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检测幼鱼行为反应谱的实验方案：以神经兴奋剂咖啡因为例

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DOI：

10.3791/57938

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2018年7月24日

 ,  , 
1Department of Environmental Science, Center for Reservoir and Aquatic Systems Research, Baylor University, 2Institute of Biomedical Studies, Baylor University

本文内容

摘要

本文介绍了一种利用自动化追踪软件检测幼年斑马鱼和黑头软口鲦鱼运动活动及光运动反应（PMR）的实验方案。将这些行为分析整合到常规毒理学生物测定中，可作为检测化学物质生物活性的诊断工具。本方案以咖啡因为例进行说明，咖啡因是一种模型神经兴奋剂。

摘要

鱼类模型及其行为在生物医学科学中的应用日益广泛；然而，鱼类长期以来一直是生态学、生理学和毒理学研究的对象。近年来，神经药理学领域利用自动化数字追踪平台，通过幼鱼的运动行为来识别新型小分子的潜在治疗靶点。与这些研究类似，环境科学以及比较药理学和毒理学领域的研究正在将鱼类模型的多种行为作为诊断工具，用于对污染物进行分层评估，并实时监测地表水中的污染物威胁。在生物医学科学中，斑马鱼是一种常用的幼鱼模型，而在生态毒理学中，胖头鱥则是常见的幼鱼模型。遗憾的是，胖头鱥幼鱼在行为学研究中受到的关注相对较少。本文中，我们建立并展示了一种以咖啡因为模型神经兴奋剂的行为特征分析方案。尽管咖啡因偶尔会影响胖头鱥的光运动反应，但斑马鱼 在光运动和运动终点指标上明显更为敏感，其反应水平接近环境相关浓度。未来的研究需要进一步明确不同鱼类在不同年龄和昼夜时间下的行为敏感性差异，并确定类似的行为效应是否会在自然环境中发生，以及是否能够指示个体或种群水平上的不良生物学后果。

引言

尽管鱼类模型在生物医学研究中的应用日益广泛，但长期以来，鱼类一直被常规用于生态学和生理学研究，以检测地表水的污染状况，并确定化学物质的毒理学阈值。这些研究工作至关重要，因为化学污染可能破坏水生生态系统，并威胁水源供应的质量1,2。然而，目前大多数商用化学品甚至缺乏基本的毒理学数据3。

传统上用于法规毒性测试的动物模型实验耗资巨大，且无法满足21世纪毒性测试所需的高通量、早期阶段筛选要求4。因此，人们越来越倾向于采用和利用体外（in vitro）模型，以更快速、高效地对化合物的生物活性进行筛选3,5。尽管基于细胞的模型提供了诸多可能性，但它们通常缺乏足够的生物复杂性，因而无法涵盖许多重要的整体生物过程，包括代谢过程6。

斑马鱼是一种常见的生物医学动物模型，近年来在水生毒理学和生态毒理学中作为替代模型的应用日益广泛7,8。由于其体型小、发育迅速且繁殖力高，鱼类模型可用于在整体生物水平上快速高效地筛选化学物质的生物活性和毒性9。借助自动化追踪软件，斑马鱼幼鱼的行为在污染物毒性筛查中具有更高的诊断价值10,11。药物科学领域的研究表明，运动行为终点指标能够反映化学物质的作用机制，可用于行为表型分析，并可能初步识别新分子的亚细胞作用靶点12,13。尽管斑马鱼在生物医学研究中是一种广泛应用的幼鱼模型，但胖头鱥（fathead minnow）则是一种常见且具有重要生态意义的鱼类模型，常用于生态毒理学研究，以及前瞻性（例如，新化学物质评估）和回顾性（例如，环境地表水或废水排放监测）的环境评估。然而，相较于斑马鱼，胖头鱥幼鱼的行为反应受到的关注明显较少。我们针对两种常见的幼鱼模型——斑马鱼和胖头鱥开展的持续研究表明，不同化学物质预期的作用模式或机制可能对应独特的幼鱼游动模式。因此，行为终点指标有望在早期层级评估中，快速而灵敏地检测化学物质的毒性，并识别工业化学品及其他污染物的亚细胞作用靶点。

