我们提出了一种高效、大规模且快速的化学重编程方法，可将传统的已启动谱系的人类多能干细胞（hPSC）逆转为表观基因组稳定的、类似于着床前上胚层的 naive 多能状态。该方法可显著降低谱系启动相关基因的表达，并在多种传统 hPSC 细胞系中显著提升定向多谱系分化能力。
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方法文章
化学重编程常规人类多能干细胞至类似原始态并增强多向分化潜能
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
功能增强的 naïve 人类多能干细胞（N-hPSC）可能在再生医学领域产生广泛影响。本实验方案的目标是高效地将已在无饲养层或依赖饲养层条件下维持的、具有谱系启动特征的传统人类多能干细胞（hPSC）逆转为功能增强的 naïve 样多能状态。该化学诱导的 naïve 逆转方法采用经典的白血病抑制因子（LIF）、GSK3β 抑制剂和 MEK/ERK 抑制剂组合（LIF-2i），并仅额外添加一种tankyrase抑制剂XAV939，形成LIF-3i体系。LIF-3i可将传统hPSC逆转为一种稳定的多能状态，使其在生化特性、转录特征及表观遗传状态上均类似于人类着床前上胚层细胞。该LIF-3i方法所需细胞培养操作极少，在多种人类胚胎干细胞（hESC）和无外源基因整合的人类诱导多能干细胞（hiPSC）系中均具有高度可重复性。LIF-3i方法在后续分化前无需重新启动步骤；N-hPSC可直接高效分化，并保持核型和表观基因组稳定性（包括印记位点）。为提高该方法的普适性，传统hPSC首先在LIF-3i基础上补充两种小分子——激活蛋白激酶A信号通路的forskolin和激活sonic hedgehog（sHH）信号通路的purmorphamine——即LIF-5i体系中进行培养。这一短暂的LIF-5i适应性培养步骤显著增强了传统hPSC最初的克隆扩增能力，使其后续仅需使用LIF-3i即可实现大规模批量向naïve状态的逆转，从而避免了后期需手动挑选或亚克隆稀有N-hPSC克隆的繁琐操作。经LIF-5i稳定化的hPSC随后可在仅含LIF-3i的培养体系中维持，无需添加抗凋亡分子。最重要的是，LIF-3i逆转显著提升了多种传统hPSC的功能性多能性，通过降低其谱系启动相关基因的表达水平，并消除不同独立hPSC系间在定向分化过程中常见的品系间差异。本文提供了LIF-3i逆转所得N-hPSC的代表性鉴定结果，以及对同源遗传背景的hPSC在谱系启动状态下的功能性比较实验策略 对比. 类幼稚状态被概述。
引言
2i（MEK/ERK 和 GSK3β 抑制剂）培养体系最初被开发用于将异质性的血清依赖型小鼠胚胎干细胞（mESC）培养体系优化为一种类似于小鼠着床前上胚层的均一多能性基础状态1。然而，2i 无法支持人类多能干细胞（hPSC）系的稳定维持2。近年来已有多种复杂的化学小分子、添加生长因子以及转基因方法被报道，可用于捕获假定的类似人类原始态样多能性分子状态2。然而，这些方法所建立的许多"原始态样"状态也表现出核型不稳定、表观基因组异常（例如，亲本基因组印记的全局性丢失）或分化潜能受损等问题。
相比之下，GSK3β、ERK和tankyrase信号通路的三重化学抑制剂混合物联合白血病抑制因子（LIF-3i）足以实现多种常规hPSC细胞系稳定类 naive 状态的逆转3LIF-3i逆转的 naive hPSC（N-hPSC）维持了正常的核型，并增强了naive特异性人类着床前上胚层基因的表达水平（例如，NANOG, KLF2, NR5A2、DNMT3L、HERVH、Stella（DPPA3）, KLF17....
