我们提出了一种高效、大规模且快速的化学重编程方法，可将传统的已启动谱系的人类多能干细胞（hPSC）逆转为表观基因组稳定的、类似于着床前上胚层的 naive 多能状态。该方法可显著降低谱系启动相关基因的表达，并在多种传统 hPSC 细胞系中显著提升定向多谱系分化能力。
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方法文章
化学重编程常规人类多能干细胞至类似原始态并增强多向分化潜能
* These authors contributed equally
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摘要
摘要
功能增强的 naïve 人类多能干细胞（N-hPSC）可能在再生医学领域产生广泛影响。本实验方案的目标是高效地将已在无饲养层或依赖饲养层条件下维持的、具有谱系启动特征的传统人类多能干细胞（hPSC）逆转为功能增强的 naïve 样多能状态。该化学诱导的 naïve 逆转方法采用经典的白血病抑制因子（LIF）、GSK3β 抑制剂和 MEK/ERK 抑制剂组合（LIF-2i），并仅额外添加一种tankyrase抑制剂XAV939，形成LIF-3i体系。LIF-3i可将传统hPSC逆转为一种稳定的多能状态，使其在生化特性、转录特征及表观遗传状态上均类似于人类着床前上胚层细胞。该LIF-3i方法所需细胞培养操作极少，在多种人类胚胎干细胞（hESC）和无外源基因整合的人类诱导多能干细胞（hiPSC）系中均具有高度可重复性。LIF-3i方法在后续分化前无需重新启动步骤；N-hPSC可直接高效分化，并保持核型和表观基因组稳定性（包括印记位点）。为提高该方法的普适性，传统hPSC首先在LIF-3i基础上补充两种小分子——激活蛋白激酶A信号通路的forskolin和激活sonic hedgehog（sHH）信号通路的purmorphamine——即LIF-5i体系中进行培养。这一短暂的LIF-5i适应性培养步骤显著增强了传统hPSC最初的克隆扩增能力，使其后续仅需使用LIF-3i即可实现大规模批量向naïve状态的逆转，从而避免了后期需手动挑选或亚克隆稀有N-hPSC克隆的繁琐操作。经LIF-5i稳定化的hPSC随后可在仅含LIF-3i的培养体系中维持，无需添加抗凋亡分子。最重要的是，LIF-3i逆转显著提升了多种传统hPSC的功能性多能性，通过降低其谱系启动相关基因的表达水平，并消除不同独立hPSC系间在定向分化过程中常见的品系间差异。本文提供了LIF-3i逆转所得N-hPSC的代表性鉴定结果，以及对同源遗传背景的hPSC在谱系启动状态下的功能性比较实验策略 对比. 类幼稚状态被概述。
引言
2i（MEK/ERK 和 GSK3β 抑制剂）培养体系最初被开发用于将异质性的血清依赖型小鼠胚胎干细胞（mESC）培养体系优化为一种类似于小鼠着床前上胚层的均一多能性基础状态1。然而，2i 无法支持人类多能干细胞（hPSC）系的稳定维持2。近年来已有多种复杂的化学小分子、添加生长因子以及转基因方法被报道，可用于捕获假定的类似人类原始态样多能性分子状态2。然而，这些方法所建立的许多"原始态样"状态也表现出核型不稳定、表观基因组异常（例如，亲本基因组印记的全局性丢失）或分化潜能受损等问题。
相比之下，GSK3β、ERK和tankyrase信号通路的三重化学抑制剂混合物联合白血病抑制因子（LIF-3i）足以实现多种常规hPSC细胞系稳定类 naive 状态的逆转3LIF-3i逆转的 naive hPSC（N-hPSC）维持了正常的核型，并增强了naive特异性人类着床前上胚层基因的表达水平（例如，NANOG, KLF2, NR5A2、DNMT3L、HERVH、Stella（DPPA3）, KLF17, TFCP2L1）。LIF-3i 重编程还赋予人多能干细胞（hPSC）一系列独特的分子与生化特征，类似于小鼠胚胎干细胞（mESC）的原始多能性状态，包括磷酸化 STAT3 信号增强、ERK 磷酸化水平降低、全基因组 CpG 位点的 5-甲基胞嘧啶整体低甲基化、胚胎干细胞（ESC）特异性基因启动子区域的全基因组范围 CpG 去甲基化，以及远端 OCT4 增强子的主导性使用。此外，与其他导致印记基因组位点异常低甲基化的原始态重编程方法相比，LIF-3i 重编程获得的 N-hPSC 未出现印记 CpG 模式的系统性丢失，也未出现 DNA 甲基转移酶表达的下调。例如，DNMT1、DNMT3A、DNMT3B)3.