本文报道了一种用于检测幼鱼行为反应谱的方法。我们以咖啡因为例来演示这些方法，咖啡因是一种模型神经兴奋剂，也是常见的水生污染物，可通过人类摄入含咖啡因的食品、饮料和药品后，经污水处理厂排放进入水生系统14。我们检测了咖啡因对斑马鱼幼鱼和胖头鱥幼鱼的行为反应，包括对光照条件突然变化的反应，后者在胚胎期和幼体斑马鱼的药物研究中常被称为光运动反应（PMR）13,15。我们进一步分析了咖啡因在多个运动行为终点上的效应，以建立每种鱼类模型的化学反应谱。本研究中使用的咖啡因处理浓度代表了基于环境中实测咖啡因浓度所确定的暴露分布的较高百分位数16。此外，我们还设置了以幼鱼LC50值为基准的处理组，以及治疗危害值（THV）处理组；THV是指水中药物浓度预计会导致鱼类血浆浓度达到与人类治疗剂量相当的水平。

方案

本方案中的研究通常遵循美国环境保护局（EPA no. 2000.0）针对胖头 minnow（Pimephales promelas）和经济合作与发展组织（OECD no. 236）针对斑马鱼（Danio rerio）所规定的标准化实验设计及推荐的统计分析指南。这些实验设计（例如，增加重复次数）可根据当前方案在今后的研究中进行调整。鱼类培养条件遵循已发表的文献方法。17所有实验操作和鱼类培养方案均遵循贝勒大学机构动物护理和使用委员会批准的规程。

1. 对鱼类进行化学处理暴露

  1. 通过将咖啡因溶解于再配制的硬水中来制备咖啡因暴露溶液。使用硬水对较高浓度的咖啡因处理液进行适当的系列稀释，以获得较低浓度的咖啡因处理梯度。
    注意：表1 总结了本实验中使用的各处理浓度。
斑马鱼胖头 minnow（Fathead Minnow）
处理名义咖啡因浓度 (mg/L)实测咖啡因浓度 (mg/L)处理名义咖啡因浓度 (mg/L)实测咖啡因浓度 (mg/L)
对照0 对照0
第75百分位*0.0010.001第75百分位*0.0010.001
第95百分位*0.0390.013第95百分位*0.0390.009
第99百分位*0.4120.361第99百分位*0.4120.310
THV4.073.81THV4.074.12
10% LC5048.4646.6610% LC5014.114.7
40% LC50193.82186.6740% LC5056.3853.91

表1：斑马鱼和黑头软口鱼实验的咖啡因处理方案。 列出了每种处理组中咖啡因的理论浓度和实测浓度。*本研究中使用的咖啡因处理浓度代表了基于环境中实测咖啡因浓度分布的较高百分位数16。THV：治疗危害值。LOD：检测限

  1. 将配制好的溶液分别倒入各个暴露室中。斑马鱼暴露室使用100 mL玻璃烧杯，每杯加入20 mL暴露溶液；胖头 minnow 暴露室使用500 mL烧杯，每杯加入200 mL暴露溶液。
  2. 使用移液管，将4–6小时受精后（hpf）的斑马鱼胚胎各10个分别放入每个处理组的四个重复暴露室中。
  3. 将孵化后24小时内大小的胖头 minnow 幼体各10个放入每个处理组的三个重复暴露室中。为适应胖头 minnow 幼体较大的体型，转移前需将移液管管尖剪去。
  4. 斑马鱼实验维持在16:8小时光照:黑暗光周期条件下，温度恒定为28 ± 1 °C。胖头 minnow 实验采用相同的光周期条件，但温度设定为25 ± 1 °C。
  5. 化学暴露96小时后，将每条鱼分别转移至48孔板（斑马鱼）或24孔板（胖头 minnow）的不同孔中。
    1. 为确保每孔中溶液体积相等，使用5,000 µL自动移液器将斑马鱼幼体转移至48孔板中，每孔加入1,000 µL体积。使用自动移液器同时吸取并转移斑马鱼幼体及其暴露溶液。
    2. 由于体型较大，转移胖头 minnow 幼体时应使用剪去管尖的移液管。在将胖头 minnow 幼体转移至各孔之前，先用自动移液器向每孔中加入2,000 µL溶液。转移单个胖头 minnow 幼体时，将移液管管尖插入孔内液面下，让鱼自行从管尖游入孔中。

