通过全血流式细胞术分析表征人单核细胞亚群

摘要

本文介绍了一种通过全血流式细胞术对单核细胞亚群进行表征的实验方案。内容包括如何设门圈定各亚群、检测其表面标志物的表达水平，并以检测M1型（促炎）和M2型（抗炎）标志物的表达为例进行说明。

摘要

单核细胞在多种炎症性疾病中发挥关键作用，这些细胞的改变（包括其亚群比例和功能的变化）可能具有病理学意义。检测单核细胞改变的理想方法是全血流式细胞术，因为该方法对样本的操作最少，可最大限度减少人为因素导致的细胞活化。然而，目前在界定单核细胞亚群时存在多种不同的设门策略，导致不同研究之间亚群鉴定结果不一致。本文展示了一种利用全血流式细胞术鉴定和表征人单核细胞亚群（经典型、中间型和非经典型）的方法。我们详细说明了如何制备血液样本以进行流式细胞术分析、如何对亚群进行设门（确保已去除污染细胞），以及如何确定单核细胞亚群表面标志物的表达情况——在本示例中为M1和M2标志物。该实验方案可推广至其他需要标准化设门方法来评估单核细胞亚群比例及其功能标志物表达的研究中。

引言

单核细胞是一类白细胞，在促进和缓解炎症过程中发挥重要作用。目前公认有三种主要的单核细胞亚群：经典型（约占85%）、中间型（约占5%）和非经典型（约占10%），它们根据分化簇（CD）14和CD16的表达水平进行区分¹。单核细胞亚群的比例会因疾病状态而发生变化，例如在多种炎症状态下中间型单核细胞比例升高^2,3，包括心血管疾病，其中间型比例与临床事件相关^4,5。此外，在疾病条件下，单核细胞还可发生功能改变，许多此类变化可通过表面标志物表达的差异来检测^6,7。其中一个例子是单核细胞向M1极化，即与M1型巨噬细胞相关的标志物增加，这种现象已在心血管疾病、糖尿病、肥胖症和代谢综合征中被观察到^7,8,9,10。

尽管流式细胞术常用于评估单核细胞亚群的比例和功能，但不同研究在样本制备和亚群设门策略上存在较大差异，导致研究结果难以相互比较。尤为重要的是，目前对单核细胞亚群的界定尚无共识，然而鉴于多种疾病中亚群比例变化具有重要的临床意义，建立标准化的方法十分必要。设门困难的部分原因在于，单核细胞从经典型经中间型向非经典型逐步分化¹¹，因此单核细胞实际上呈连续分布谱系，而非截然不同的独立群体¹²。有趣的是，Zawada et al. 发现，无论采用矩形还是梯形设门方式定义中间型亚群，均能识别出较高比例的中间型单核细胞，并可预测心血管终点事件¹³。这表明，至少在计算比例时，关键问题在于不同样本（及不同研究）之间采用一致的设门策略，而非试图明确区分各亚群。尽管在评估功能时明确的设门可能更为重要，但各亚群间标志物表达的变化是渐进的^12,14，因此，设门的一致性可能仍是关键。因此，亟需一种客观且可重复的设门方法，能够在不同样本间稳定划分单核细胞亚群。本文所提出方法的目的在于，以清晰的解释和充分的依据进行单核细胞亚群设门，并检测各亚群的表面标志物表达水平，从而为研究人员在分析不同样本时提供一种可靠、可重复的技术方案。

方案

本研究已获得 WSLHD 人类研究伦理委员会（HREC）的批准（批准号 AU RED HREC/15/WMEAD/289）。

1. 全血流式细胞术的样本制备

注意：由于人血可能具有传染性，样本处理应在生物安全柜中进行。

1. 使用 3 mL 含乙二胺四乙酸（EDTA）的试管采集参与者的血液样本。
2. 使用血液分析仪或血细胞计数板测定白细胞（WBC）计数。
3. 用磷酸盐缓冲液（PBS）（pH ~7.4）稀释，调整浓度至约 5 × 10⁶ WBC/mL。
4. 根据所需试管数量配制足够的主混合液（例如，对于 14 支试管，配制 16 倍体积的主混合液），将 16 倍体积的 50 µL 血液、0.75 µL anti CD14-V450、0.5 µL anti CD16-APC 和 0.625 µL anti HLA-DR-PerCP 混合。涡旋混匀后，每管加入 51.9 µL 混合液（表 1）。
   注意：应进行抗体滴定，以确定所用荧光抗体的最佳染色浓度。
5. 加入表面标志物抗体（M1 和 M2 或同型对照，藻红蛋白（PE）标记）以及 T 细胞（CD3）、B 细胞（CD19）、中性粒细胞（CD66b）和自然杀伤（NK）细胞（CD56）的 PE 标记抗体（示例见 表 2 和 表 3）。涡旋混匀后，在 4 °C 避光孵育 30 分钟。
   注意：淋巴细胞、中性粒细胞和 NK 细胞的标志物仅用于验证设门方法。
6. 加入 250 µL 红细胞裂解/白细胞固定混合液，立即轻轻涡旋，于 4 °C 避光孵育 10 分钟。
7. 加入 250 µL PBS，于室温下以 260 × g 离心 10 分钟。
8. 弃去上清液，将细胞重悬于 300 µL 1% 甲醛溶液中。
   注意：甲醛有毒，操作时需佩戴腈手套并在通风橱中进行。
9. 于 4 °C 避光保存，直至进行分析。
   注意：建议在样本制备后 48 小时内完成流式分析。