在饲养层或E8无饲养层条件下培养的多种常规人类胚胎干细胞（hESC）和人类诱导多能干细胞（hiPSC），通过直接LIF-3i培养可快速且大规模地逆转至初始态上胚层样状态。然而，由于来自遗传背景多样供体的固有基因组变异和谱系启动异质性，某些不稳定的常规hPSC细胞系在直接LIF-3i向初始态逆转过程中效率可能较低。
因此，为了拓展LIF-3i方法的适用性，本文建立并展示了一种逐步优化的方案，该方案可实现几乎所有在饲养层上培养的传统人胚胎干细胞（hESC）或无外源基因整合的人诱导多能干细胞（hiPSC）系的通用性原始态逆转。这种通用化的原始态逆转方法采用了一个短暂的初始培养步骤：在传统hPSC培养阶段，将LIF-3i鸡尾酒体系中额外添加两种小分子（即LIF-5i），以增强蛋白激酶A（forskolin）和音猬因子（sonic hedgehog, sHH）信号通路（使用purmorphamine）。传统hPSC在LIF-5i条件下经历一次初始传代后，即可适应后续在LIF-3i条件下进行的大规模稳定原始态逆转。初始阶段的LIF-5i适应显著增强了传统hPSC在E8培养基或饲养层上单细胞克隆的增殖能力（此为后续仅使用LIF-3i进行稳定连续传代的前提）。经过LIF-5i一次传代适应的传统hPSC系，能够在LIF-3i条件下耐受原始态逆转后细胞的大规模克隆性传代，从而避免了必须手动挑选和亚克隆稀有稳定克隆的步骤，也无需常规使用抗凋亡分子或Rho相关蛋白激酶（ROCK）抑制剂。
LIF-3i 方法已成功用于稳定扩增和维持广泛的 >30 株独立且遗传多样性丰富的常规人多能干细胞系 >使用非酶法或酶法解离方法传代10–30次后，未发现染色体或表观基因组异常，包括印记基因位点的异常。此外，LIF-5i/LIF-3i连续培养是迄今为止唯一被报道的原始态重编程方法，可通过降低传统人多能干细胞（hPSC）系的谱系启动基因表达，显著提升其多向分化潜能，从而增强其功能性多能性。LIF-3i原始态重编程方法可消除谱系启动型传统hPSC系固有的细胞系间分化差异，在再生医学与细胞治疗领域具有重要的应用价值。
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方案
所有动物实验均遵循动物护理指南，并经约翰斯·霍普金斯医学院动物护理与使用委员会（IACUC）批准的方案进行。
1. 用于饲养层依赖型常规（hESC 培养基/MEF）或原始态逆转（LIF-3i 培养基/MEF）人多能干细胞培养的小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）的制备
- 根据已发表的方案4，购买或自行制备来自CF1或CF1 × DR4杂交小鼠E13.5胚胎的低代次MEF饲养层细胞。
- 将低代次（p1-p2）MEF细胞在照射前（用于长期保存）或照射后（可保存长达6个月）进行冻存，并按照先前描述的方法储存在液氮中4。
- 使用γ射线或X射线照射器对低于p5代的大量扩增MEF细胞进行照射（5,000 rad），并分装为每管1.5 × 106个细胞，短期储存（少于6个月）于-80 °C超低温冰箱中。
- 为制备饲养层培养物，每块6孔明胶包被板接种1.2 × 106（新鲜照射未冻存）至1.5 × 106（照射后冻存）个MEF细胞，具体操作如下所述。
- 在生物安全柜中，向每个孔加入1.5 mL无菌0.1%明胶溶液，制备明胶包被的6孔无菌组织培养板。
- 将包被好的明胶板置于实验室CO2培养箱中，37 °C孵育至少1小时或过夜。
- 次日，按照下述步骤解冻低代次（例如，P2至P4）经DMSO冻存并已照射（5,000 rad）的MEF细胞。
注意：未照射的MEF细胞也应在使用前解冻、扩增并立即进行照射。 - 将一管冻存的MEF细胞置于37 °C水浴中。待其融化后，在生物安全柜中用乙醇对管壁消毒，并立即用MEF培养基（表1）至少10倍稀释DMSO冷冻保护剂（例如，将1 mL含DMSO的MEF样品转移至无菌15 mL锥形管中的9 mL MEF培养基中）。