2. 视频追踪参数的校准

  1. 在进行行为学测量之前，在视频追踪软件中设置观察和校准参数（参见材料表）。
    1. 将一个孔板放入记录室中，每个孔内至少放置一条幼鱼。利用该孔板及相应的鱼作为参照，设定校准参数。
    2. 在视频追踪软件中，点击“文件 | 生成方案”，将弹出“方案创建向导”对话框。在“位置计数”字段中，输入孔板的孔数量，然后点击“确定”。
    3. 在屏幕顶部，点击“View | Full Screen”，系统将显示培养板的俯视摄像画面。
    4. 单击“绘制区域”图标，该图标显示为三个不同颜色的形状。在孔板 viewing 区域右侧，选择标注为“Areas”的字段中的圆形图标。
    5. 使用光标勾勒出孔板左上孔的圆形视频追踪区域。选择“右上标记”，然后勾勒出右上孔的观察区域。接着，选择“底部标记”以勾勒出右下孔的观察区域。
      注意：绘制圆形轮廓后，可能需要调整其位置。要调整轮廓的位置，请点击“select”，然后使用光标移动选定的区域。此外，可以通过点击“复制”来复制轮廓。复制“和然后”粘贴". 
    6. 在定义左上、右上和右下孔的追踪区域后，单击“Build”，以提示软件自动划分其余孔的观察区域。
    7. 在标有“校准”的区域，点击“绘制标尺”。使用光标在培养板上绘制一条水平线。绘制完成后，将弹出一个标有“校准测量”的对话框。输入培养板的长度，然后点击“确定”。
    8. 单击“绘制区域”图标以退出绘图管理器。
    9. 单击“平铺”图标。使用光标选中查看屏幕上出现的所有方框，使每个方框均变为绿色。
      注意：磁贴图标显示为六个独立的小方块组成的组图
    10. 点击“查看 | 全屏”。在平板观察区域右侧，点击标注为“检测阈值”的框中的“Bkg”按钮。使用阈值调节条设置像素检测阈值。选定合适的像素检测阈值后，点击“应用于组”。
      注意：本方案中，斑马鱼观察在黑色模式下的检测阈值设为13，胖头 minnow 观察在透明模式下的检测阈值设为110。
    11. 在标有“运动阈值”的框中输入所需的运动速度追踪参数。设置速度参数后，点击“应用于组”。
      注意：本方案将小/大运动速度设定为 20 mm/s，无活动/小运动速度设定为 5 mm/s。这些参数设置使软件能够以三种不同的速度水平追踪幼鱼的运动：无活动（静止）= <5 mm/s，小尺度（巡航）= 5–20 mm/s，大尺度（爆发）= >20 mm/s
    12. 从下拉菜单中点击“参数 | 实验方案参数”。在弹出的对话框中，选择“时间”选项卡。输入观察时间和积分时间。参数输入完毕后，点击“确定”。
    13. 通过从“参数”下拉菜单中选择“光照驱动”，打开光照驱动设置对话框，以设定每个光周期的光照/黑暗时间及光照强度。
      注意：有关设置多种光暗光周期的详细操作，请参见实验视频。
    14. 设置完视频追踪参数后，保存观察方案。
      注意：本实验方案观察鱼类行为共50分钟，包括10分钟适应期，随后进行4个交替的明暗阶段，包含两个10分钟光照期和两个10分钟黑暗期。设定积分时间为每分钟记录一次，以测量50分钟行为实验期间每一分钟的行为表现。

3. 幼鱼运动行为与趋光行为的观察

  1. 将含有实验鱼的孔板放入行为记录室中。
  2. 在视频追踪软件中，打开步骤3中建立的追踪方案。
  3. 在视频追踪查看界面中，检查确保所有幼鱼在计算机屏幕上均可见，每个孔中仅存在一条个体幼鱼，且各个孔与步骤2.1.5和2.1.6中定义的观察区域对齐。
  4. 点击“实验 | 执行”。
    注意：系统将提示用户输入观察数据的保存名称和存储位置。
  5. 指定观察数据的名称和保存位置后，点击“多个实时图像”图标以高亮所有已预定义的观察区域。
    注意：该图标位于计算机屏幕顶部，显示为一个被分为四个小方格的方框。点击此图标将高亮所有已预定义的观察区域。
  6. 关闭记录室的面板，并在计算机显示器上点击“背景 | 开始”。

4. 行为数据的分析

  1. 要获取幼鱼活动数据，请打开电子表格，该表格由追踪软件自动汇总生成，并位于用户启动行为实验前指定的文件夹中（步骤 3.4）。
  2. 参见图 1A和1B，分别显示未经暴露处理的斑马鱼和黑头软口鱼幼体的典型自主运动活动测量结果。参见图 1C和1D中的PMR计算结果，该指标可有效评估光照转黑暗或黑暗转光照过程中运动变化的幅度。

