胰岛组织石蜡切片包埋

摘要

离体胰岛研究对糖尿病研究具有重要意义。目前用于研究在天然三维结构中培养的胰岛的技术耗时长、效率低，且很少被使用。本研究介绍了一种简单、高效的新方法，可用于制备高质量的全培养胰岛石蜡切片。

摘要

使用分离的胰岛进行实验对糖尿病研究至关重要，但胰岛来源昂贵且数量有限。胰岛由多种细胞类型组成，具有特定的空间结构，这种结构影响其功能，而人胰岛在细胞类型组成上存在广泛异质性。目前常用的研究培养胰岛的方法包括对完整胰岛进行分子生物学研究，将不同胰岛细胞类型混合作为整体分析；或对分散的胰岛细胞进行显微成像或分子研究，但此类方法会破坏胰岛原有的空间结构。对于 体内 胰岛研究中，石蜡包埋胰腺切片是一种强大的技术，可在天然胰腺环境中评估细胞特异性结果。通过石蜡切片研究培养后的胰岛具有多项优势：可在同一胰岛（甚至可能为完全相同的胰岛，利用连续切片）上检测多种结果、实现细胞类型特异性测量，并在实验处理及后续分析过程中维持胰岛细胞间的天然相互作用以及细胞与基质的相互作用。然而，目前针对培养后分离胰岛的石蜡包埋技术存在效率低下、耗时长、材料易丢失等问题，且通常所得切片中胰岛数量不足，难以用于结果的定量分析。临床病理实验室的细胞块制备设施对基础研究实验室而言难以获取且不实用。我们开发了一种改进的、简化的台面操作方法，可获得胰岛产量高且分布均匀的切片。具体方法为：将固定后的胰岛重悬于温热的组织学级琼脂糖凝胶中，并移液至标准载玻片上形成扁平圆盘状结构，使胰岛分布于同一平面。经过标准脱水与包埋程序后，可从同一胰岛包埋块中连续切出多张（10张以上）4–5 µm厚的切片。利用该方法进行组织学分析 可对小鼠、大鼠和人胰岛进行免疫荧光分析。这是一种有效、经济且节省时间的方法，用于评估培养胰岛中特定细胞类型及完整结构的结局。

引言

胰岛（朗格汉斯岛）是循环胰岛素的唯一来源，对于研究糖尿病的研究人员而言是一种关键组织。来自同一生物体的胰岛在大小、细胞类型频率和结构上均存在差异。^1,2,3传统的研究策略 体内 胰岛的结构和内分泌细胞组成通过胰腺组织切片进行观察^4,5由于胰岛仅占胰腺总细胞含量的一小部分，分子学研究需在分离的胰岛上进行。 离体 测试胰岛对营养物质的反应、基因调控（转染、转导）或实验性处理的培养实验，为揭示调控内分泌细胞存活、增殖和功能的机制提供了重要见解^5,6.

离体（ex vivo）胰岛实验通常通过分析完整胰岛的分子特征，或对单层培养的分散胰岛细胞进行组织学或分子学研究来完成^5,6。对完整胰岛进行分子分析存在严重缺陷，即不同类型细胞的混杂，这在推断至特定细胞类型时可能导致假阴性或假阳性结果。将细胞分散接种于盖玻片上进行培养后显微观察，可实现细胞类型特异性的结果检测，但会破坏胰岛的天然结构，可能改变细胞对干预措施的反应，并无法评估与结构相关的结果。此外，通常只能检测单一指标；例如，若需在相同条件下同时检测β细胞增殖与β细胞死亡，则必须开展两个独立实验。这些方法也无法反映胰岛间的异质性，而这一问题在当前研究领域正受到越来越多的关注。通过流式细胞术对胰岛细胞进行分选，以开展细胞类型特异性的分子研究或单细胞RNA测序，虽技术精巧，但成本高昂、耗时较长，受限于组织样本量，且破坏胰岛结构，不适用于常规的细胞培养分析^5,7。对整体免疫染色胰岛进行共聚焦成像可提供高质量的、保留完整结构的数据，但该方法劳动强度大，且每个样本所能获取的数据仅限于单次免疫染色所能识别的指标⁸。

获得高质量的培养后全胰岛石蜡切片的能力将解决上述诸多问题。来自独特遗传模型或人类器官捐献者的高成本、稀有胰岛组织，或培养后的胰岛状态 体内 或 体外 实验操作非常宝贵。从同一胰岛获取多个石蜡切片，可实现对同一次实验样本中多种细胞类型特异性及完整结构的分析。