- 将稀释后的MEF细胞在无菌15 mL锥形管中以200 × g离心5分钟。
- 在生物安全柜中，吸除并弃去无细胞的上清液，将细胞沉淀重悬于1–2 mL新鲜MEF培养基中。
- 轻轻弃去明胶溶液，并按上述指示，向每孔明胶包被的6孔板中加入2 mL用MEF培养基重悬的MEF细胞。计数MEF细胞，并在每块6孔明胶包被板中接种1.2 × 106（新鲜照射未冻存）或1.5 × 106（照射后冻存）个MEF细胞。
注意：所有从CO2培养箱转移至生物安全柜的细胞培养板可用喷有乙醇的纸巾轻轻擦拭表面，但不得直接喷洒70%乙醇溶液，以免乙醇扩散至孔内。 - 将MEF细胞板置于实验室CO2培养箱中（5% CO2，湿润环境），37 °C孵育过夜，以促进细胞贴壁，之后即可使用。
2. 通过短暂的LIF-5i适应步骤实现常规hPSC培养物的大规模稳定化，以进行后续原始态逆转
- 在开始LIF-5i/LIF-3i重编程之前，须通过G显带技术对所有常规hPSC细胞系进行核型验证，确保其具有正常核型。
注意：LIF-3i 对高代次常规 hPSC 细胞系的逆转作用（例如., P>40–50）应予以避免，因为这些细胞系可能已存在基因组异常，可能对引发表态、常规hPSC细胞系的稳定、高效和大规模LIF-3i重编程产生不利影响。 - 使用经验证核型正常的传统hPSC培养体系，在基于MEF的培养系统（如第1节所述）或无饲养层培养系统（根据研究者偏好）中进行维持和扩增。
注意：两种饲养层依赖性hPSC/MEF共培养体系（例如， hESC 培养基（表1) 添加 4–10 ng/mL bFGF）或无饲养层（例如E8 5 或 mTSER 6 培养基（根据生产商在包被了玻连蛋白的培养板上的使用说明）与使用LIF-5i/LIF-3i/MEF系统进行的大规模初始态逆转方法相兼容图1）。在将常规hPSC进行重编程逆转处理前，传代时优先采用非酶法。LIF-5i和LIF-3i培养基配方中不含抗生素或抗真菌剂。为避免细菌或真菌污染，须严格遵守生物安全柜无菌操作及维护的标准操作规程。 - 对于基于 MEF 的培养体系，应在传代 LIF-5i 适应的常规 hPSC 培养物前至少一天，按照第 1 部分所述方法在明胶包被的 6 孔板中制备 MEF 饲养层。
- 当传统的人多能干细胞（hPSC）培养物达到约50%融合度时（即， 初次接种后3–5天，将标准hESC培养基更换为LIF-5i培养基（每孔2 mL； 表1).
注意：这些步骤需在生物安全柜中进行。 - 在CO₂培养箱中，使用LIF-5i培养基对传统hPSC/MEF进行培养和维持，最长可达2天2 培养箱（5% CO₂）2，潮湿环境）。每日更换LIF-5i培养基，以使其适应后续在LIF-3i培养基中的传代和稳定逆转。
- 或者，对于无饲养层的常规培养（例如在E8培养基中，仅在LIF-5i中培养人多能干细胞过夜，次日早晨即进行传代。
注意：LIF-5i 和 LIF-3i 培养物均可在大气氧浓度（21% O₂）或生理氧浓度（5% O₂）条件下维持培养。2）或生理条件（5% O₂2) CO中的氧气水平2 培养箱（5% CO₂）2，湿润的环境）。 - 传代前，将培养板置于生物安全柜中，用 PBS 洗涤 LIF-5i 适应的常规 hPSC 一次，每孔加入 1 mL 细胞解离试剂。于 37 °C、CO₂ 培养箱中孵育 5 分钟。2 孵育后，在生物安全柜中用移液器轻轻吹打，重悬为单细胞悬液。
注意：也可使用非酶解离缓冲液制备用于传代的单细胞。 - 用无菌15 mL圆底离心管收集细胞悬液（以hESC培养基至少2倍稀释），通过移液轻轻吹打细胞，获得单细胞悬液。
- 以 300 x 离心 g 孵育5分钟，吸除上清液并弃去，在生物安全柜中用1–2 mL LIF-5i培养基重悬细胞沉淀。使用血细胞计数板或自动细胞计数仪对细胞进行计数。
