Method Article

原位杂交法在小鼠心脏切片组织特异 miRNA 表达谱分析中的应用

DOI:

10.3791/57920

⸱

September 15th, 2018

 ,  , 
1Department of Cell and Developmental Biology, University College London, 2Yale Cardiovascular Research Group, Section of Cardiovascular Medicine, Yale School of Medicine, 3Yale Cardiovascular Research Center, Section of Cardiovascular Medicine, Yale School of Medicine

In This Article

Summary

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微 rna (miRNAs) 是短而高度同源的 RNA 序列, 充当信使 rna (基因) 的转录后调节剂。目前 miRNA 检测方法的灵敏度和特异性各不相同。我们描述了一个协议, 结合原位杂交和染色的同时检测 miRNA 和蛋白质分子在小鼠心脏组织切片。

Abstract

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微 rna (miRNAs) 是单链 RNA 转录, 绑定到信使 rna (基因) 和抑制他们的翻译或促进其退化。到目前为止, miRNAs 已牵连到大量的生物和疾病进程, 这标志着需要可靠的检测方法的 miRNA 记录。在这里, 我们描述了一个详细的协议, 辛标记 (挖掘) 锁定核酸 (低噪声放大) 探针为基础的 miRNA 检测, 结合蛋白染色的小鼠心脏切片。首先, 采用原位杂交技术, 利用探针对控制和心肌肥厚小鼠心脏切片中的 miRNA-182 表达进行鉴别。接下来, 我们进行了染色肌钙蛋白 T (cTnT) 蛋白, 在相同的部分, 共同本地化 miRNA-182 与心肌细胞。使用该协议, 我们能够检测 miRNA-182 通过碱性磷酸酶为基础的比色法, 并通过荧光染色 cTnT。该协议可用于检测任何 miRNA 的表达, 通过挖掘标记的低噪声放大探针和相关蛋白表达的小鼠心脏组织切片。

Introduction

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微 rna (miRNAs) 是短的 (18–25核苷酸), 单链, 非编码 rna, 在转录后水平的基因表达负调节作用, 抑制信使 RNA (mRNA) 翻译和/或促进 mRNA 退化1. miRNAs 是从编码或非编码基因的内含子或外显子中转录出来的, 并在细胞核中被 DROSHA、前体 miRNAs (前 miRNAs), 后者为70核苷酸2的短茎环结构。在细胞质出口之后, DICER 将 miRNAs 进一步加工成成熟的 miRNAs, 跨度18–25核苷酸3,4。随后, RNA 诱导的沉默复合体 (RISC) 将这些 miRNAs 作为单链 rna, 允许它们绑定到其目标基因的 3 ' 未翻译区 (3 '-UTR), 以抑制其表达式3,5.

在过去的三年里, 自从他们第一次被发现以来, miRNAs 已经出现, 掌握基因表达的调控者, 他们自己的表达水平被严密控制6。miRNAs 的角色已经在器官发育7、

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Protocol

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本研究的小鼠心脏组织样本是按照相关法律和机构指南获得的, 并经耶鲁大学机构动物护理和使用委员会批准。

1. 解决方案准备

  1. RNase 免费 ddH2o, 用5毫升 0.1% diethylpyrocarbonate (DEPC) 在室温下 (RT) 处理5升的 ddH2o。高压釜 (121 °c) 停用 DEPC。使用 DEPC 处理的 ddH2O 进行下游溶液的制备, 如下所示。
    注意: DEPC 是已知的致癌物质, 只有油烟机中的手柄。
  2. ddH2o 型高压釜 (121 摄氏度) 溶出 5 PBS 片, 制备1x 磷酸缓冲盐水 (pbs) 溶液, DEPC 1 升。
  3. 0.1% 非离子洗涤剂/PBS (PBST) 稀释1毫升的非离子洗涤剂每1升 1x PBS。
  4. 在 DEPC 处理的 ddH2O 上制备90%、70%、50% 和30% 乙醇。
  5. 准备一个10毫克/毫升的蛋白酶 K (普罗克) 溶液在 DEPC 处理 ddH2o 整除和存储在-20 摄氏度。在50毫升的 DEPC 处理的 ddH2o 普罗克溶液中稀释 100 ul 的普罗克, 制备20微克/毫升工作溶液。
  6. 在50毫升的 1x PBS 中加入....

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Results

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利用 miRNA 和 U6-snRNA 对小鼠心脏切片进行 miRNA原位杂交, 分别作阴性和阳性对照。阳性染色用蓝色表示, 而阴性染色则是由于缺乏颜色发展 (图 1A-1B)。从控制和 PlGF overexpressing 小鼠的心脏切片评价 miRNA-182 心肌细胞特异表达。在αMHC 启动子下携带 PlGF 转基因的小鼠在6周的转基因活化26中发展心肌肥厚, 继发血管生成增加。我们进行原位杂交, 发现 PlGF 小鼠心脏的 miRNA-182 表达增加, 与对照组 (图 2A-2H) 相比, 蓝色染色表明。为了确定表达 miRNA-182 的单元格类型, 我们在同一节上对 cTnT 执行染色。我们发现 miRNA-182 与 cTnT 阳性心肌细胞, 以及 DAPI 染色核, 在控制和 PlG.......

