胰岛组织石蜡切片包埋

摘要

离体胰岛研究对糖尿病研究具有重要意义。目前用于研究在天然三维结构中培养的胰岛的技术耗时长、效率低，且很少被使用。本研究介绍了一种简单、高效的新方法，可用于制备高质量的全培养胰岛石蜡切片。

摘要

使用分离的胰岛进行实验对糖尿病研究至关重要，但胰岛来源昂贵且数量有限。胰岛由多种细胞类型组成，具有特定的空间结构，这种结构影响其功能，而人胰岛在细胞类型组成上存在广泛异质性。目前常用的研究培养胰岛的方法包括对完整胰岛进行分子生物学研究，将不同胰岛细胞类型混合作为整体分析；或对分散的胰岛细胞进行显微成像或分子研究，但此类方法会破坏胰岛原有的空间结构。对于 体内 胰岛研究中，石蜡包埋胰腺切片是一种强大的技术，可在天然胰腺环境中评估细胞特异性结果。通过石蜡切片研究培养后的胰岛具有多项优势：可在同一胰岛（甚至可能为完全相同的胰岛，利用连续切片）上检测多种结果、实现细胞类型特异性测量，并在实验处理及后续分析过程中维持胰岛细胞间的天然相互作用以及细胞与基质的相互作用。然而，目前针对培养后分离胰岛的石蜡包埋技术存在效率低下、耗时长、材料易丢失等问题，且通常所得切片中胰岛数量不足，难以用于结果的定量分析。临床病理实验室的细胞块制备设施对基础研究实验室而言难以获取且不实用。我们开发了一种改进的、简化的台面操作方法，可获得胰岛产量高且分布均匀的切片。具体方法为：将固定后的胰岛重悬于温热的组织学级琼脂糖凝胶中，并移液至标准载玻片上形成扁平圆盘状结构，使胰岛分布于同一平面。经过标准脱水与包埋程序后，可从同一胰岛包埋块中连续切出多张（10张以上）4–5 µm厚的切片。利用该方法进行组织学分析 可对小鼠、大鼠和人胰岛进行免疫荧光分析。这是一种有效、经济且节省时间的方法，用于评估培养胰岛中特定细胞类型及完整结构的结局。

引言

胰岛（朗格汉斯岛）是循环胰岛素的唯一来源，对于研究糖尿病的研究人员而言是一种关键组织。来自同一生物体的胰岛在大小、细胞类型频率和结构上均存在差异。^1,2,3传统的研究策略 体内 胰岛的结构和内分泌细胞组成通过胰腺组织切片进行观察^4,5由于胰岛仅占胰腺总细胞含量的一小部分，分子学研究需在分离的胰岛上进行。 离体 测试胰岛对营养物质的反应、基因调控（转染、转导）或实验性处理的培养实验，为揭示调控内分泌细胞存活、增殖和功能的机制提供了重要见解^5,6.

离体（ex vivo）胰岛实验通常通过分析完整胰岛的分子特征，或对单层培养的分散胰岛细胞进行组织学或分子学研究来完成^5,6。对完整胰岛进行分子分析存在严重缺陷，即不同类型细胞的混杂，这在推断至特定细胞类型时可能导致假阴性或假阳性结果。将细胞分散接种于....

方案

所有涉及动物的实验程序均经马萨诸塞大学医学院机构动物护理和使用委员会批准。根据马萨诸塞大学机构审查委员会的判定，人胰岛研究不属于需进行IRB审查或豁免的范畴，因其不涉及人类受试者的使用。

1. 胰岛的分离与培养

1. 采用您选择的方法分离胰岛，并去除污染的外分泌组织和导管组织。
   注意：本方法经胶原酶导管灌注法结合Ficoll分离法（啮齿类动物）或来自整合胰岛分配计划（IIDP¹³；人源）运输后的胰岛优化建立¹²。胰岛使用P200移液器手工挑选。
2. 为优化胰岛形态，将胰岛置于10 mL完全胰岛培养基（含10%胎牛血清、青霉素/链霉素和5.5 mmol/L葡萄糖的RPMI培养基）中，在37 °C、含5% CO₂的湿化培养箱中过夜恢复。尽管此步骤并非获得切片所必需，但经过恢复期后胰岛结构更为完整（见图2）。

2. 胰岛固定

1. 使用低吸附性 P200 吸头，在体视显微镜下利用校准网格手工挑选约 250 个胰岛当量（IEQ）¹³，转移至 1.5 mL 低吸附性微量离心管中。低吸附性吸头和离心管可减少胰岛损失。
<....