- 用 PBS 洗涤预铺的 MEF 培养板两次（6 孔板每孔 2 mL），然后每孔加入 1–2 × 10⁶ 个细胞6 将细胞（置于2 mL LIF-5i培养基中）接种至经PBS洗涤的MEF培养板的1个孔中。
- 针对每种需重编程为幼稚态的 hPSC 细胞系，调整并优化初始接种密度，因为再接种效率可能存在较大差异。将培养板置于 CO₂ 培养箱中2 培养箱（5% CO₂）2，湿润的环境）。
注意：对于大多数hPSC细胞系，不建议在此方法中常规使用抗凋亡试剂。LIF-5i系统本身已能显著提高常规hPSC细胞系的初始群体克隆重铺效率。然而，对于某些倾向于自发分化的不稳定谱系启动型hPSC细胞系，在首次传代时一次性使用ROCK抑制剂（5–10 μM Y-27632）可能进一步提高其在LIF-5i系统中的初始克隆重铺效率。 - 若从无饲养层培养体系开始（例如，E8），将一孔经LIF-5i适应的解离后常规hPSC直接转移至一孔已接种经照射的MEF培养板中（即1:1 传代
- 第二天，轻轻摇晃培养板以悬浮所有未贴壁的细胞，吸去培养基（可选进行PBS洗涤），更换为2 mL LIF-5i培养基。在生物安全柜中每日执行此步骤，持续3–5天，或直至细胞融合度达到60–70%图1）。将培养板放入 CO2 培养箱（5% CO₂）2，湿润的环境）。
3. LIF-3i 培养基中 N-hPSC 的长期维持与扩增
- 在初次适应 LIF-5i 培养条件后，于生物安全柜中每 3–4 天传代一次稳定的 LIF-3i 培养物，或当培养物达到 60–70% 汇合度时进行传代（图 1）。
注意：LIF-3i 培养物需要严格维护，若让 N-hPSC 培养物因长时间培养（例如，>4 天）而达到高汇合度/高细胞密度，会降低后续克隆再接种效率，并促进自发分化。 - 在生物安全柜中，弃去培养基，通过轻柔加入 2 mL PBS 洗涤 LIF-5i/LIF-3i 培养物的每个孔。弃去 PBS，加入 1 mL 细胞解离液。在 CO2 培养箱（5% CO2，湿润环境）中 37 °C 孵育 5 分钟。
- 收集细胞悬液，加入 hESC 培养基（不含抑制剂或生长因子（表 1）；至少 2 倍稀释），以回收全部 hPSC，并通过移液器轻柔吹打获得单细胞悬液。将悬液转移至无菌的 15 mL 锥形离心管中。
- 以 300 g 离心 5 分钟，吸除/弃去上清液。将细胞沉淀重悬于 LIF-3i 培养基中。使用血细胞计数板或自动细胞计数仪对细胞进行计数。
- 常规传代 LIF-3i 培养物时，将约 2 × 105 个细胞/孔接种至明胶包被的 6 孔板中的辐照 MEF 上。对于初次从 LIF-5i 适应而来的培养物，在首次传代至 LIF-3i/MEF 前，应接种较高初始密度（4 × 105 个细胞/孔）。
- 将已适应 LIF-5i 的 hPSC 重新接种并分配至新鲜的、经 PBS 洗涤的辐照 MEF 饲养层板（前一天按上述方法制备）中，使用 LIF-3i 培养基培养。每日更换 LIF-3i 培养基。
- 在将 N-hPSC 用于功能研究或冷冻保存前，需在 LIF-3i 培养基中连续进行至少 4–7 次群体传代。记录 N-hPSC 在常规培养基或 LIF-3i 培养基中的传代次数。
注意：不建议对高代次（例如，>p40）已定向分化的常规 hPSC 细胞系进行 LIF-3i 逆转。应尽可能在可获得的最低代次时对常规 hPSC 细胞系进行逆转。此外，不建议将经历超过 10 次 LIF-3i 传代的 LIF-3i 逆转 hPSC 用于功能研究，因为此类 N-hPSC 培养物可能因长期克隆细胞培养筛选而携带核型异常的克隆。若无 LIF-3i 中传代数小于 <10 的 N-hPSC 储备，应重新对低代次的常规 hPSC 细胞系进行新鲜的 LIF-5i/LIF-3i 逆转。
4. LIF-3i 逆转的 N-hPSC 的冷冻保存与解冻
- 在用于功能研究或长期冻存之前，需将重编程后的 N-hPSC 在 LIF-3i 培养基中至少传代 5–7 次，具体操作如上所述。在每支冻存管上记录常规培养条件和 LIF-3i 条件下的传代次数。
