小鼠鼻上皮电位差测定法量化跨上皮离子转运

摘要

本文介绍了一种用于测量小鼠鼻电位差的实验方案。该检测方法可定量分析跨膜离子转运蛋白（如囊性纤维化跨膜传导调节因子和上皮钠离子通道）的功能，对于评估囊性纤维化新型疗法的有效性具有重要价值。

摘要

鼻电位差检测已用于辅助诊断囊性纤维化（CF）近三十年。该检测在临床表现较轻、寡症状或单症状型CF（通常在较晚年龄确诊）以及CF相关疾病（如先天性双侧输精管缺如、特发性慢性胰腺炎、变应性支气管肺曲霉病和支气管扩张）的诊断中具有重要价值。在临床和临床前研究中，该检测还被用作生物标志物，以量化CF靶向治疗策略的疗效反应。将该检测技术应用于小鼠具有挑战性，可能伴随一定的死亡率。本文描述了维持鼻导管所需的最佳麻醉深度 原位 用于持续灌注。文中列出了避免鼻腔灌注溶液发生支气管误吸的措施，并描述了实验结束后的动物护理，包括给予麻醉药物的复合解毒剂，从而迅速逆转麻醉状态，使动物完全恢复。来自囊性纤维化（CF）小鼠和野生型小鼠的代表性数据表明，该检测方法能够有效区分CF与非CF小鼠。综上所述，本方案可对自由呼吸小鼠的跨上皮氯离子和钠离子转运功能状态进行可靠测量，允许在同一动物上进行多次检测，并降低与检测相关的死亡率。

引言

近三十年来，人们一直通过测量电势差（PD）来评估鼻黏膜上表达的跨膜离子转运体的功能状态，以代表远端气道的情况¹。作为一种多步骤动态检测方法^2,3，鼻电势差（nasal PD）可对定位于上皮细胞顶膜、并在气道表面液化中发挥关键作用的囊性纤维化跨膜传导调节因子（CFTR）和上皮钠通道（ENaC）的功能进行解析。鼻PD检测最主要的临床应用是辅助诊断囊性纤维化（CF），后者是高加索人群中最常见的致死性遗传病，在欧洲国家的平均发病率约为每2,500名活产婴儿中1例。该检测长期以来在诊断迟发性的、症状轻微或单一症状型的CF方面具有重要价值，同时也用于诊断与CF相关的疾病，如先天性双侧输精管缺如、特发性慢性胰腺炎、变应性支气管肺曲菌病以及支气管扩张症⁴。近年来，在对CFTR基本缺陷的治疗性调节进行临床计量学评估时^{5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16}，鼻PD已被广泛应用于新型CF疗法的临床试验中。在临床前研究中，该技术已成功应用于小鼠模型¹⁷，以评估针对CF新靶点疗法的生物活性^18,19,20,21。由于啮齿类动物与人类在鼻部解剖结构大小上的物种差异，以及感觉输入在啮齿类动物鼻面部区域中的重要作用，该技术在小鼠中的操作较为精细，需要经过专门培训的技术人员以及专用的设备和耗材。

囊性纤维化是一种外分泌腺的多系统性疾病，其临床表现以慢性呼吸系统疾病为主。该病由编码环磷酸腺苷（cAMP）调节的CFTR氯离子通道的基因突变所致²²。迄今为止，已发现超过2000种CFTR突变²³。其中最常见的突变^24,25出现在近90%的囊性纤维化等位基因中，表现为蛋白质多肽链第508位苯丙氨酸缺失（F508del-CFTR）。CFTR蛋白是一种纯欧姆性、小电导氯离子通道。还有大量证据表明，CFTR可调节其他转运机制，特别是ENaC^26,27。电解质转运功能障碍，包括CFTR依赖性氯离子电导降低和ENaC依赖性钠离子电导增强，是囊性纤维化上皮组织的典型特征。前者缺陷表现为：在有利于氯离子外流的电化学梯度条件下，或加入异丙肾上腺素（一种可升高细胞内cAMP的β-肾上腺素能激动剂）或佛司可林（一种腺苷酸环化酶激动剂，尚未获准用于临床）后，去极化反应减弱或消失；后者缺陷则表现为鼻黏膜基础电位超极化（电位更负）以及对阿米洛利（一种可阻断ENaC的利尿药物）的反应增强²⁸。