结果

制备凝胶圆片步骤的示意图如图1所示。该凝胶圆片方法可获得含有足够数量胰岛的石蜡切片，这些胰岛分布于单一平面上，便于对结果进行有意义的定量分析。图2展示了所得切片的低倍镜图像，以说明每张切片捕获的胰岛数量。通常情况下，当实验使用250个胰岛当量（IEQ）时，每张切片中可见>35个胰岛，并且从每个样本中可获得>10张含胰岛的切片（厚度为4–5 µm）。增加实验中使用的胰岛数量可提高切片中的胰岛数目。切片中的胰岛在结构上具有多样性，大小不一，这支持了使用切片技术而非忽略胰岛间差异的技术可能获得新颖且有价值数据的观点。该方法对实验室分离的啮齿类动物胰岛（大鼠、小鼠）以及通过IIDP运输后收到的人胰岛均同样有效。啮齿类动物胰岛在胰岛培养基中过夜恢复后形态更为完整，表面光滑呈圆形，结构致密呈球形（图2A）。人胰岛在到达当天包埋或运输后过夜恢复再包埋时形态相似，可.......

讨论

这种改良的基于凝胶圆盘的包埋方法提供了一种简单、经济且高效的方式，可每切片获得较高产量的胰岛。在平坦的玻璃表面构建凝胶圆盘，有助于将胰岛均匀地分布在明确界定的区域内。将胰岛铺展成扁平圆盘状，有利于使大量胰岛位于切面平面内，从而提高产出率，并减少所需使用的胰岛数量。圆盘厚度可根据研究者的需要进行调整。由于可获得多个切片，因此可对同一胰岛进行连续切片分析，增加在同一实验样本上可测量的不同指标数量。尽管本方法在此针对胰腺胰岛进行了优化，但该技术也可适用于其他稀有材料，包括体积微小、质地易碎或黏稠、常规方法难以处理的样本。该方法针对新鲜固定后的胰岛进行了优化，尚未测试用于其他类型材料（如先前冷冻的胰岛）。这些切片也可用于 原位 用于检测 DNA 或 RNA 的杂交实验。额外添加凝胶有两个目的：一是最大化胰岛的收集量，二是保护富含胰岛的凝胶圆盘中心在操作和转移过程中不被破坏。这种薄凝胶圆盘可快速凝固，从而缩短脱水和二甲苯浸透步骤，便于石蜡包埋。将圆盘直接形成于平整表面，而非次级容器（如微量离心管或培养板孔）中，可更方便地将圆盘整体转移至包埋盒中进行后续处理。与圆盘法相比，微量离心管法获得的胰岛产量较低，且胰岛分布呈聚集状态；尽管.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1.5 mL Eppendorf 管	Norgen Bioteck Corp	P/N 10113
Ranin Classic 初学者套装	ShopRanin	17008708
Ranin ClassicPipette PR-2	ShopRanin	17008648
低吸附吸头（1000 μL）	Genesee Scientific	24-430
低吸附吸头（200 μL）	Genesee Scientific	24-412
低吸附吸头（20 μL）	Genesee Scientific	24-404
低吸附吸头（10 μL）	Genesee Scientific	24-401
10% 甲醛溶液	Sigma	HT501128
多聚甲醛	Electron Microscopy Sciences	15710-S
加热金属块	VWR	949312
HistoGel	Thermo Scientific	HG-4000-012
蓝色琼脂糖微珠 - Affi-gel	Bio-Rad	153-7301
Dulbecco 磷酸盐缓冲液（PBS）	Life technologies	14190-144
组织处理盒	Simport	M492-10
Bio-Wraps	Leica-Surgipath	3801090
Citadel 2000 组织处理仪	Thermo-Shandon LLC
200 证明乙醇	Decon Laboratories, INC	2701
二甲苯	Fisher Chemical	X5SK-4
石蜡	McCormick Scientific	39503002
切片机	Thermo-Shandon LLC	Finesse ME+
胰岛素抗体	DAKO	A0564
胰高血糖素抗体	Sigma	G2654
含 DAPI 的 Fluoroshield	Sigma	F6057
Alexa Fluor 594 二抗	Life technologies	A11076
Alexa Fluor 488 二抗	Life technologies	A11001