注意：未用于功能检测的过量 LIF-3i 重编程 N-hPSC 可在每次传代时进行冻存，但较低传代次数（例如., <p3）的细胞冻存可能导致解冻后复苏效率低下或高度不稳定。 - 在生物安全柜中，吸除培养基，用 PBS 洗涤细胞（每孔 2 mL），吸除 PBS，然后使用细胞解离液将 hPSC 克隆解离为单细胞（每孔 1 mL）。将培养板置于 CO2 培养箱（5% CO2，湿润环境）中 37 °C 孵育 5 分钟。用 LIF-3i 培养基将解离液稀释一倍（2 倍稀释），收集 hPSC 至无菌 15 mL 锥形管中，以 200 × g 离心 5 分钟，再将细胞沉淀重悬于 LIF-3i 培养基中（每孔等效 1–2 mL）。使用血细胞计数板或自动细胞计数仪计数细胞数量。
- 将 N-hPSC 在 LIF-3i 培养基中以 200 × g 离心 5 分钟，在生物安全柜中用冷冻液（表 2）重悬细胞，细胞密度至少为 1 × 106 个细胞/mL。
- 将细胞转移至长期储存用冻存管中，并放入程序降温盒内。于 -80 °C 冰箱中过夜冷冻。
- 次日，将冻存管转移至液氮罐中进行长期保存。
- 解冻时，将冻存管置于 37 °C 水浴中约 2 分钟。对管体进行消毒（即，喷洒乙醇），在无菌生物安全柜中将 hPSC 转移至无菌 15 mL 锥形管，并在含 5 μM Rho 相关蛋白激酶（ROCK）抑制剂 Y-27632 的 hESC 培养基（表 1）中缓慢稀释 10 倍。
- 以 200 × g 离心 5 分钟。在生物安全柜中弃去上清液，将细胞沉淀重悬于含 5 μM ROCK 抑制剂 Y-27632 的 LIF-3i 培养基（1–2 mL）中。
注意：若未添加 Y-27632，将导致解冻后细胞复苏效率显著降低（图 2）。 - 将重悬于 LIF-3i/ROCK 抑制剂中的解冻细胞接种至经 PBS 洗涤的 MEF 包被孔板中。LIF-3i 培养的细胞应以每管 1 × 106 个细胞的密度进行冻存。每支冻存管解冻后接种至明胶包被的 6 孔板中的一个孔。
- 次日，开始使用常规 LIF-3i 培养基进行扩增培养，不再添加 Rho 激酶抑制剂。
5. 收集 N-hPSC 样本的饲养层去除
- 从LIF-3i/MEF（或hESC/MEF常规）培养物中制备样品（即，用于基因表达（例如， 定量RT-PCR，微阵列）或蛋白质（例如， Western blot）分析中，根据制造商方案，使用包被抗TRA-1-81抗体的磁珠，通过磁性激活细胞分选（MACS）从MEF饲养层中去除LIF-3i培养物。
- 或者，可采用以下简单的预铺板方法去除培养物中的饲养层，具体步骤如下所述。
- 在无菌生物安全柜中，弃去无细胞的上清液，每孔用 2 mL 无菌 PBS 洗涤细胞沉淀。使用细胞解离液（1 mL/孔）解离贴壁的 LIF-3i/MEF 培养物。在 CO₂ 培养箱中孵育 5 分钟。2 培养箱（5% CO₂）2，湿润的环境）。在无菌的15 mL锥形管中收集hPSC。用hESC培养基洗涤2次，将细胞转移至无菌的15 mL锥形管中，于200 × g离心 g 5 分钟。
- 在生物安全柜中，将 LIF-3i/MEF 解离的每个孔中的细胞重悬于 2 mL LIF-3i 培养基中，并直接转移至已新鲜涂有 0.1% 明胶的新 6 孔板孔中。
- 将 LIF-3i/MEF hPSC 细胞在 37 °C 的 CO₂ 培养箱中孵育 1 小时2 培养箱（5% CO₂）2，湿润的环境）。用移液器将非贴壁细胞收集至新的锥形管中。每孔轻轻加入 2 mL hESC 培养基，轻轻晃动以收集残留的非贴壁细胞。
注意：大多数经照射的MEF将在1小时内贴附于明胶包被的培养板上，而大部分hPSC仍保持悬浮状态。 - 将细胞混合后在300 x g条件下离心 g 5 分钟。用 PBS 洗涤。离心后将细胞沉淀在液氮中速冻，或 alternatively 用与下游蛋白质或核酸分析兼容的裂解缓冲液重悬沉淀。图2B).
