小鼠鼻上皮电位差测定法量化跨上皮离子转运

摘要

本文介绍了一种用于测量小鼠鼻电位差的实验方案。该检测方法可定量分析跨膜离子转运蛋白（如囊性纤维化跨膜传导调节因子和上皮钠离子通道）的功能，对于评估囊性纤维化新型疗法的有效性具有重要价值。

摘要

鼻电位差检测已用于辅助诊断囊性纤维化（CF）近三十年。该检测在临床表现较轻、寡症状或单症状型CF（通常在较晚年龄确诊）以及CF相关疾病（如先天性双侧输精管缺如、特发性慢性胰腺炎、变应性支气管肺曲霉病和支气管扩张）的诊断中具有重要价值。在临床和临床前研究中，该检测还被用作生物标志物，以量化CF靶向治疗策略的疗效反应。将该检测技术应用于小鼠具有挑战性，可能伴随一定的死亡率。本文描述了维持鼻导管所需的最佳麻醉深度 原位 用于持续灌注。文中列出了避免鼻腔灌注溶液发生支气管误吸的措施，并描述了实验结束后的动物护理，包括给予麻醉药物的复合解毒剂，从而迅速逆转麻醉状态，使动物完全恢复。来自囊性纤维化（CF）小鼠和野生型小鼠的代表性数据表明，该检测方法能够有效区分CF与非CF小鼠。综上所述，本方案可对自由呼吸小鼠的跨上皮氯离子和钠离子转运功能状态进行可靠测量，允许在同一动物上进行多次检测，并降低与检测相关的死亡率。

引言

近三十年来，人们一直通过测量电势差（PD）来评估鼻黏膜上表达的跨膜离子转运体的功能状态，以代表远端气道的情况¹。作为一种多步骤动态检测方法^2,3，鼻电势差（nasal PD）可对定位于上皮细胞顶膜、并在气道表面液化中发挥关键作用的囊性纤维化跨膜传导调节因子（CFTR）和上皮钠通道（ENaC）的功能进行解析。鼻PD检测最主要的临床应用是辅助诊断囊性纤维化（CF），后者是高加索人群中最常见的致死性遗传病，在欧洲国家的平均发病率约为每2,500名活产婴儿中1例。该检测长期以来在诊断迟发性的、症状轻微或单一症状型的CF方面具有重要价值，同时也用于诊断与CF相关的疾病，如先天性双侧输精管缺如、特发性慢性胰腺炎、变应性支气管肺曲菌病以及支气管扩张症⁴。近年来，在对CFTR基本缺陷的治疗性调节进行临床计量学评估时^5,6,7,8,9,10

方案

本研究及相关操作已获得伦敦大学学院动物研究伦理委员会批准（2017/UCL/MD/015），并符合欧洲共同体关于实验动物使用的规定（CEE n° 86/609）。研究人员具备动物实验资格，符合2010年9月22日欧洲议会和理事会关于保护用于科学目的动物的第2010/63/EU号指令。

1. 检测前评估与管理

1. 准备双腔鼻导管。
   ​注意：鼻导管由双腔毛细管制成，其中一个腔用于溶液的连续灌注，另一个腔作为测量通道。
   1. 取一段长约20 cm的聚乙烯管（内径2.0 mm，外径3.0 mm；图1a），将其中部在燃气灯火焰上加热，直至足够软化以便拉伸（10–15 s）。
   2. 将两端拉开，拉制成适当长度（约15 cm）和外径（约0.1 mm）的细毛细管，用于制作鼻探针（图1b）。
   3. 用纯乙醇清洗并脱脂两根此类毛细管，用胶带将它们并排固定（图1c），然后使用氰基丙烯酸酯胶水将其粘合在一起。
   4. 用剃刀或解剖刀切去探针多余部分，使双腔导管的最终长度约为8 cm（图1<....

结果

为了阐明囊性纤维化（CF）中特征性的离子转运异常，按照上述方案对中国台湾布鲁塞尔品系的F508del-CF小鼠及FVB/129遗传背景的野生型对照小鼠进行了鼻部电位差（PD）测量，这些小鼠属于Cftr^tm1Eur小鼠模型³⁰。这一具有临床相关性的模型携带最常见的、也是最严重的F508del-CFTR突变之一^23,24,25，是目前最理想的CF小鼠模型^30,31,32。

代表性鼻部电位差（PD）记录图，来自一只4月龄.......