现有的胰岛球体制备技术在切片过程中存在不足。组织学优化的琼脂糖是一种水溶性低熔点凝胶，广泛用于组织学和细胞学样本的处理，尤其适用于难以处理的小块或碎片化组织样本⁹。一种胰岛包埋方法是将胰岛悬浮于微量离心管中的琼脂糖溶液内，通过离心形成沉淀，取出凝固的琼脂块，再进行后续处理和包埋以供切片^10,11。然而，从管底提取凝固样本费时且困难，容易导致样本断裂，并存在造成操作者人身伤害的风险。胰岛主要集中于琼脂块的尖端，导致由此方法获得的切片中胰岛分布不均。此外，琼脂块底部呈圆形，使包埋过程复杂化，可能导致切片时暴露的是胰岛稀少的区域。总体而言，该方法导致最终切片中胰岛得率低且分布成团。

这种新方法简化并改进了胰岛切片的制备流程。将胰岛浓缩于较小体积中，随后置于载玻片的光滑表面形成一个小圆盘，使胰岛处于单一平面上。该组织胶-胰岛圆盘随后采用缩短的脱水和二甲苯浸润程序进行石蜡包埋。作为对照，也同时进行了先前的方法，即在微量离心管底部浓缩胰岛。这种新技术提高了每张切片中胰岛的得率、各切片内胰岛的分布均匀性，并且将胰岛组织块转移至包埋盒所需时间更短。该技术适用于胰岛生物学研究者或其他研究小块组织的科研人员，有助于在保持组织天然结构的前提下，对低丰度组织样本进行多重指标检测，从而最大化利用有限的组织资源。

方案

所有涉及动物的实验程序均经马萨诸塞大学医学院机构动物护理和使用委员会批准。根据马萨诸塞大学机构审查委员会的判定，人胰岛研究不属于需进行IRB审查或豁免的范畴，因其不涉及人类受试者的使用。

1. 胰岛的分离与培养

1. 采用您选择的方法分离胰岛，并去除污染的外分泌组织和导管组织。
   注意：本方法经胶原酶导管灌注法结合Ficoll分离法（啮齿类动物）或来自整合胰岛分配计划（IIDP¹³；人源）运输后的胰岛优化建立¹²。胰岛使用P200移液器手工挑选。
2. 为优化胰岛形态，将胰岛置于10 mL完全胰岛培养基（含10%胎牛血清、青霉素/链霉素和5.5 mmol/L葡萄糖的RPMI培养基）中，在37 °C、含5% CO₂的湿化培养箱中过夜恢复。尽管此步骤并非获得切片所必需，但经过恢复期后胰岛结构更为完整（见图2）。

2. 胰岛固定

1. 使用低吸附性 P200 吸头，在体视显微镜下利用校准网格手工挑选约 250 个胰岛当量（IEQ）¹³，转移至 1.5 mL 低吸附性微量离心管中。低吸附性吸头和离心管可减少胰岛损失。
2. 让胰岛自然沉降至微量离心管底部。用 P200 移液器吸头吸除大部分上清液，注意避免吸走任何胰岛。
3. 加入 1 mL PBS。将离心管放入摆桶式离心机中 ，离心至转速达到 200 × g 后停止离心。吸除上清液。重复 PBS 洗涤一次，共洗涤两次。
4. 加入 500 µL 10% 甲醛溶液或新鲜配制的 4% 多聚甲醛。室温固定 30 分钟。本方法中测试的实验结果表明，这两种固定方法效果无明显差异。更短的固定时间也可能适用；建议根据预期实验结果优化固定时间。
5. 用 P200 吸头吸除固定液。
6. 加入 1 mL PBS。将离心管离心 至转速达到 200 × g 后停止离心。吸除上清液。重复 PBS 洗涤一次，共洗涤两次。
7. 立即进入下一步操作。