- 对LIF-3i hPSC细胞系进行表征，并以匹配的常规启动型同基因hPSC对照作为参照。
注意：由于启动型培养物之间及内部存在固有的变异性，需在培养的相应时间点或初始状态逆转前设置相应的对照。下游免疫荧光生物成像、流式细胞术、蛋白质印迹（Western blotting）、基因表达分析（RT-PCR 检测和微阵列）、甲基化研究（点杂交、CpG 甲基化微阵列）、OCT4 近端和远端增强子优势报告基因检测以及信号通路抑制剂检测的详细方案和材料已在其他文献中提供3.
6. 初始态逆转后：在用于功能检测前对LIF-3i逆转的初始态hPSC进行基因组完整性和亲本印记保留的验证
- 筛选起始的启动型常规人多能干细胞（hPSC）培养物，以确认其具有正常核型（例如，采用已发表的方法进行吉姆萨带染色分析 7在启动LIF-5i/LIF-3i逆转之前。
注意：这是为了消除可能携带异常基因组改变的传统hPSC群体，这些改变可能在克隆LIF-3i条件下产生人为的选择性存活优势。 - 为获得最佳结果，应在数周内使用LIF-3i将常规hPSC培养物重新转化为类似 naive 状态 之前 在功能研究或定向分化中的应用
注意：在初始状态逆转后，不建议在LIF-3i条件下进行超过10代的常规长期“维持”培养。人胚胎干细胞（hESC）和人诱导多能干细胞（hiPSC）系的常规扩增与维持应使用传统培养系统进行。例如， 在 E8 或含 bFGF 的 MEF/hESC 培养基中。 - 在LIF-3i逆转后5–7代，评估N-hPSC系是否维持正常核型例如，采用吉姆萨带染色分析7，或其他任何合适的方法）。
- 通过选择的DNA甲基化分析方法，评估所有回复型N-hPSC细胞系是否保留正常的亲本基因组印记例如，关于LIF-3i逆转的N-hPSC中亲本印记的CpG DNA微阵列分析方案已在其他文献中提供3在LIF-3i逆转培养5–10代后
7. 初始态逆转：利用LIF-3i逆转的N-hPSC进行定量定向分化实验的设计指南
- 直接将LIF-3i N-hPSC用于既定的定向分化方案，无需额外的细胞培养操作。
注意：使用LIF-3i方法时，无需进行再引物化（i.e., 在用于定向分化检测前将N-hPSC重新转换为传统的引物化状态），也不推荐这样做。 - 为控制检测方法及不同细胞系间变异对单个hPSC系功能测试的影响，应通过至少三个来自不同遗传背景的hPSC系（i.e., 多个供体来源的hiPSC和hESC），采用独立的分化方案交叉验证谱系特异性分化潜能。
- 在进行功能比较时，应以相同传代次数、平行设置来自同一（同基因型）hPSC系的兄弟培养物，与传统的引物化hPSC和LIF-3i逆转的hPSC培养物同时进行。将引物化/ naïve状态的同基因型hPSC兄弟培养物分别维持在其对应的培养基中（e.g., E8 vs. LIF-3i），并使用相同的分化方案和材料同步进行分化，以消除任何实验偏差（图4）。
- 在同基因型引物化与naïve hPSC比较中，应针对每个独立的分化检测调整并优化初始接种密度。
注意：有关LIF-3i逆转N-hPSC的神经前体细胞、定形内胚层及血-内皮定向分化的详细方案已在别处提供3。在定向分化检测中，LIF-3i逆转的N-hPSC比传统hPSC具有更强的增殖能力和分化潜能。N-hPSC通常需要比传统hPSC更低的初始接种浓度，且与传统的引物化hPSC不同，在酶消化后的分化检测中无需使用抗凋亡试剂来提高其克隆存活率。
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结果
本方案通过LIF-3i在依赖饲养层和非依赖饲养层的已启动谱系常规hPSC培养体系中均实现了高效的类似原始态逆转（图1）。本文所述的详细方案概述了从依赖饲养层或无饲养层的常规hPSC培养条件（例如 E8培养基）开始，逐步适应LIF-3i的连续操作步骤。
LIF-3i 逆转多种常规 hESC 和无外源基因 hiPSC 细胞系的代表性结果如图1–3所示。这些典型结果可通过商业化的 hESC 细胞系 H9，或由 Zambidis 实验室建立的商业化无外源基因、脐带血来源的附加体型 hiPSC 细胞系（6.2）进行验证8,9。引入初始的 LIF-5i 适应步骤，可实现常规 hPSC 培养物在 LIF-3...
