我们介绍了一种使用定制牵张器建立的小鼠胫骨牵张成骨模型。以小鼠作为分析对象有利于推动相关研究的进展。
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本文内容
摘要
摘要
牵张成骨（DO）是一种不需细胞移植的骨骼组织再生外科手术。DO模型包括以下三个阶段：截骨并安装外置牵张器后的潜伏期；牵张期，即逐渐且持续地分离断开的骨端；以及骨愈合期。本研究所用的定制牵张器由两个不完整的丙烯酸树脂环和一个扩张螺钉组成。首先使用硅橡胶印模材料制作模具，随后制备定制牵张器。将牙科树脂注入由硅橡胶印模材料制成的模具中，使其聚合，形成定制牵张器所需的不完整树脂环。然后使用透明树脂将这些环与扩张螺钉固定。通过该方法制作的定制牵张器被安装在小鼠胫骨上。使用近端一对25 G针头、远端一对27 G针头以及丙烯酸树脂将胫骨固定于装置上。经过5天的潜伏期后，以0.2 mm/12 h的速度开始牵张。牵张持续8天，最终形成3.2 mm的总间隙。牵张结束后4周处死小鼠。通过放射影像学和组织学检查确认牵张间隙中的骨形成情况。
引言
牵张成骨术（DO）是一种治疗多种骨骼疾病（如肢体长度差异、骨缺损和肢体畸形）的成熟治疗方法1。这种独特的治疗策略基于Ilizarov提出的"张力-应力原则"。该方法需要数天的潜伏期、数周的主动牵张期，以及数月的巩固期，直至成熟骨组织形成2。
由于血流阻塞3,4 和机械刺激5,6 所导致的局部缺氧环境在牵张成骨（DO）的愈合过程中尤为重要。缺氧诱导的血管生成可通过血流将氧气、营养物质、可溶性因子和细胞输送到局部，以支持组织修复。牵张操作产生的机械刺激可引发一系列生物学反应，如间充质干细胞的分化、骨形成、钙化及骨重建。系列化的 DO 治疗不仅可促进硬组织形成，还可同步生成神经、肌肉、血管和皮肤等软组织，且无需进行干细胞移植。因此，DO 模型被认为是一种分析多种组织再生过程的优良模型。
兔子和狗是骨延长（DO）基础研究中最常用的动物，但针对这些动物的分析工具较少。使用小鼠DO模型有助于进行更详细的分析，尤其适用于使用基因敲除小鼠的实验。然而，在使用小鼠作为实验动物时，需要制作延长装置。本文介绍了一种利用自制牵张器建立的小鼠胫骨DO模型，该牵张器采用牙科实验室工具和技术制作，并已在先前的研究中使用。
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方案
所有实验均按照本机构动物护理和使用委员会批准的方案进行。在操作前对所有器械进行灭菌处理。
1. 制作个性化牵开器模具的准备
- 使用埃文斯蜡雕刻刀，用一张石蜡（145 mm × 74 mm）制作两个不完整的环形结构（外径 20 mm，内径 10 mm），这些结构是牵张器的一部分。
- 制作4个相同的部件。使用经气体燃烧器加热的蜡调刀，将四个环叠放在一起，使其总厚度达到5 mm。使用埃文斯蜡雕刻刀为扩张螺钉和针分别预留8 mm × 2 mm和5 mm × 2 mm的空间（图1A、1B）。
- 将蜡型嵌入硅橡胶印模材料中，并为树脂环制作模具（图1C）。
- 在硅橡胶印模材料固化后（室温下约5分钟），取出蜡型。
2. 自制牵开器的制备
- 将凡士林均匀薄层涂抹于硅胶模具内。取3 g聚合牙科树脂混合均匀后立即倒入硅胶模具中，在室温（RT）下静置5分钟。