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Discussion

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miRNA 的成绩单检测可以通过不同的技术, 差异的灵敏度, 特异性和数量的权力。在这里, 我们展示了 miRNA原位杂交与染色的耦合, 并描述了一个协议, 允许同时评估 miRNA 和蛋白质分子的表达水平, 在同一心脏部分。我们首先展示了如何在石蜡嵌段心脏切片上进行挖标低噪声 miRNA 探针原位杂交。接下来, 我们描述如何在同一节上执行染色 cTnT。最后, 我们演示了如何合并生成的颜色和荧光图像。该协议已被优化的福尔马林固定 (4 °c, O/N)/石蜡嵌入小鼠心脏组织, 使用挖掘标记的低噪声 miRNA 探针和 cTnT。如下所述, 可能需要对不同的组织、探针或抗体类型进行进一步的优化。

RNase 的条件应小心地实施贯穿于探针杂交的步骤, 因为 RNase 污染会严重损害实验结果。所有的解决方案应与 DEPC 处理 ddH2O, 所有 Coplin 罐应处理的 RNase 净化解决方案。此外, 当使用不同的挖掘标记的低噪声放大 miRNA 探头时, 应考虑以下因素。杂交温度取决于每个探针的熔化温度 (Tm)。作为一.......

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Disclosures

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作者没有什么可透露的。

Acknowledgements

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我们要感谢 Athanasios Papangelis 对手稿的批评性评论。FM 由生物技术和生物科学研究理事会 (BBSRC) 支持;BB/M009424/1)。IP 由美国心脏协会科学家发展补助金 (17SDG33060002) 支持。

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
焦碳酸二乙Sigma AldrichD5758DEPC
磷酸盐缓冲盐水Sigma AldrichP4417PBS
吐温-20美国生物分析AB02038非离子表面活性剂
HistoclearNational DiagnosticsHS-200
蛋白酶 K，重组，PCR 级 SigmaAldrich3115879001ProK
多聚甲醛Sigma AldrichP6148PFA
氯化钠ThermoFisherS271NaCl
氯化镁 六水合ThermoFisherM33MgCl2
TrisSigma AldrichT6066
盐酸溶液，1 NThermoFisherSA48HCl
盐酸溶液，12 NThermoFisherS25358HCl
1-甲基咪唑Sigma Aldrich336092
N-（3-二甲基氨基丙基）-N′-乙基碳二亚胺盐酸盐Sigma Aldrich39391EDC
过氧化氢溶液 H2O2SigmaAldrich 216763H2O2
柠檬酸三钠二水合Sigma AldrichS1804柠檬酸钠
miRCURY LNA miRNA ISH 缓冲液套装 （FFPE）Qiagen339450加扰 miRNA/U6 snRNA
miRCURY LNA mmu-miR-182 检测探针QIagenYD006157015'-DIG 和 3'-DIG 标记
的盐酸左旋咪唑SigmaAldrich31742
牛血清白蛋白Sigma AldrichA9647BSA
NBT/BCIP 片Sigma Aldrich11697471001NBT-BCIP
氯化钾ThermoFisherP217KCl
DAPI 溶液 （1mg/ml）ThermoFisher62248DAPI
玻璃盖玻片ThermoFisher12-545E玻璃盖玻片
塑料盖玻片Grace Bio-LabsHS40 22mmX40mmX0.25mm不含RNA酶的塑料盖玻片
抗地高辛-AP、Fab片段Sigma Aldrich11093274910DIG抗体
疏水屏障笔Vector LaboratoriesH-4000巴氏笔
抗心肌肌钙蛋白T抗体Abcamab92546cTnT抗体
山羊抗兔 IgG （H+L） 交叉吸收二抗，Alexa Fluor 568ThermoFisherA-11011抗兔 568 抗体
Dako 荧光封固剂DAKOS3023封固剂
绵羊血清Sigma AldrichS3772
山羊血清Sigma AldrichG9023
去离子甲酰胺American生物分析AB00600
杂交箱ThermoFisherUVP HB-1000 杂交仪
酯 物 物 剂

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116, 281-297 (2004).
  2. Denli, A. M., Tops, B. B., Plasterk, R. H., Ketting, R. F., Hannon, G. J. Processing of primary microRNAs by the Microprocessor complex. Nature. 432, 231-235 (2004).
  3. Hu....

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