斑马鱼和黑头软口鱼的游动活动；明暗光周期实验，响应图。
图 1： 未暴露处理的斑马鱼（A 和 B）与黑头软口鱼（C 和 D）的基础活动示例。斑马鱼（A）和黑头软口鱼（C）的平均游动距离（± SEM）以圆点表示，每个圆点代表一分钟时间间隔内的活动量。实验测量了两个暗期和两个光期的光运动反应。每个光周期的最后（a、c、e 和 g）和第一个（b、d、f 和 h）分钟的数据用于计算光运动反应（PMRs）。斑马鱼（B）和黑头软口鱼（D）的光运动反应通过初始光周期最后一分钟与后续光周期第一分钟之间的平均移动距离（±SEM）变化来测定。请点击此处查看该图的放大版本。

结果

在斑马鱼和黑头软口鲦鱼的96小时实验期间，咖啡因处理浓度未发生明显变化。例如，表1列出了经分析验证的各处理浓度的实际数值。本方案采用同位素稀释液相色谱串联质谱法（LC-MS/MS）对水样中的咖啡因处理浓度进行验证，方法总体遵循先前报道的流程28。同时对咖啡因的主要代谢产物副黄嘌呤的生成进行了定量分析。这些分析方法的详细描述见补充分析信息部分。由于名义浓度与实测浓度之间具有高度一致性，本文后续部分均采用名义处理浓度进行表述。咖啡因显著改变了斑马鱼和黑头软口鲦鱼的行为。然而，斑马鱼的运动反应对咖啡因的敏感性始终高于黑头软口鲦鱼。在0.039 mg/L浓度下，斑马鱼和黑头软口鲦鱼幼体的最敏感行为终点已受到显著影响。表2总结了两种鱼类模型在各行为终点的最低可见效应浓度（LOEC）和无可见效应浓度（NOEC）。

斑马鱼  胖头 minnow  
终点指标 LOEC (mg/L)NOEC (mg/L)终点指标 LOEC (mg/L)NOEC (mg/L)
黑暗中的总移动距离0.4120.039黑暗中的总移动距离−56.38
光照下的总移动距离48.464.07光照下的总移动距离−56.38
黑暗中的总活动次数0.4120.039黑暗中的总活动次数−56.38
光照下的总活动次数48.464.07光照下的总活动次数−56.38
黑暗中的爆发性移动距离−193.82黑暗中的爆发性移动距离−56.38
光照下的爆发性移动距离193.8248.46光照下的爆发性移动距离−56.38
黑暗中的爆发性活动次数193.8248.46黑暗中的爆发性活动次数−56.38
光照下的爆发性活动次数193.8248.46光照下的爆发性活动次数−56.38
黑暗中的爆发性持续时间193.8248.46黑暗中的爆发性持续时间−56.38
光照下的爆发性持续时间−193.82光照下的爆发性持续时间−56.38
黑暗中的巡航移动距离0.4120.039黑暗中的巡航移动距离−56.38
光照下的巡航移动距离48.464.07光照下的巡航移动距离−56.38
黑暗中的巡航活动次数0.4120.039黑暗中的巡航活动次数−56.38
光照下的巡航活动次数48.464.07光照下的巡航活动次数−56.38
黑暗中的巡航持续时间0.4120.039黑暗中的巡航持续时间−56.38
光照下的巡航持续时间48.464.07光照下的巡航持续时间−56.38
黑暗中的静止移动距离0.4120.039黑暗中的静止移动距离0.0390.001
光照下的静止移动距离0.0390.001光照下的静止移动距离−56.38
黑暗中的静止活动次数0.4120.039黑暗中的静止活动次数−56.38
光照下的静止活动次数48.464.07光照下的静止活动次数−56.38
黑暗中的静止持续时间−193.82黑暗中的静止持续时间56.3814.10
光照下的静止持续时间48.464.07光照下的静止持续时间−56.38
黑暗1期PMR48.464.07黑暗1期PMR0.0390.001
光照1期PMR48.464.07光照1期PMR−56.38
黑暗2期PMR48.464.07黑暗2期PMR−56.38
光照2期PMR48.464.07光照2期PMR−56.38
黑暗1期爆发性PMR−193.82黑暗1期爆发性PMR−56.38
光照1期爆发性PMR−193.82光照1期爆发性PMR−56.38
黑暗2期爆发性PMR193.8248.46黑暗2期爆发性PMR−56.38
光照2期爆发性PMR−193.82光照2期爆发性PMR−56.38
黑暗1期巡航PMR48.464.07黑暗1期巡航PMR−56.38
光照1期巡航PMR48.464.07光照1期巡航PMR−56.38
黑暗2期巡航PMR48.464.07黑暗2期巡航PMR−56.38
光照2期巡航PMR193.8248.46光照2期巡航PMR56.3814.10
黑暗1期静止PMR48.464.07黑暗1期静止PMR−56.38
光照1期静止PMR193.8248.46光照1期静止PMR−56.38
黑暗2期静止PMR48.464.07黑暗2期静止PMR−56.38
光照2期静止PMR193.8248.46光照2期静止PMR−56.38