- 将聚合后的树脂环从模具中取出，使用碳化钨车针和牙科微型电机进行抛光，去除毛边（约1分钟）。每个定制牵张器需要两个树脂环。
- 重复上述步骤，制备所需数量的树脂环（图1D）。
- 用实用蜡固定树脂环时预留约2 mm的间隙，并用透明树脂完全包埋扩张螺钉的外部。在室温（RT）下固化树脂5分钟。聚合完成后，取下扩张螺钉旋钮（图1E）。
3. 手术方案
- 使用8周龄的雄性小鼠。
- 通过腹腔注射盐酸美托咪啶（0.3 mg/kg）、咪达唑仑（4 mg/kg）和酒石酸布托啡诺（5 mg/kg）诱导麻醉。
- 仔细剃除并用10%碘溶液消毒手术区域，然后在右后肢注射0.5%盐酸利多卡因。
- 使用15号手术刀在右后肢下段做一纵向皮肤切口（长约15 mm）。钝性分离皮下肌肉组织，注意不要完全去除骨膜。从外侧进路以方便接触腓骨，用剪刀切断腓骨。
- 用窄而细的无菌镊子夹住踝关节，使用无菌27 G针头在距足跟约5 mm处钻孔。针头应依次穿透皮肤、骨组织和对侧皮肤。当针头穿透后，用剪钳剪去针尖和针根部分，使残留针体长度约为15 mm。
- 以相同方式在近端约2–3 mm处制作第二个孔。固定踝部周围，以相同方式在膝关节下方穿入两根25 G针头。针头穿透后，用剪钳剪去针尖和针根（图1F）。
- 将定制的牵张器放置于与伸展方向平行的位置。用足够的聚合牙科树脂固定针头与装置，确保树脂填满装置的沟槽。等待树脂聚合完成（约5分钟）（图1G）。
- 操作时注意避免损伤周围组织。使用极薄的切割片在胫骨骨干中段进行截骨，同时滴加生理盐水（1–2 mL）冷却。
- 用4-0尼龙缝线关闭切口。
- 术后立即皮下注射布雷诺啡（0.1 mg/kg）以镇痛。术后7天内每12小时重复给药一次，之后根据需要继续使用。
4. 分散注意力实验方案
注意：关于潜伏期和分心率已有多种报道，但此处展示的是代表性方案。
- 经过5天的潜伏期后，以每天0.2 mm/12 h的速度开始牵张。进行延长时，使用连接在快速扩展螺钉上的销钉。将销钉沿附着于延长螺钉的黄色箭头方向移动（图1E）。
- 延长过程中无需麻醉。用小指和手掌固定尾部，并用食指和拇指固定延长装置。
- 进行一次延长操作（1/4圈对应0.2 mm）。持续延长8天，最终将形成总计3.2 mm的骨缺损间隙。
5. 分析
- 放射学分析：延长过程完成后，在2.0%异氟烷全身麻醉下，通过计算机断层扫描评估骨再生情况。
注意：若在安装延长装置时已注意其位置，则即使装置仍附着，也可通过普通放射摄影进行评估。 - 组织学分析：小心移除装置，避免在取样过程中导致骨折牵开部位受损。将样本置于10%中性缓冲福尔马林中，室温固定24小时。在4 °C条件下，使用Morse溶液（10%柠檬酸钠，20%甲酸）脱钙过夜。
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结果
图1A 和 1B 呈现不完整的环形（外径 20 mm；内径 10 mm；厚度 5 mm），以石蜡制作蜡模。将两个蜡模包埋于硅橡胶印模材料中，制备用于树脂环的铸型（图1C)形成。将聚合树脂立即倒入该模具中，得到树脂环（图1D）。通过组合两个树脂环和一个扩弓螺钉，制作了一个定制的牵张器（图1E). 图2A 展示了牵张成骨模型在牵张后4周的典型X线影像学表现。在牵张区域可见新形成的骨组织。 图2B 显示苏木精-伊红染...