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方案
所有动物实验均遵循动物护理指南，并经约翰斯·霍普金斯医学院动物护理与使用委员会（IACUC）批准的方案进行。
1. 用于饲养层依赖型常规（hESC 培养基/MEF）或原始态逆转（LIF-3i 培养基/MEF）人多能干细胞培养的小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）的制备
- 根据已发表的方案4，购买或自行制备来自CF1或CF1 × DR4杂交小鼠E13.5胚胎的低代次MEF饲养层细胞。
- 将低代次（p1-p2）MEF细胞在照射前（用于长期保存）或照射后（可保存长达6个月）进行冻存，并按照先前描述的方法储存在液氮中4。
- 使用γ射线或X射线照射器对低于p5代的大量扩增MEF细胞进行照射（5,000 rad），并分装为每管1.5 × 106个细胞，短期储存（少于6个月）于-80 °C超低温冰箱中。
- 为制备饲养层培养物，每块6孔明胶包被板接种1.2 × 106（新鲜照射未冻存）至1.5 × 106（照射后冻存）个MEF细胞，具体操作如下所述。
- 在生物安全柜中，向每个孔加入1.5 mL无菌0.1%明胶溶液，制备明胶包被的6孔无菌组织培养板。
- 将包被好的....
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结果
本方案通过LIF-3i在依赖饲养层和非依赖饲养层的已启动谱系常规hPSC培养体系中均实现了高效的类似原始态逆转（图1）。本文所述的详细方案概述了从依赖饲养层或无饲养层的常规hPSC培养条件（例如 E8培养基）开始，逐步适应LIF-3i的连续操作步骤。
LIF-3i 逆转多种常规 hESC 和无外源基因 hiPSC 细胞系的代表性结果如图1–3所示。这些典型结果可通过商业化的 hESC 细胞系 H9，或由 Zambidis 实验室建立的商业化无外源基因、脐带血来源的附加体型 hiPSC 细胞系（6.2）进行验证8,9。引入初始的 LIF-5i 适应步骤，可实现常规 hPSC 培养物在 LIF-3.......
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讨论
LIF-3i 系统将经典的小鼠 2i 初始态重编程鸡尾酒配方1进行改良后应用于人类多能干细胞。通过在该配方中添加端锚聚合酶（tankyrase）抑制剂 XAV939，可在 LIF-2i 条件下稳定 hPSC 的自我更新能力（hPSC 无法仅在 2i 条件下扩增）。LIF-3i 培养体系可实现常规 hPSC 高效、大规模地重编程为类似于人类着床前上胚层的多能状态3。尽管 XAV939 在 hPSC 中的作用机制可能较为复杂，并与 2i 存在协同效应，但至少包括通过 WNT 信号通路对 hPSC 自我更新能力的重要稳定和增强作用3。
传统的hPSC培养通常处于多种多样的多能性状态，表现出高度可变的谱系启动基因表达以及着床后上胚层样的表观遗传标记，这可能导致功能多能性的不一致或减弱2.......