讨论

本文旨在描述一种在自主呼吸的小鼠中，通过持续灌注溶液来测量鼻部电位差（PD）的适当方案，实验时长足以检测离子转运蛋白（主要是CFTR和ENaC）功能的完整性。该方案的各个步骤均已经过仔细优化，以确保动物完全恢复，并获得高质量且可重复的数据。其中，关键步骤包括麻醉的评估与管理，以及实验过程中和实验后动物体位的恰当安置与护理。

既往研究表明，通过使用此处所述的混合麻醉剂可达到麻醉暴露的二期平面III¹⁷，与规律呼吸以及无负性肌力效应和无眨眼、瞳孔及足底回缩反射相关。在此麻醉深度下，可保留鼻导管 原位 用于鼻腔持续灌注以及作为测量电极的桥接，具有良好的耐受性。将导管插入皮下空间作为参考电极的桥接时，亦未出现任何疼痛反应或有害效应的迹象。在啮齿类动物中，来自鼻面部区域的感觉输入在行为调控中具有重要作用 与……相比 外部环境因素，包括威胁性刺激，使得在鼻腔内手术时维持适当的麻醉深度尤为困难。在一些小鼠研究中，已采用雾化给药替代持续鼻腔灌注来进行鼻腔PD检测。³³.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Portex 聚乙烯管	Smiths Medical, Hythe, Kent, England CT21 6JL	Portex 800/100/500；2.0 mm 内径，3.0 mm 外径	用于制备鼻部探针的毛细管
电极膏	Parker, Fairfield, NJ, USA	Redux 奶油	用于构建电极桥
Ag/AgCl 电极	Biomedical, Clinton Township, MI, USA	JNS BNT131-1,0	作为测量电极和参比电极
盐酸阿米洛利	Sigma, St Louis, MI, USA	A7410	用于配制灌注溶液
佛司可林	Sigma, St Louis, MI, USA	F6886	用于配制灌注溶液
Knick Portamess 电压表	Elektronisch Meβgeräte, Berlin, Germany	Portavo 904 pH	用于测量电位差
Paraly SW 112 软件	Elektronisch Meβgeräte, Berlin, Germany	Paraly SW112 软件	用于采集电位差数据
咪达唑仑	Mylan, Hoeilaart, Belgium	Dormicum 15 mg/3 ml	作为麻醉前用药
芬太尼	Janssen Cilag, Berchem, Belgium	Fentanyl-Janssen 0.05 mg/ml	作为麻醉用药
美托咪定	Orion Pharma, Espoo, Finland	Domitor 1 mg/ml	作为麻醉用药
滴定哌醇	Janssen  Cilag, Berchem, Belgium	Dehydrobenzperidol 2.5 mg/ml	作为麻醉用药
可乐定	Boehringer Ingelheim Pharma KG, Ingelheim am Rhein, Germany	Catapressan 0.15 mg/ml	作为麻醉用药
参考用静脉导管	Becton Dickinson, Sandy, UT, USA	24 GA × 0.75 IN, BD Insyte-W	用于构建电极桥
镊子	Fine Science Tools, Heidelberg, Germany	Dumont #5, Fine Science Tools	用于放置鼻导管
纳洛酮	Braun Medical, Brussels, Belgium	Narcan, 0.4 mg/ml	作为麻醉拮抗剂
阿替咪唑	Zoetis, Bloomberg, Belgium	Antisedan, 5 mg/ml	作为美托咪定的特异性解毒剂
加热垫	Harvard Apparatus, Holliston, MA, USA	18.8×37.5 cm；15.5×15.5 cm	用于避免测试期间及之后的低体温
蠕动泵 P1	GE Life Sciences, Uppsala, Sweden	18111091	用于向小鼠鼻腔灌注溶液
氰基丙烯酸酯胶	Loctite, Henkel, Düsseldorf, Germany	超级胶水 3	用于将两根毛细管粘合在一起 以制备鼻部探针
NaCl	Sigma, St Louis, MI, USA	RES0926S-A7	药用级，USP
CaCl₂·2H₂O	Sigma, St Louis, MI, USA	M7304	药用级，USP
MgCl₂·6H₂O	Sigma, St Louis, MI, USA	1551128	药用级，USP
K₂HPO₄	Sigma, St Louis, MI, USA	1551139	药用级，USP
葡萄糖酸钠	Sigma, St Louis, MI, USA	S2054	药用级，USP
葡萄糖酸钙	Sigma, St Louis, MI, USA	C8231	药用级，USP
MgSO₄·7H₂O	Sigma, St Louis, MI, USA	RES0089M-A7	药用级，USP
BD 针头	Becton Dickinson, Franklin Lakes, USA	BD 26G (0.45×10 mm)	用于腹腔注射