表2：斑马鱼和黑头软口鱼暴露于咖啡因后的行为学无观察效应浓度（NOEC）和最低观察效应浓度（LOEC）。 斑马鱼和黑头软口鱼在暴露于咖啡因后，各项明/暗环境游泳活动终点指标和光运动反应的无观察效应浓度（NOEC）与最低观察效应浓度（LOEC）（mg/L）值。短横线表示在所有处理浓度下，特定终点均未观察到效应。

图2展示了斑马鱼和黑头软口鲦在咖啡因暴露96小时后的总运动活性及光运动反应（PMR）。黑头软口鲦幼体的PMR在较低处理浓度（0.038 mg/L）下即受到咖啡因影响，而斑马鱼受影响的光运动反应指标数量明显更多。在最高处理浓度（193.82 mg/L）下，斑马鱼的PMR发生改变，其反应模式与对照组完全相反。然而，在该高浓度处理下，黑暗条件中的PMR降低，而光照条件中的PMR升高。

咖啡因对斑马鱼运动行为的影响：折线图 A、C；柱状图 B、D；光周期分析。
图 2： 斑马鱼（A 和 B）与黑头软口鱼（C 和 D）在暴露于咖啡因 96 小时后的游泳活动及光运动反应。斑马鱼（A）和黑头软口鱼（C）的平均（± 标准误）游泳距离以每点代表 1 分钟活动间隔的形式给出。斑马鱼（B）和黑头软口鱼（D）的光运动反应通过初始光周期最后几分钟与后续周期第一分钟之间平均（± 标准误）总移动距离的变化来衡量。共测量了两个黑暗期和两个光照期的光运动反应。行为观察共使用了 24 条斑马鱼（6 条幼鱼为一组，共 4 个重复）和 12 条黑头软口鱼（4 条幼鱼为一组，共 3 个重复）。*p <0.10；** p <0.05；*** p <0.01。 请点击此处查看该图的放大版本。

除了测量幼体的PMR外，还针对移动距离、运动次数和运动持续时间三个速度阈值，分析了明暗条件下的运动活动。该数据用于建立咖啡因的行为反应谱（图3，补充 图1）。在两种鱼类模型中，咖啡因在所有显著受影响的运动终点指标上均抑制了活动。两种鱼类模型在暴露于咖啡因后，在爆发性运动速度阈值下的活动均有所增加，但未达到显著水平。与PMR观察结果相似，咖啡因对斑马鱼的运动终点指标影响更为显著。事实上，在环境相关浓度低于THV的条件下，咖啡因在黑暗环境下显著改变了斑马鱼的多项运动反应。然而，在光照条件下，任何处理浓度的咖啡因均未对胖头鱥的运动活动产生显著影响。

斑马鱼行为雷达图；咖啡因对活动的影响；数据分析结果，统计表。
图3：幼年斑马鱼和黑头软口鱼在咖啡因暴露96小时后的行为反应谱。 暴露于咖啡因96小时后，斑马鱼在黑暗（A）和光照（B）条件下的平均游泳活动与黑头软口鱼在黑暗（C）和光照（D）条件下的平均活动比较。绘图数据表示每种鱼类模型在两个10分钟黑暗光周期和两个10分钟光照光周期期间的活动情况。数据已归一化至对照组，对照组在每张图中以0轴表示。行为参数包括在三个速度水平下的游泳距离、运动次数（计数）以及每次运动持续时间，分别为爆发式运动（>20 mm/s）、巡航式运动（5–20 mm/s）和静止状态（<5 mm/s）。除各速度阈值下的运动模式外，还展示了总游泳距离和总运动次数。↑表示与对照组相比活动显著增加，↓表示与对照组相比活动显著减少。每组行为观察使用了24条斑马鱼（6条幼鱼，每条4个重复）和12条黑头软口鱼（4条幼鱼，每条3个重复）。*p <0.10；** p <0.05；*** p <0.01。 请点击此处查看此图的放大版本。