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披露
根据Life Technologies与约翰斯·霍普金斯大学（JHU）之间的许可协议，Zambidis博士有权分享该大学因干细胞许可而获得的部分特许权使用费。此安排的条款由JHU根据其利益冲突政策进行管理。这并不影响作者遵守期刊关于共享数据和材料的政策。
致谢
本工作获得了以下机构的资助：美国国立卫生研究院/国立眼科研究所（NIH/NEI，项目号R01EY023962）、美国国立卫生研究院/国立儿童健康与人类发展研究所（NIH/NICHD，项目号R01HD082098）、研究视力保护基金会（RPB）Stein创新奖、马里兰干细胞研究基金（项目号2018-MSCRFV-4048、2014-MSCRFE-0742）、诺和诺德科学论坛奖以及Moseley基金会。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 抗 SSEA-1/CD15 抗体，APC 标记 | BD Biosciences | 561716 | 每项实验使用 5µL（FACS） |
| 抗 TFCP2L1 抗体 | Sigma Aldrich | HPA029708 | 使用 1:100 稀释度（免疫染色） |
| 抗 beta-肌动蛋白抗体 | Abcam | ab6276 | 使用 1:5000 稀释度（Western blot） |
| 抗 CD146 抗体， PE 标记 | BD Biosciences | 550315 | 每项实验使用 5µL（FACS） |
| 抗 CD31 抗体，APC 标记 | eBioscience | 17-0319-42 | 每项实验使用 2µL（FACS） |
| 抗 CD31 微珠试剂盒 | Miltenyi Biotec | 130-091-935 | |
| 抗 NANOG 抗体 | Abcam | ab109250 | 使用 1:100 稀释度（免疫染色） |
| 抗 NR5A2 抗体 | Sigma Aldrich | HPA005455 | 使用 1:100 稀释度（免疫染色） |
| 抗 p44/42 MAPK（Erk1/2）抗体 | Cell Signaling | 4695 | 使用 1:1000 稀释度（Western blot），用于总蛋白检测 |
| 抗 磷酸化-p44/42 MAPK（Erk1/2）（Thr202/Tyr204）抗体 | Cell Signaling | 4370 | 使用 1:1000 稀释度（Western blot） |
| 抗 磷酸化-STAT3（Tyr705）抗体 | Cell Signaling | 9145 | 使用 1:1000 稀释度（Western blot） |
| 抗兔免疫球蛋白抗体，生物素标记 | Agilent | E0432 | 使用 1:500–1:1000 稀释度（免疫染色） |
| 抗 SSEA-4 抗体，APC 标记 | R&D System | FAB1435A | 每项实验使用 5µL（FACS） |
| 抗 SSEA-4 GloLIVE 抗体，NL493 标记 | R&D System | NLLC1435G | 使用 1:50 稀释度（活细胞及固定细胞免疫染色） |
| 抗 STAT3 抗体 | Cell Signaling | 9139 | 使用 1:1000 稀释度（Western blot），用于总蛋白检测 |
| 抗 STELLA/DPPA3 抗体 | Millipore | MAB4388 | 使用 1:50 稀释度（免疫染色） |
| 抗 TRA-1-60 GloLIVE 抗体，NL557 标记 | R&D System | NLLC4770R | 使用 1:50 稀释度（活细胞及固定细胞免疫染色） |
| 抗 TRA-1-60 StainAlive 抗体，DyLight 488 标记 | Stemgent | 09-0068 | 使用 1:100 稀释度（活细胞及固定细胞免疫染色） |
| 抗 TRA-1-81 StainAlive 抗体，DyLight 488 标记 | Stemgent | 09-0069 | 使用 1:100 稀释度（活细胞及固定细胞免疫染色） |
| 抗 TRA1-60 抗体，PE 标记 | BD Biosciences | 560193 | 每项实验使用 10µL（FACS） |
| 抗 TRA1-81 抗体，PE 标记 | BD Biosciences | 560161 | 每项实验使用 10µL（FACS） |
| APEL2-Li | StemCell Technologies | 5271 | |
| 牛血清白蛋白 | Sigma Aldrich | A3311 | |
| CellAdhere 稀释缓冲液 | StemCell Technologies | 7183 | 用于 Vitronectin XF™ 基质的稀释 |
| CF1 小鼠 | Charles River | 023 | |
| CHIR99021 | R&D System | L5283 | 用 DMSO 重悬至 100 mM |
| 共聚焦显微镜系统 | Zeiss | LSM 510 | |
| 脐带血 CD34+ 来源的 iPSC 细胞系 | Thermo Fisher Scientific | A18945 | 也称为 6.2 细胞系 |
| Corning Costar 组织培养处理 6 孔板 | Corning | 3506 | |