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讨论
LIF-3i 系统将经典的小鼠 2i 初始态重编程鸡尾酒配方1进行改良后应用于人类多能干细胞。通过在该配方中添加端锚聚合酶（tankyrase）抑制剂 XAV939，可在 LIF-2i 条件下稳定 hPSC 的自我更新能力（hPSC 无法仅在 2i 条件下扩增）。LIF-3i 培养体系可实现常规 hPSC 高效、大规模地重编程为类似于人类着床前上胚层的多能状态3。尽管 XAV939 在 hPSC 中的作用机制可能较为复杂，并与 2i 存在协同效应，但至少包括通过 WNT 信号通路对 hPSC 自我更新能力的重要稳定和增强作用3。
传统的hPSC培养通常处于多种多样的多能性状态，表现出高度可变的谱系启动基因表达以及着床后上胚层样的表观遗传标记，这可能导致功能多能性的不一致或减弱2...
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披露
根据Life Technologies与约翰斯·霍普金斯大学（JHU）之间的许可协议，Zambidis博士有权分享该大学因干细胞许可而获得的部分特许权使用费。此安排的条款由JHU根据其利益冲突政策进行管理。这并不影响作者遵守期刊关于共享数据和材料的政策。
致谢
本工作获得了以下机构的资助：美国国立卫生研究院/国立眼科研究所（NIH/NEI，项目号R01EY023962）、美国国立卫生研究院/国立儿童健康与人类发展研究所（NIH/NICHD，项目号R01HD082098）、研究视力保护基金会（RPB）Stein创新奖、马里兰干细胞研究基金（项目号2018-MSCRFV-4048、2014-MSCRFE-0742）、诺和诺德科学论坛奖以及Moseley基金会。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 抗 SSEA-1/CD15 抗体，APC 标记 | BD Biosciences | 561716 | 每项实验使用 5µL（FACS） |
| 抗 TFCP2L1 抗体 | Sigma Aldrich | HPA029708 | 使用 1:100 稀释度（免疫染色） |
| 抗 beta-肌动蛋白抗体 | Abcam | ab6276 | 使用 1:5000 稀释度（Western blot） |
| 抗 CD146 抗体， PE 标记 | BD Biosciences | 550315 | 每项实验使用 5µL（FACS） |
| 抗 CD31 抗体，APC 标记 | eBioscience | 17-0319-42 | 每项实验使用 2µL（FACS） |
| 抗 CD31 微珠试剂盒 | Miltenyi Biotec | 130-091-935 | |
| 抗 NANOG 抗体 | Abcam | ab109250 | 使用 1:100 稀释度（免疫染色） |
| 抗 NR5A2 抗体 | Sigma Aldrich | HPA005455 | 使用 1:100 稀释度（免疫染色） |
| 抗 p44/42 MAPK（Erk1/2）抗体 | Cell Signaling | 4695 | 使用 1:1000 稀释度（Western blot），用于总蛋白检测 |
| 抗 磷酸化-p44/42 MAPK（Erk1/2）（Thr202/Tyr204）抗体 | Cell Signaling | 4370 | 使用 1:1000 稀释度（Western blot） |
| 抗 磷酸化-STAT3（Tyr705）抗体 | Cell Signaling | 9145 | 使用 1:1000 稀释度（Western blot） |
| 抗兔免疫球蛋白抗体，生物素标记 | Agilent | E0432 | 使用 1:500–1:1000 稀释度（免疫染色） |
| 抗 SSEA-4 抗体，APC 标记 | R&D System | FAB1435A | 每项实验使用 5µL（FACS） |
| 抗 SSEA-4 GloLIVE 抗体，NL493 标记 | R&D System | NLLC1435G | 使用 1:50 稀释度（活细胞及固定细胞免疫染色） |
| 抗 STAT3 抗体 | Cell Signaling | 9139 | 使用 1:1000 稀释度（Western blot），用于总蛋白检测 |
| 抗 STELLA/DPPA3 抗体 | Millipore | MAB4388 | 使用 1:50 稀释度（免疫染色） |
| 抗 TRA-1-60 GloLIVE 抗体，NL557 标记 | R&D System | NLLC4770R | 使用 1:50 稀释度（活细胞及固定细胞免疫染色） |
| 抗 TRA-1-60 StainAlive 抗体，DyLight 488 标记 | Stemgent | 09-0068 | 使用 1:100 稀释度（活细胞及固定细胞免疫染色） |
| 抗 TRA-1-81 StainAlive 抗体，DyLight 488 标记 | Stemgent | 09-0069 | 使用 1:100 稀释度（活细胞及固定细胞免疫染色） |
| 抗 TRA1-60 抗体，PE 标记 | BD Biosciences | 560193 | 每项实验使用 10µL（FACS） |
| 抗 TRA1-81 抗体，PE 标记 | BD Biosciences | 560161 | 每项实验使用 10µL（FACS） |
| APEL2-Li | StemCell Technologies | 5271 | |
| 牛血清白蛋白 | Sigma Aldrich | A3311 | |