3. 胰岛圆盘的制备（图1）

1. 首次使用时，融化凝胶（例如， Histogel）于70 °C下保存，并分装至1.5 mL离心管中用于长期储存。分装体积无严格要求，因为分装样品可重复使用。
2. 将含有凝胶（每份样品约 100 µL）的微量离心管置于预热至 70 °C 的金属浴中，于 70 °C 加热。
3. 将琼脂糖蓝珠（每个样品10 µL）转移至1.5 mL洁净的微量离心管中。移液前充分重悬珠子。
   注意：将蓝色珠子与胰岛混合，以帮助在琼脂糖凝胶块和石蜡块中直观识别包埋的材料。所用蓝色珠子的数量对结果无关键影响，但应避免过量使用珠子（>5倍数量的胰岛，以确保胰岛在切片中分布均匀。
4. 用1 mL PBS洗涤蓝色珠子，共洗涤两次。每次洗涤时，将珠子在800 × g下离心1分钟。第二次洗涤后，将珠子重悬于n+2) × 10 µL PBS，其中 n 是样品管的数量；例如，对于2个样品管，加入珠子中的PBS体积应为40 µL。
5. 离心含有胰岛的微量离心管（短时离心至200 × g），去除大部分上清液。用剪刀或刀片切掉10 µL移液器吸头的尖端，为每个胰岛管加入10 µL磁珠，每个样本使用新的吸头。不要混匀（以避免丢失胰岛）。
6. 离心胰岛和微珠（短暂离心至200 × g）。用未剪切的10 µL移液器吸头尽可能吸除PBS。
7. 标记显微镜载玻片以进行样本识别。每张载玻片可制备两至三个样本。将载玻片放置在靠近热块的工作台面上，并置于预热的凝胶附近。每个样本使用剃刀或剪刀切割三至五个20 µL低吸附微量移液器吸头的尖端。为两支P20移液器装上已切割的吸头，以便能够快速交替使用。
8. 使用第一支微量移液器，向含有胰岛/微珠的微量离心管中加入 15–20 µL 温热的凝胶；立即混匀，避免产生气泡；并将液体琼脂/胰岛/微珠混合物滴加到载玻片上，形成 <直径1 cm的圆片。将该圆片置于载玻片边缘附近，为外层凝胶环（下一步）预留空间。轻轻敲击载玻片数次，使胰岛和微珠沉降。
9. 使用第二个微量移液器，向样品管中加入20 µL温热的凝胶。使用第一个微量移液器将新加入的凝胶与剩余的胰岛/微珠混合，若凝胶开始凝固，则将其放回加热块中重新温育，随后将此混合物涂抹至载玻片上，包裹原始凝胶圆片。根据需要更换预先切好的吸头，重复上述操作，直至凝胶圆片达到所需大小和厚度。
   注意：若外圈略厚，则更易于操作凝胶圆盘。通常，3 × 20 µL 凝胶已足够。此步骤可减少胰岛在管壁冲洗过程中的损失，并在外周添加不含胰岛的琼脂糖，以方便圆盘操作。
10. 单独制备每个样本片，并在每张载玻片上放置多个样本片时，仔细记录样本顺序。
11. 将载玻片置于覆有盖子的湿冰平面上，静置10分钟或直至凝胶完全凝固。若载玻片干燥，则更难将凝胶圆片从玻璃上滑脱。
12. 用铅笔标记活检处理/包埋组织盒，每个样本一个。将载玻片背面晾干，以避免润湿蓝色纸张。
13. 使用刀片的钝边，轻轻推动每个圆片的边缘，使其脱离玻璃表面。当圆片可轻松滑动时，缓慢将其从载玻片推至蓝色吸水纸上。将圆片平整的一面朝下，直接放置于纸上。
14. 保持圆盘水平，将滤纸折叠包裹圆盘以防止移动，将包裹好的圆盘放入暗盒中，然后关闭暗盒。如果圆盘无法顺利从玻璃片上滑落，请添加更多凝胶和/或再将载玻片放回冰上数分钟。
15. 将包埋盒浸入盛有PBS的烧杯中。为获得最佳形态学效果，应在同一天进行石蜡包埋处理。

4. 石蜡包埋

注意：使用下述简化的脱水流程将胰岛凝胶圆片处理成石蜡包埋块。本技术采用自动组织处理机进行优化，但手工处理亦可获得类似结果。

1. 将包埋盒浸入85%乙醇中15分钟。
2. 将包埋盒浸入95%乙醇中15分钟。
3. 将包埋盒浸入100%乙醇中15分钟，重复两次，共洗涤三次。
4. 将包埋盒浸入二甲苯中15分钟，重复两次，共洗涤三次。
5. 将包埋盒浸入熔融石蜡中10分钟。
6. 将包埋盒转移至新鲜的熔融石蜡中，处理10–30分钟。
7. 小心打开包埋盒并解开蓝色纸片。取出凝胶圆片，注意保留原先与纸片相对的平坦面。将圆片包埋于小模具中，使平坦面（含胰岛面）朝下，与切面平行。对于组织塞，小心将其从包埋盒中取出，并包埋于小模具中，使尖端朝向切面。