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讨论
当使用大型动物作为实验模型时，可以采用现成的延长装置，易于实现良好的固定，并对延长操作本身及延长量进行评估。然而，当使用小鼠作为实验模型时，则需要自行开发部分或全部设备。Isefuku et al. 和 Tay et al. 制作了专用装置并建立了小鼠模型7,8。Carvahjo et al. 采用了一种利用结扎丝将现成的扩张装置（牵引牵开器：KLS Martin）进行固定的方案9。我们也可以利用现有的延长装置产品，并通过设计新的固定方法，建立小鼠牵张成骨（DO）模型。该方法有利于延长装置的制备、延长操作的实施以及延长量的评估。此外，预期可使用同一装置构建胫骨节段性缺损模型。同时，缺损长度可按0.2 mm的步长进行调节，因此该装置具有较高的通用性。
在此类实验中，将针穿过胫骨在技术上较为困难。尤其是胫骨远端的直径较小，穿入两根针需要一定的训练。如果发现骨量不足，则必...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢加藤真喜子女士为完成本研究提供的鼓励。我们还感谢名古屋大学医学研究生院实验动物与医学研究工程部为小鼠提供的饲养条件。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 石蜡 | YAMAHACHI DENTAL MFG. CO. | - | 用于制备树脂环模具 |
| 实验室印模膏 | GC Corporation | - | 用于制备树脂环模具 |
| 实用型蜡 | GC Corporation | - | 用于制备树脂环模具 |
| 扩张螺钉 | Ortho Dentaurum | 600-301-30 | 自制牵张器的组件 |
| Unifast III | GC Corporation | - | 快速聚合树脂 自制牵张器的组件 |
| Ortho Crystal | NISSIN | - | 透明树脂 自制牵张器的组件 |
| 25 G 针头 | TERUMO | NN-2516R | 用于自制牵张器 |
| 27 G 针头 | TERUMO | NN-2719S | 用于自制牵张器 |
| ICR 小鼠 | Chubu Kagaku Shizai Corporation | - | 实验动物 |
| Somnopentyl | Kyoritsu Seiyaku | - | 戊巴比妥钠盐 |
| 异氟烷 | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 099-06571 | 异氟烷吸入溶液 |
参考文献
- Watson, J. T. Distraction osteogenesis. The Journal of the American Academy of Orthopaedic Surgeons. 14, 168-174 (2006).
- Ilizarov, G. A. The tension-stress effect on the genesis and growth of tissues: Part II. The influence of the rate and frequency of distraction. Clinical Orthopaedics and Related Research. 239, 263-285 (1989).
- Wan, C., et al. Activation of the hypoxia-inducible factor-1 alpha pathway accelerates bone regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (2), 686-691 (2008).
- Fujio, M., et al. Stromal cell-derived factor-1 enhances distraction osteogenesis-mediated skeletal tissue regeneration through the recruitment of endothelial precursors. Bone. 49 (4), 693-700 (2011).
- Tong, L., et al. Focal adhesion kinase expression during mandibular distraction osteogenesis: evidence for mechanotransduction. Plastic and reconstructive surgery. 111 (1), 211-222 (2003).
- Rhee, S. T., El-Bassiony, L., Buchman, S. R. Extracellular signal- related kinase and bone morphogenetic protein expression during distraction osteogenesis of the mandible: in vivo evidence of mechanotransduction mechanism for differentiation and osteogenesis by mesenchymal precursor cells. Plastic and reconstructive surgery. 117 (7), 2243-2249 (2006).
- Isefuku, S., Joyner, C. J., Simpson, A. H. A murine model of distraction osteogenesis. Bone. 27 (5), 661-665 (2000).
- Tay, B. K., Le, A. X., Gould, S. E., Helms, J. A. Histochemical and molecular analyses of distraction osteogenesis in a mouse model. Journal of Orthopaedic Research. 16 (5), 636-642 (1998).
- Carvalho, R. S., et al. The role of angiogenesis in a murine tibial model of distraction osteogenesis. Bone. 34 (5), 849-861 (2004).
- Osawa, Y., et al. Activated FGFR3 promotes bone formation via accelerating endochondral ossification in mouse model of distraction osteogenesis. Bone. 105, 42-49 (2017).
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重印与许可