囊性纤维化小鼠模型在囊性纤维化研究中被广泛使用，对于解析囊性纤维化的病理机制具有重要价值。目前，已有至少十五种模型被报道²⁹，其中三个为临床上最相关的F508del突变纯合子^30,31,32. 这三种菌株之一³⁰，由鹿特丹伊拉斯姆斯大学开发，已在比利时天主教鲁汶大学（UCL）实验室中使用了近20年。Cftr^tm1Eur 模型³⁰ 已被证明在研究囊性纤维化疾病的多器官病理生理学以及评估新治疗策略的有效性方面非常有用^18,19,20,21. 在操作过程中或操作后早期可能出现多种问题（<24 小时）小鼠鼻部电位差检测。本文中，维持鼻部导管所需的最佳麻醉深度 原位 用于持续灌注，同时描述了防止鼻腔灌注液发生支气管吸入的措施。实验结束后的动物护理也进行了说明，包括给予麻醉药物的复合解毒剂，可迅速逆转麻醉状态，使动物完全恢复。总体而言，这些操作可在自主呼吸的小鼠中实现可靠的测量，降低与实验相关的死亡率，并允许在同一只动物上重复实验。文中展示了囊性纤维化（CF）小鼠与野生型小鼠鼻电位差（nasal PD）实验的代表性数据，并进行了分析与讨论。

小鼠鼻部电位差（PD）检测方案分为三个阶段进行报告：检测前、检测中和检测后的评估与管理。在检测前的评估与管理部分，详细描述了用于持续鼻腔灌注的双腔鼻导管及溶液的制备步骤。在检测过程中的评估与管理部分，对实验装置的搭建以及小鼠的操作进行了细致说明。最后，介绍了检测结束后的动物管理措施，以促进小鼠的完全恢复。

方案

本研究及相关操作已获得伦敦大学学院（UCL）动物研究伦理委员会批准（编号：2017/UCL/MD/015），并符合欧洲共同体关于实验动物使用的法规（CEE 第 86/609 号）。研究人员具备动物实验资格，符合欧洲议会和理事会于2010年9月22日发布的关于用于科学目的动物保护的第2010/63/EU号指令的要求。

1. 测试前评估与管理

1. 准备双腔鼻导管。
   ​注意：鼻导管由双腔毛细管制成，其中一个腔用于溶液的持续灌注，另一个腔作为测量通道。
   1. 将一段长约20 cm的聚乙烯管（内径2.0 mm，外径3.0 mm；图1a）的中部置于燃气灯火焰上加热，直至其软化至可拉伸状态（10–15 s）。
   2. 将两端拉开，拉制成适当长度（约15 cm）、外径约0.1 mm的细毛细管，作为鼻部探针（图1b）。
   3. 用纯乙醇清洗并脱脂两根此类毛细管，用胶带将其并列固定（图1c），然后使用氰基丙烯酸酯胶水粘合。
   4. 用剃刀刀片或手术刀切除探针多余部分，使双腔导管的最终长度约为8 cm（图1d）。
   5. 通过两个腔分别注入水，以确认其通畅性。
   6. 在探针尖端5 mm处做一标记。
      注意：探针插入鼻孔时应至该标记处，以确保所有测量均在鼻腔内相同位置进行。
   7. 将双腔鼻导管存放于干燥箱中。
      注意：若测试后立即适当清洁，该导管可重复使用6–10次。
2. 配制乳膏混合物。
   1. 将电解质乳膏与饱和3 M KCl溶液按1:1体积比轻轻混合，避免产生微小气泡。
      注意：如图1所示，该乳膏混合物用于构建测量用和参比用Ag/AgCl电极的电极桥。