5. 石蜡切片与染色

1. 若需要连续切片，请按顺序标记载玻片。
2. 由经验丰富的组织技术员切割5 µm厚的石蜡切片。为最大化获得组织材料，应保存所有含组织的切片。通常收集20张切片即可涵盖大部分组织材料。
3. 将切片在室温下保存。切片适用于常规组织学染色（例如，H&E）和免疫荧光染色（例如，胰岛素、胰高血糖素和DAPI）。如有必要，可针对其他抗原优化固定条件。

结果

制备凝胶圆片步骤的示意图如图1所示。该凝胶圆片方法可获得含有足够数量胰岛的石蜡切片，这些胰岛分布于单一平面上，便于对结果进行有意义的定量分析。图2展示了所得切片的低倍镜图像，以说明每张切片捕获的胰岛数量。通常情况下，当实验使用250个胰岛当量（IEQ）时，每张切片中可见>35个胰岛，并且从每个样本中可获得>10张含胰岛的切片（厚度为4–5 µm）。增加实验中使用的胰岛数量可提高切片中的胰岛数目。切片中的胰岛在结构上具有多样性，大小不一，这支持了使用切片技术而非忽略胰岛间差异的技术可能获得新颖且有价值数据的观点。该方法对实验室分离的啮齿类动物胰岛（大鼠、小鼠）以及通过IIDP运输后收到的人胰岛均同样有效。啮齿类动物胰岛在胰岛培养基中过夜恢复后形态更为完整，表面光滑呈圆形，结构致密呈球形（图2A）。人胰岛在到达当天包埋或运输后过夜恢复再包埋时形态相似，可...

讨论

这种改良的基于凝胶圆盘的包埋方法提供了一种简单、经济且高效的方式，可每切片获得较高产量的胰岛。在平坦的玻璃表面构建凝胶圆盘，有助于将胰岛均匀地分布在明确界定的区域内。将胰岛铺展成扁平圆盘状，有利于使大量胰岛位于切面平面内，从而提高产出率，并减少所需使用的胰岛数量。圆盘厚度可根据研究者的需要进行调整。由于可获得多个切片，因此可对同一胰岛进行连续切片分析，增加在同一实验样本上可测量的不同指标数量。尽管本方法在此针对胰腺胰岛进行了优化，但该技术也可适用于其他稀有材料，包括体积微小、质地易碎或黏稠、常规方法难以处理的样本。该方法针对新鲜固定后的胰岛进行了优化，尚未测试用于其他类型材料（如先前冷冻的胰岛）。这些切片也可用于 原位 用于检测 DNA 或 RNA 的杂交实验。额外添加凝胶有两个目的：一是最大化胰岛的收集量，二是保护富含胰岛的凝胶圆盘中心在操作和转移过程中不被破坏。这种薄凝胶圆盘可快速凝固，从而缩短脱水和二甲苯浸透步骤，便于石蜡包埋。将圆盘直接形成于平整表面，而非次级容器（如微量离心管或培养板孔）中，可更方便地将圆盘整体转移至包埋盒中进行后续处理。与圆盘法相比，微量离心管法获得的胰岛产量较低，且胰岛分布呈聚集状态；尽管...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1.5 mL Eppendorf 管	Norgen Bioteck Corp	P/N 10113
Ranin Classic 初学者套装	ShopRanin	17008708
Ranin ClassicPipette PR-2	ShopRanin	17008648
低吸附吸头（1000 μL）	Genesee Scientific	24-430
低吸附吸头（200 μL）	Genesee Scientific	24-412
低吸附吸头（20 μL）	Genesee Scientific	24-404
低吸附吸头（10 μL）	Genesee Scientific	24-401
10% 甲醛溶液	Sigma	HT501128
多聚甲醛	Electron Microscopy Sciences	15710-S
加热金属块	VWR	949312
HistoGel	Thermo Scientific	HG-4000-012
蓝色琼脂糖微珠 - Affi-gel	Bio-Rad	153-7301
Dulbecco 磷酸盐缓冲液（PBS）	Life technologies	14190-144
组织处理盒	Simport	M492-10
Bio-Wraps	Leica-Surgipath	3801090
Citadel 2000 组织处理仪	Thermo-Shandon LLC
200 证明乙醇	Decon Laboratories, INC	2701
二甲苯	Fisher Chemical	X5SK-4
石蜡	McCormick Scientific	39503002
切片机	Thermo-Shandon LLC	Finesse ME+
胰岛素抗体	DAKO	A0564
胰高血糖素抗体	Sigma	G2654
含 DAPI 的 Fluoroshield	Sigma	F6057
Alexa Fluor 594 二抗	Life technologies	A11076
Alexa Fluor 488 二抗	Life technologies	A11001