补充图 1：斑马鱼（A 和 B）与黑头软口鲦鱼（C 和 D）在三个速度阈值下的光运动反应。斑马鱼（A、B、C）和黑头软口鲦鱼幼体（D、E、F）在咖啡因暴露 96 小时后，基于三个速度阈值（静止：20 mm/s）的光运动反应。斑马鱼和黑头软口鲦鱼的光运动反应通过初始光照周期最后几分钟与随后周期第一分钟之间平均总移动距离（±标准误）的变化来衡量。共测量了两个黑暗期和两个光照期的光运动反应。行为观察共使用了 24 条斑马鱼（每组 6 条幼鱼，共 4 个重复）和 12 条黑头软口鲦鱼（每组 4 条幼鱼，共 3 个重复）。*p <0.01 请点击此处下载该文件。

讨论

在为行为毒理学研究选择化学处理浓度时，必须考虑多个因素。本研究中咖啡因的处理浓度是基于废水排放预测环境暴露情景的高百分位数值确定的16。在可能的情况下，我们通常依据环境观测数据的概率性暴露评估来确定水生毒理学研究的处理浓度19,20,21。本研究还纳入了药品可计算的治疗危害值（THV）作为处理浓度之一。THV值（公式1）22,23 定义为鱼类体内药物达到人体治疗剂量（Cmax）时的预测水体浓度23，其概念源于早期的血浆建模研究24，并基于血液与水之间的化学物质分配系数进行计算（公式2）25。

THV = Cmax / log PBW                                       （公式 1）

log PBW = log [(100.73 . log Kow · 0.16)+0.84]     （公式 2）

此处，我们还根据斑马鱼和黑头呆鱼的LC50值选择亚致死处理浓度。我们认为该方法是行为反应的一种有效基准评估程序，特别是在比较不同化学物质对鱼类模型特定行为的反应阈值时。该方法还可进一步用于计算急性与慢性比值，这在水生毒理学的机制研究和评估中具有诊断意义。LC50值是根据第2.1步所述的标准指南，通过初步毒性生物测定实验获得的。

在本实验方案中，我们采用美国环保局（US EPA）和经济合作与发展组织（OECD）标准化方法中推荐的常见实验设计和统计技术，用于鱼类模型的毒理学研究。尽管我们报告了p值（例如，<0.01，<0.05，<0.10），但当数据满足正态性和方差齐性假设时，我们通过方差分析（ANOVA）来识别不同处理组之间活动水平的显著差异（α = 0.10）。随后采用Dunnett法或Tukey法HSD事后检验以确定具体处理水平间的差异。我们选择该显著性水平（α = 0.10）以降低II类错误的发生率，特别是在早期阶段的检测中，或当对尚未充分研究的行为终点和模式生物的生物学重要效应量了解有限时；这与生物医学科学中更常用的多重比较校正方法（例如，RNA-Seq数据的Bonferroni校正）有所不同26。未来还需进一步研究以明确这些行为反应的变异性，并据此可能调整实验设计（例如，增加重复数）27。

除化学暴露外，还有多种因素可能影响鱼类幼体的行为。例如，一天中的时间、幼体年龄、孔板孔径大小、温度、光照条件以及每孔中暴露溶液的体积都是需要重点考虑的因素11,30。因此，应采取预防措施，尽量减少实验过程中可能影响鱼类幼体运动行为的外部因素。行为观察应在较短的时间窗口内（3至4小时）进行，并选择一天中对幼体运动行为影响最小的时间段开展11。此外，在整个暴露期间，鱼类幼体应在温度可控的培养箱中维持恒定温度（斑马鱼为28 ± 1 °C，FHM为24 ± 1 °C），并保持固定的明暗循环周期。同时，进行行为记录的实验室温度也应维持在接近实验条件的水平，以避免温度对行为产生干扰。此外，用于行为观察的孔板各孔应为每条幼鱼保持一致的液体体积。