| Countess 细胞计数板 | Thermo Fisher Scientific | C10228 | |
| Countess 自动细胞计数仪 | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | |
| DMEM（Dulbecco 改良 Eagle 培养基） | Thermo Fisher Scientific | 11995-065 | |
| DMEM-F12 | Thermo Fisher Scientific | 11330-032 | |
| DMSO（二甲基亚砜） | Sigma Aldrich | D2650 | |
| DR4 小鼠 | The Jackson Laboratory | 3208 | |
| Essential 8（E8）培养基 | StemCell Technologies | 5940 | |
| 胎牛血清（FBS） | Thermo Fisher Scientific | SH30071.03 | |
| 佛司可林 | Stemgent | 04-0025 | 用 DMSO 重悬至 100 mM |
| 明胶（猪源） | Sigma Aldrich | G1890-100G | 溶于水后高压灭菌 |
| KnockOut 血清替代物 | Thermo Fisher Scientific | 10828-028 | |
| L-谷氨酰胺（100X） | Thermo Fisher Scientific | 25030-081 | |
| MEM 非必需氨基酸（MEM NEAA）（100X） | Thermo Fisher Scientific | 11140-050 | |
| mTeSR1 培养基 | StemCell Technologies | 85850 | |
| Nalgene 冻存管 | Thermo Fisher Scientific | 5000-0020 | |
| Nunc Lab-Tek II 培养腔室载玻片系统 | Fisher Scientific | 154534 | |
| 4% 多聚甲醛（PFA）溶液，PBS 配制 | USB Corporation | 19943 | |
| PD0325901 | Sigma Aldrich | PZ0162 | 用 DMSO 重悬至 100 mM |
| 青霉素/链霉素（10,000 U/mL） | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | Biological Industries | 02-023-1A | |
| 嘌morphamine | Stemgent | 04-0009 | 用 DMSO 重悬至 10 mM |
| 重组人 Activin A | Peprotech | AF-120-14E | |
| 重组人骨形态发生蛋白（BMP）-4 | Peprotech | 120-05ET | 用含 0.1% 牛血清白蛋白的 PBS 重悬至 100 µg/mL |
| 重组人碱性成纤维细胞生长因子（bFGF） | Peprotech | 100-18B | 用含 0.1% 牛血清白蛋白的 PBS 重悬至 100 µg/mL |
| 重组人白血病抑制因子（LIF） | Peprotech | 300-05 | 用含 0.1% 牛血清白蛋白的 PBS 重悬至 100 µg/mL |
| SB431542 | Stemgent | 04-0010-05 | 用 DMSO 重悬至 100 mM |
| Stemolecule Y27632 溶液 | Stemgent | 04-0012-02 | ROCK 抑制剂溶液（10 mM） |
| StemPro Accutase 细胞解离试剂 | Thermo Fisher Scientific | A11105-01 | |
| 链霉亲和素-Cy3 偶联物 | Sigma Aldrich | S6402 | 使用 1:500–1:1000 稀释度（免疫染色） |
| Thermo Scientific Mr. Frosty 冻存盒 | Thermo Fisher Scientific | 5100-0001 | |
| 血管内皮生长因子（VEGF）-165 | Peprotech | 100-21 | 用含 0.1% 牛血清白蛋白的 PBS 重悬至 100 µg/mL |
| Vitronectin XF 基质 | StemCell Technologies | 7180 | 用 CellAdhereµL/mL 稀释缓冲液稀释至 40™ |
| XAV939 | Sigma Aldrich | X3004 | 用 DMSO 重悬至 100 mM |
| β-巯基乙醇 | Thermo Fisher Scientific | 21985-023 | 避光保存 |
参考文献
- Ying, Q. L., et al. The ground state of embryonic stem cell self-renewal. Nature. 453 (7194), 519-523 (2008).
- Zimmerlin, L., Park, T. S., Zambidis, E. T. Capturing Human Naive Pluripotency in the Embryo and in the Dish. Stem Cells Dev. 26 (16), 1141-1161 (2017).
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