图1：带电极和桥接结构的探针。 该图展示了双腔导管（d）的聚乙烯管在加热和拉伸前（a）和拉伸后（b）的状态、连接两个毛细管部分（c）的胶带、硅胶管连接器（e）以及电极（f）。为便于图像清晰显示，图中连接器未填充乳膏混合物。请点击此处查看该图的放大版本。

溶液标签	溶液描述
A	基础缓冲盐溶液
B	无氯缓冲盐溶液
C	10-2 M 氨氯吡脒储备液
D	10-3 M 福斯科林储备液

表1：小鼠鼻部电位差测试用储备液。

盐	毫摩尔	分子量	克/升
氯化钠 (NaCl)	135	58.44	7,889
二水氯化钙 (CaCl2.2H2O)	2.25	147	0.331
六水氯化镁 (MgCl2.6H2O)	1.2	203.3	0.244
磷酸氢二钾 (K2HPO4)	2.4	174.2	0.418
磷酸二氢钾 (KH2PO4)	0.4	136.1	0.054

表2：基础缓冲盐溶液（储备液A）的组成。

3. 配制溶液。
   1. 准备实验方案所需的四种储备溶液表1). 
      1. 制备基础缓冲液（储备液 A； 表 2）和无氯缓冲液（储备液 B； 表3) 通过在室温下将盐类溶于纯水中进行配制。使用 1 N NaOH 升高 pH，1 N HCl 降低 pH，将 pH 调整至 7.4（范围 7.0 - 7.6）。检测溶液的渗透压（275 mOsm/L）。
      2. 储存于贴有标签的玻璃瓶中，4 °C 下最多可保存 3 个月，或分装于塑料瓶中冷冻保存，最多可保存 6 个月。
      3. 制备10^-2 将26.6 mg氨氯吡脒盐酸盐溶于10 mL纯水中，配制10 mM氨氯吡脒溶液（储备液C）。在70 °C下加热混合物5至10分钟。由于氨氯吡脒对光敏感，需将溶液C保存在避光容器中。标记容器，并在4 °C下保存，可稳定存放长达3个月。
      4. 制备10^-3 将10 mg的forskolin加入24.36 mL纯水中，配制成M forskolin溶液（储备液D）。将forskolin储备液分装为每份0.1 mL，标记后于-20 °C保存，可稳定保存长达6个月。
4. 配制新鲜的A1、B1和B2溶液（表4).
   1. 制备新鲜的溶液A1（基础缓冲盐溶液） 加 10^-4 M 阿米洛利）的制备方法为：取 10 mL 基础盐溶液（储备液 A），加入 0.1 mL 的 10^-2 1 M 氨苯蝶啶溶液（储备液 C）。标记容器，并在配制后 24 小时内使用。
   2. 配制新鲜的溶液B1（氯化物缓冲液） 加 10^-4 M 阿米洛利）的制备方法为：取 10 mL 无氯缓冲盐溶液（储备液 B），加入 0.1 mL 10^-2 1 M 阿米洛利溶液（储备液 C）。标记容器，并在配制后 24 小时内使用。
   3. 配制新鲜的B2溶液（无氯缓冲盐溶液） 加 10^-4 M 阿米洛利和 10^-5 M forskolin）时，取10 mL无氯缓冲盐溶液（储备液B），加入0.1 mL 10^-2 M 阿米洛利溶液（储存液 C）和 0.1 mL 的 10^-3 M forskolin 溶液（储备液 D）。标记容器，并在配制后 2 小时内使用。

盐	mM	分子量	g/L
葡萄糖酸钠（单钠盐）	135	218.1	29,444
葡萄糖酸钙（无水粉末）	2.2	430.4	0.947
七水合硫酸镁（MgCl2.6H2O）	1.2	246.5	0.296
磷酸氢二钾（K2HPO4）	2.4	174.2	0.418
磷酸二氢钾（KH2PO4）	0.4	136.1	0.054