幼体和胚胎斑马鱼的运动反应（PMR）此前已在生物医学科学中用于识别新化合物的潜在治疗靶点12,13。本方案在以往斑马鱼行为学研究的基础上，利用38个终点指标来研究环境污染物的化学生物活性。尽管咖啡因是一种常见的水生污染物，其作用机制（MoA）已被充分阐明，但许多商用化合物仍缺乏关键的作用机制数据。因此，本方案可用于探究尚无毒性数据的化合物的作用机制，包括商用化学品39。此外，本方案还提供了两种最常用鱼类模型的研究方法。如前所述，斑马鱼是一种常见的生物医学鱼类模型，正日益广泛地应用于生态毒理学研究；而胖头鱥则常用于生态模型以支持环境评估应用，但在使用自动化系统进行的行为学研究方面，相较于斑马鱼仍受到较少关注。 尽管目前尚无标准化的鱼类行为毒理学研究监管方法，本方案为支持未来相关研究工作提供了一种可行途径。

在斑马鱼和黑头软口鱼模型中，咖啡因在水生环境中已检测到的浓度水平下引发了行为反应16。Rodriguez-Gil 等（2018年）基于咖啡因的实测值，建立了水生系统中的全球环境暴露分布谱16。具体而言，根据本研究的预测，95%的废水排放浓度将低于斑马鱼和黑头软口鱼最敏感行为终点的最低可见效应浓度（LOEC）（表2）。尽管在环境相关浓度下观察到斑马鱼出现多种行为效应（特别是在黑暗条件下），但尚不清楚这些行为改变是否会在自然鱼类种群中发生，或导致具有生态学意义的不良后果。虽然幼鱼行为阈值对于敏感性和诊断性筛查具有应用价值，但其可能无法代表其他生活史阶段或自然种群中鱼类的反应。有必要进一步研究，以确定在自然条件下是否会出现类似的行为反应阈值，并明确其是否可指示个体或种群水平上的不良生物学效应。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究得到了美国国家科学基金会（项目编号：CHE-1339637）的资助，以及美国环境保护局的额外支持。我们感谢Jone Corrales博士、Lauren Kristofco博士、Gavin Saari、Samuel Haddad、Bekah Burket和Bridgett Hill在实验室工作中的支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
ViewPoint ZebraboxViewPoint用于自动化行为观察的 ZebraLab 及 ZebraLab 平台
咖啡因Sigma-AldrichC0750-100G研究用化学品
培养箱VWR9110589为胖头 minnow 实验维持光照/黑暗循环和温度
培养箱Thermo Fisher Scientific35824-636为斑马鱼实验维持光照/黑暗循环和温度
100 mL 玻璃烧杯VWR89000-200斑马鱼暴露室 
500 mL 玻璃烧杯 PyrexEW-34502-03胖头 minnow 暴露室
5,000 µL 自动移液器EppendorfResearch 5000用于填充多孔板中的各个孔
移液管VWR414-004-004用于转移研究生物体 
48 孔板Fisher Scientific08-772-52幼体斑马鱼行为记录室
24 孔板VWR10062-896幼体胖头 minnow 行为记录室
二水合硫酸钙Sigma-AldrichC3771用于配制再生成硬水
硫酸镁Sigma-AldrichM7506用于配制再生成硬水
碳酸氢钠 Sigma-AldrichS5761用于配制再生成硬水
氯化钾Sigma-AldrichP9333用于配制再生成硬水
z-mod 循环系统Marine Biotech Systems用于维持斑马鱼培养的循环系统
统计分析软件Sigma Plot Version 13.0用于分析行为数据并生成图表
统计分析软件Graphpad PrismPrism 5用于生成图表 
自动进样器/四元泵系统Agilent TechnologiesInfinity 1260 model 咖啡因处理浓度的分析验证
喷流式热梯度电喷雾离子源Agilent Technologies咖啡因处理浓度的分析验证
三重四极杆质谱分析仪 Agilent TechnologiesModel 6420咖啡因处理浓度的分析验证
10 cm × 2.1 mm Poroshell 120 SB-AQ 色谱柱 (120Å, 2.7) Agilent Technologies685775-914T咖啡因色谱分析 
MassHunter 优化软件 Agilent Technologies确定咖啡因/咖啡因-d9 和副黄嘌呤/副黄嘌呤-d6 的电离模式、监测的离子跃迁及仪器参数

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检测幼鱼行为反应谱的实验方案：以神经兴奋剂咖啡因为例
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