| CellAdhere 稀释缓冲液 | StemCell Technologies | 7183 | 用于 Vitronectin XF™ 基质的稀释 |
| CF1 小鼠 | Charles River | 023 | |
| CHIR99021 | R&D System | L5283 | 用 DMSO 重悬至 100 mM |
| 共聚焦显微镜系统 | Zeiss | LSM 510 | |
| 脐带血 CD34+ 来源的 iPSC 细胞系 | Thermo Fisher Scientific | A18945 | 也称为 6.2 细胞系 |
| Corning Costar 组织培养处理 6 孔板 | Corning | 3506 | |
| Countess 细胞计数板 | Thermo Fisher Scientific | C10228 | |
| Countess 自动细胞计数仪 | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | |
| DMEM（Dulbecco 改良 Eagle 培养基） | Thermo Fisher Scientific | 11995-065 | |
| DMEM-F12 | Thermo Fisher Scientific | 11330-032 | |
| DMSO（二甲基亚砜） | Sigma Aldrich | D2650 | |
| DR4 小鼠 | The Jackson Laboratory | 3208 | |
| Essential 8（E8）培养基 | StemCell Technologies | 5940 | |
| 胎牛血清（FBS） | Thermo Fisher Scientific | SH30071.03 | |
| 佛司可林 | Stemgent | 04-0025 | 用 DMSO 重悬至 100 mM |
| 明胶（猪源） | Sigma Aldrich | G1890-100G | 溶于水后高压灭菌 |
| KnockOut 血清替代物 | Thermo Fisher Scientific | 10828-028 | |
| L-谷氨酰胺（100X） | Thermo Fisher Scientific | 25030-081 | |
| MEM 非必需氨基酸（MEM NEAA）（100X） | Thermo Fisher Scientific | 11140-050 | |
| mTeSR1 培养基 | StemCell Technologies | 85850 | |
| Nalgene 冻存管 | Thermo Fisher Scientific | 5000-0020 | |
| Nunc Lab-Tek II 培养腔室载玻片系统 | Fisher Scientific | 154534 | |
| 4% 多聚甲醛（PFA）溶液，PBS 配制 | USB Corporation | 19943 | |
| PD0325901 | Sigma Aldrich | PZ0162 | 用 DMSO 重悬至 100 mM |
| 青霉素/链霉素（10,000 U/mL） | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | Biological Industries | 02-023-1A | |
| 嘌morphamine | Stemgent | 04-0009 | 用 DMSO 重悬至 10 mM |
| 重组人 Activin A | Peprotech | AF-120-14E | |
| 重组人骨形态发生蛋白（BMP）-4 | Peprotech | 120-05ET | 用含 0.1% 牛血清白蛋白的 PBS 重悬至 100 µg/mL |
| 重组人碱性成纤维细胞生长因子（bFGF） | Peprotech | 100-18B | 用含 0.1% 牛血清白蛋白的 PBS 重悬至 100 µg/mL |
| 重组人白血病抑制因子（LIF） | Peprotech | 300-05 | 用含 0.1% 牛血清白蛋白的 PBS 重悬至 100 µg/mL |
| SB431542 | Stemgent | 04-0010-05 | 用 DMSO 重悬至 100 mM |
| Stemolecule Y27632 溶液 | Stemgent | 04-0012-02 | ROCK 抑制剂溶液（10 mM） |
| StemPro Accutase 细胞解离试剂 | Thermo Fisher Scientific | A11105-01 | |
| 链霉亲和素-Cy3 偶联物 | Sigma Aldrich | S6402 | 使用 1:500–1:1000 稀释度（免疫染色） |
| Thermo Scientific Mr. Frosty 冻存盒 | Thermo Fisher Scientific | 5100-0001 | |
| 血管内皮生长因子（VEGF）-165 | Peprotech | 100-21 | 用含 0.1% 牛血清白蛋白的 PBS 重悬至 100 µg/mL |
| Vitronectin XF 基质 | StemCell Technologies | 7180 | 用 CellAdhereµL/mL 稀释缓冲液稀释至 40™ |
| XAV939 | Sigma Aldrich | X3004 | 用 DMSO 重悬至 100 mM |
| β-巯基乙醇 | Thermo Fisher Scientific | 21985-023 | 避光保存 |
参考文献
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