表3：无氯缓冲液（储备液B）的成分。

图 2：小鼠在鼻黏膜灌注过程中的体位。 该图显示了加热垫（a）、电压表（b）、插入后肢皮下空间的参比电极（c）、蠕动泵的近端出口（d）和远端出口（e）、枕头（f）以及床单（g）。请点击此处查看此图的放大版本。

2. 检测过程中的评估与管理

1. 准备实验装置。
   1. 为防止测试期间及测试后发生低体温，使用两个维持在生理温度的加热垫，其中一个用于测量装置（18.8 × 37.5 cm；图2a），另一个（15.5 × 15.5 cm）用于放置动物的盒子，以便在测试结束时进行恢复。
   2. 开启装有数据采集软件的计算机，该软件连接至高输入阻抗（>10¹²Ω）和高分辨率（0.1 mV）的电压表（图2b）。
   3. 将电极连接至电压表。将正极测量电极连接至鼻导管，负极参考电极连接至插入后肢皮下空间的导管，如图2c所示。
   4. 将电极尖端共同浸入电解质乳膏混合物中。检查初始电极偏移值。若该值超过（±）2 mV（理想为0 mV），则弃用该电极。
   5. 开启蠕动泵，并将泵管插入指定位置，如图2所示。
   6. 将泵管近端出口连接至含有选定鼻灌注溶液的小瓶（图2d）。将泵管远端出口连接至鼻导管的灌注腔（图2e）。
   7. 通过10 µL移液器吸头，将电解质乳膏混合物填充至鼻导管的一个腔内。将导管连接至硅胶管接头（图1e），用乳膏混合物填充接头，并将正极电极插入接头中（图1f）。检查测量电极桥接偏移值。若该值超过（±）2 mV（理想为0 mV），则弃用该桥接。
   8. 用新鲜溶液A1填充鼻导管的第二个腔。将鼻导管尖端浸入含有溶液A的小瓶中。反转蠕动泵方向，使鼻导管中填充相当于10秒灌注长度的溶液。
      注：这可在施加阿米洛利前记录10秒的基础电位差（PD）值。将鼻导管尖端浸入参考电极接头内的乳膏混合物中（图1）。
2. 开始处理小鼠。
   1. 记录小鼠体重，以计算需通过腹腔（ip）途径注射的麻醉剂精确剂量¹⁷。
   2. 使用26G（0.45 × 10 mm）针头，腹腔注射预麻醉药物以促进麻醉诱导：固定剂量50 µL的5 mg/mL咪达唑仑。等待5分钟。
   3. 配制麻醉混合液（芬太尼、美托咪啶、氟哌啶醇的终浓度分别为0.05、0.40和20 mg/kg体重，可乐定为固定剂量0.375 µg），以实现最佳且稳定的麻醉深度（III期，2平面）¹⁷。腹腔注射麻醉混合液的相应体积，随后注射可乐定的相应体积。
      注：15分钟后，小鼠应已入睡，麻醉可持续至少30分钟。
   4. 折叠一张吸水纸，制成宽约3 cm的“枕头”（图2f），覆盖在加热垫上部（图2a），作为小鼠头部的支撑。
   5. 用一张吸水纸覆盖加热垫（“床单”；图2g）。将小鼠仰卧置于加热垫上。用胶带固定四肢和尾巴（图2）。
   6. 将参考静脉导管（图1g）插入后肢皮下空间。拔出针头，并连接硅胶管接头（图1e, 2c）。
   7. 用乳膏混合物填充导管和接头，并将负极电极插入接头中（图1f）。
   8. 根据需要使用胶带固定导管和电极，防止任何移位。在放置参考电极和桥接后，再次将鼻导管尖端浸入静脉导管接头内的电极乳膏混合物中，验证测量电极桥接偏移值。记录稳定的最终偏移值（理想情况下小于（±）2 mV）。
   9. 使用“温和”胶带将小鼠耳朵固定在加热垫上，位置位于两片吸水纸（“枕头”（图2f）和“床单”（图2g））之间的空隙处。固定触须（靠近鼻孔生长的硬毛），但不要触碰眼睛。
   10. 为吸收口腔内的液体，将舌头侧向移动（图3a），并将约1 cm长的滤纸尖端（“导流管”；图3b）插入嘴中。为吸收从灌注鼻孔流出的液体，在鼻尖处放置第二张滤纸（“手帕”；图3c）并用手持住。
   11. 通过将鼻导管尖端接触口腔内壁，检查上皮电位的阳性对照值。
       注：读数应稳定，范围在-10 mV至-20 mV之间。
   12. 在良好直视照明下，用精细镊子轻轻将鼻导管插入一侧鼻孔，深入距鼻尖4–6 mm处。
       注：鼻电位差（PD）导管位于中鼻甲处，该位置可提供最大且稳定的基线PD值^17,20。
   13. 注射麻醉药物5分钟后，将加热垫连同动物头部向下倾斜约30°。监测最大基础PD值。
   14. 当PD值在约30秒内保持稳定后，以10 µL/min的恒定速率依次对鼻黏膜灌注4种缓冲溶液（A、A1、B1、B2）。第一种溶液（步骤1.3.1.1）灌注10秒，后续每种溶液（步骤1.4）灌注5分钟，或直至达到稳定值。当佛司可林（B2）的瞬时反应开始下降时，停止灌注佛司可林。
   15. 选择1秒时间间隔进行数据记录。从开始灌注时起开始记录数据。在计算机屏幕上以时间函数形式显示数据。
   16. 在溶液B2灌注结束后停止数据采集。将数据保存为电子表格文件。
   17. 通过减去最终偏移值对数据进行校正。

