乏颜色发展 (图 1A-1B)。从控制和 PlGF overexpressing 小鼠的心脏切片评价 miRNA-182 心肌细胞特异表达。在αMHC 启动子下携带 PlGF 转基因的小鼠在6周的转基因活化²⁶中发展心肌肥厚, 继发血管生成增加。我们进行原位杂交, 发现 PlGF 小鼠心脏的 miRNA-182 表达增加, 与对照组 (图 2A-2H) 相比, 蓝色染色表明。为了确定表达 miRNA-182 的单元格类型, 我们在同一节上对 cTnT 执行染色。我们发现 miRNA-182 与 cTnT 阳性心肌细胞, 以及 DAPI 染色核, 在控制和 PlG...

讨论

miRNA 的成绩单检测可以通过不同的技术, 差异的灵敏度, 特异性和数量的权力。在这里, 我们展示了 miRNA原位杂交与染色的耦合, 并描述了一个协议, 允许同时评估 miRNA 和蛋白质分子的表达水平, 在同一心脏部分。我们首先展示了如何在石蜡嵌段心脏切片上进行挖标低噪声 miRNA 探针原位杂交。接下来, 我们描述如何在同一节上执行染色 cTnT。最后, 我们演示了如何合并生成的颜色和荧光图像。该协议已被优化的福尔马林固定 (4 °c, O/N)/石蜡嵌入小鼠心脏组织, 使用挖掘标记的低噪声 miRNA 探针和 cTnT。如下所述, 可能需要对不同的组织、探针或抗体类型进行进一步的优化。

RNase 的条件应小心地实施贯穿于探针杂交的步骤, 因为 RNase 污染会严重损害实验结果。所有的解决方案应与 DEPC 处理 ddH₂O, 所有 Coplin 罐应处理的 RNase 净化解决方案。此外, 当使用不同的挖掘标记的低噪声放大 miRNA 探头时, 应考虑以下因素。杂交温度取决于每个探针的熔化温度 (Tm)。作为一...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
焦碳酸二乙	Sigma Aldrich	D5758	DEPC
磷酸盐缓冲盐水	Sigma Aldrich	P4417	PBS
吐温-20	美国生物分析	AB02038	非离子表面活性剂
Histoclear	National Diagnostics	HS-200
蛋白酶 K，重组，PCR 级 Sigma	Aldrich	3115879001	ProK
多聚甲醛	Sigma Aldrich	P6148	PFA
氯化钠	ThermoFisher	S271	NaCl
氯化镁 六水合	ThermoFisher	M33	MgCl2
Tris	Sigma Aldrich	T6066
盐酸溶液，1 N	ThermoFisher	SA48	HCl
盐酸溶液，12 N	ThermoFisher	S25358	HCl
1-甲基咪唑	Sigma Aldrich	336092
N-（3-二甲基氨基丙基）-N′-乙基碳二亚胺盐酸盐	Sigma Aldrich	39391	EDC
过氧化氢溶液 H2O2	Sigma	Aldrich 216763	H2O2
柠檬酸三钠二水合	Sigma Aldrich	S1804	柠檬酸钠
miRCURY LNA miRNA ISH 缓冲液套装 （FFPE）	Qiagen	339450	加扰 miRNA/U6 snRNA
miRCURY LNA mmu-miR-182 检测探针	QIagen	YD00615701	5'-DIG 和 3'-DIG 标记
的盐酸左旋咪唑	SigmaAldrich	31742
牛血清白蛋白	Sigma Aldrich	A9647	BSA
NBT/BCIP 片	Sigma Aldrich	11697471001	NBT-BCIP
氯化钾	ThermoFisher	P217	KCl
DAPI 溶液 （1mg/ml）	ThermoFisher	62248	DAPI
玻璃盖玻片	ThermoFisher	12-545E	玻璃盖玻片
塑料盖玻片	Grace Bio-Labs	HS40 22mmX40mmX0.25mm	不含RNA酶的塑料盖玻片
抗地高辛-AP、Fab片段	Sigma Aldrich	11093274910	DIG抗体
疏水屏障笔	Vector Laboratories	H-4000	巴氏笔
抗心肌肌钙蛋白T抗体	Abcam	ab92546	cTnT抗体
山羊抗兔 IgG （H+L） 交叉吸收二抗，Alexa Fluor 568	ThermoFisher	A-11011	抗兔 568 抗体
Dako 荧光封固剂	DAKO	S3023	封固剂
绵羊血清	Sigma Aldrich	S3772
山羊血清	Sigma Aldrich	G9023
去离子甲酰胺	American生物分析	AB00600
杂交箱	ThermoFisher	UVP HB-1000 杂交仪