图3：小鼠在加热垫上的位置，鼻饲管和滤纸已放置到位。 该图展示了侧置的舌头（a）、导管（b）和纱布（c）。 请点击此处查看此图的放大版本。

3. 事后评估与管理

1. 将小鼠从加热垫上取下。
2. 用“床单”擦拭小鼠鼻部（图2g）。
3. 腹腔注射麻醉拮抗剂混合物，包含固定剂量（4 µg）的纳洛酮（一种竞争性吗啡拮抗剂）和阿替美唑（一种美托咪定特异性解毒剂，剂量为2 mg/kg体重）。
4. 将小鼠置于恢复箱内较小的加热垫上，直至完全恢复，通常在1至2小时后可观察到恢复情况。
   注意：在UCL实验室中，无论性别或基因型如何，约有10%的死亡率，主要与测试过程中灌注于鼻腔的溶液导致的支气管吸入有关。

结果

为了阐明囊性纤维化（CF）中特征性的离子转运异常，按照上述方案对中国台湾布鲁塞尔品系的F508del-CF小鼠及FVB/129遗传背景的野生型对照小鼠进行了鼻部电位差（PD）测量，这些小鼠属于Cftr^tm1Eur小鼠模型³⁰。这一具有临床相关性的模型携带最常见且最为严重的F508del-CFTR突变之一^23,24,25，是目前最理想的CF小鼠模型^30,31,32。

图4展示了在一只携带F508del-CF突变纯合子...

讨论

本文旨在描述一种在自主呼吸的小鼠中，通过持续灌注溶液来测量鼻部电位差（PD）的适当方案，实验时长足以检测离子转运蛋白（主要是CFTR和ENaC）功能的完整性。该方案的各个步骤均已经过仔细优化，以确保动物完全恢复，并获得高质量且可重复的数据。其中，关键步骤包括麻醉的评估与管理，以及实验过程中和实验后动物体位的恰当安置与护理。

既往研究表明，通过使用此处所述的混合麻醉剂可达到麻醉暴露的二期平面III¹⁷，与规律呼吸以及无负性肌力效应和无眨眼、瞳孔及足底回缩反射相关。在此麻醉深度下，可保留鼻导管 原位 用于鼻腔持续灌注以及作为测量电极的桥接，具有良好的耐受性。将导管插入皮下空间作为参考电极的桥接时，亦未出现任何疼痛反应或有害效应的迹象。在啮齿类动物中，来自鼻面部区域的感觉输入在行为调控中具有重要作用 与……相比 外部环境因素，包括威胁性刺激，使得在鼻腔内手术时维持适当的麻醉深度尤为困难。在一些小鼠研究中，已采用雾化给药替代持续鼻腔灌注来进行鼻腔PD检测。³³...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Portex 聚乙烯管	Smiths Medical, Hythe, Kent, England CT21 6JL	Portex 800/100/500；2.0 mm 内径，3.0 mm 外径	用于制备鼻部探针的毛细管
电极膏	Parker, Fairfield, NJ, USA	Redux 奶油	用于构建电极桥
Ag/AgCl 电极	Biomedical, Clinton Township, MI, USA	JNS BNT131-1,0	作为测量电极和参比电极
盐酸阿米洛利	Sigma, St Louis, MI, USA	A7410	用于配制灌注溶液
佛司可林	Sigma, St Louis, MI, USA	F6886	用于配制灌注溶液
Knick Portamess 电压表	Elektronisch Meβgeräte, Berlin, Germany	Portavo 904 pH	用于测量电位差
Paraly SW 112 软件	Elektronisch Meβgeräte, Berlin, Germany	Paraly SW112 软件	用于采集电位差数据
咪达唑仑	Mylan, Hoeilaart, Belgium	Dormicum 15 mg/3 ml	作为麻醉前用药
芬太尼	Janssen Cilag, Berchem, Belgium	Fentanyl-Janssen 0.05 mg/ml	作为麻醉用药
美托咪定	Orion Pharma, Espoo, Finland	Domitor 1 mg/ml	作为麻醉用药
滴定哌醇	Janssen  Cilag, Berchem, Belgium	Dehydrobenzperidol 2.5 mg/ml	作为麻醉用药
可乐定	Boehringer Ingelheim Pharma KG, Ingelheim am Rhein, Germany	Catapressan 0.15 mg/ml	作为麻醉用药
参考用静脉导管	Becton Dickinson, Sandy, UT, USA	24 GA × 0.75 IN, BD Insyte-W	用于构建电极桥
镊子	Fine Science Tools, Heidelberg, Germany	Dumont #5, Fine Science Tools	用于放置鼻导管
纳洛酮	Braun Medical, Brussels, Belgium	Narcan, 0.4 mg/ml	作为麻醉拮抗剂
阿替咪唑	Zoetis, Bloomberg, Belgium	Antisedan, 5 mg/ml	作为美托咪定的特异性解毒剂
加热垫	Harvard Apparatus, Holliston, MA, USA	18.8×37.5 cm；15.5×15.5 cm	用于避免测试期间及之后的低体温
蠕动泵 P1	GE Life Sciences, Uppsala, Sweden	18111091	用于向小鼠鼻腔灌注溶液
氰基丙烯酸酯胶	Loctite, Henkel, Düsseldorf, Germany	超级胶水 3	用于将两根毛细管粘合在一起 以制备鼻部探针
NaCl	Sigma, St Louis, MI, USA	RES0926S-A7	药用级，USP
CaCl₂·2H₂O	Sigma, St Louis, MI, USA	M7304	药用级，USP
MgCl₂·6H₂O	Sigma, St Louis, MI, USA	1551128	药用级，USP
K₂HPO₄	Sigma, St Louis, MI, USA	1551139	药用级，USP
葡萄糖酸钠	Sigma, St Louis, MI, USA	S2054	药用级，USP
葡萄糖酸钙	Sigma, St Louis, MI, USA	C8231	药用级，USP
MgSO₄·7H₂O	Sigma, St Louis, MI, USA	RES0089M-A7	药用级，USP
BD 针头	Becton Dickinson, Franklin Lakes, USA	BD 26G (0.45×10 mm)	用于腹腔注射