2. 流式细胞术

1. 检查流式细胞仪日志，确保设施工作人员已执行质量控制检查。
   注意：为确保分析之间的一致性，建议使用对照微球进行仪器质量控制，并保持目标荧光强度的一致性。
2. 设置流式细胞实验时，点击“新建实验”，然后点击“新建样本”和“新建试管”以添加试管。通过点击图标选择双变量图，并使用下拉菜单选择坐标轴参数。确保包含 CD16/CD14 图以及一个检测器与时间的关系图，以监测数据采集过程。
3. 插入试管并点击“采集”。检查仪器电压设置，确保检测器信号未超出量程。
4. 观察细胞在 CD14/CD16 图中单核细胞门内的分布情况。将经典单核细胞门的记录阈值设为 5,000 个事件，然后点击“记录”。
5. 继续记录其余试管的数据。所有试管数据记录完成后，将流式数据导出为 .fcs 文件用于分析。
   注意：为确保准确性，应记录单色补偿对照。可在分析前计算并应用补偿矩阵，以校正光谱重叠^15,16。

3. 单核细胞设门

1. 在分析软件中打开文件。双击试管名称，从下拉菜单中选择参数，以在前向散射面积（FSC(A)）/前向散射高度（FSC(H)）图上显示细胞。通过点击多边形门控工具图标，并按照（图1A）所示方式圈选细胞，创建双细胞排除门。
2. 选择已设门的细胞（通过双击门控区域），在新显示框中调整下拉菜单参数，将细胞显示在FSC(A)/侧向散射（SSC(A)）图上。点击矩形门控图标，根据前向和侧向散射特性，宽泛地选择单核细胞群，以排除大部分淋巴细胞、NK细胞和粒细胞（图1B）。
3. 选择已设门的细胞，并使用下拉菜单选择参数，在CD14/CD16图上重新显示细胞。点击多边形门控工具，根据其特征性的“┐”形状选择单核细胞（图1C）。
4. 选择已设门的细胞，并使用下拉菜单选择参数，在CD16/HLA-DR图上显示单核细胞。点击多边形门控工具，选择HLA-DR阳性细胞，并排除残留的NK细胞和中性粒细胞¹⁷（图1D）。
5. 选择已设门的细胞，并使用下拉菜单选择参数，在CD14/HLA-DR图上显示HLA-DR阳性细胞。点击多边形门控工具，绘制门控以排除HLA-DR高表达/CD14低表达的细胞（B细胞高表达HLA-DR但不表达CD14）（图1E）。
   注意： 可能存在B细胞污染，因此应进行排查。如果图1C中的非经典型细胞群与其左侧细胞无法明显区分，则可能存在污染。若B细胞未与非经典型单核细胞重叠，可跳过步骤3.5。
6. 选择已设门的细胞，并使用下拉菜单将其显示在CD16/CD14图上。在图显示选项中选择“斑马图（Zebra plot）”，以便绘制单核细胞亚群门控以确定各亚群比例（图1F）。
   注意： 若分析软件中无斑马图选项，伪彩色（平滑）或等高线图亦可作为替代。
7. 点击矩形门控图标，围绕CD14高表达/CD16低表达的经典型单核细胞群大致绘制一个矩形门。在“Display”中选择“Show medians”，以显示经典型单核细胞的中位荧光强度。调整门控，使该细胞群在中位值左右分布均匀，并包含其左侧所有细胞。
8. 通过在经典型门控右侧绘制一个矩形门来选择中间型细胞群。调整门控底部，使其与完全位于经典型单核细胞门内的同心圆底部对齐，从而排除非经典型细胞，确保中间型亚群的CD14表达水平与主要经典型细胞群相当，符合当前命名规范。
9. 通过从中间型亚群门控的下边缘向下绘制一个矩形框，选择并设门非经典型亚群，包含该细胞群底部的所有细胞（图1F）。
10. 在“Display”中选择“Show gate frequencies”，以确定各单核细胞亚群的百分比。

4. 门控方法的验证

1. 为确定潜在的污染细胞类型是否被有效排除，首先使用针对T细胞（CD3）、B细胞（CD19）、中性粒细胞（CD66b）和NK细胞（CD56）的抗体鉴定不同的细胞群（图2）。
   注意：此处T细胞和中性粒细胞不位于单核细胞的“┐”形附近，已在图1C中被设门排除。
2. 确认NK细胞在步骤3.4中被去除（图1D），B细胞在步骤3.5中被去除（图1E），如图3所示。如果NK细胞或B细胞未被设门排除，请重新调整设门范围。

5. 单核细胞表型标志物表达

1. 从每个单核细胞亚群中选择细胞。调整下拉参数，为每个单核细胞亚群创建直方图（图1F），显示每个标志物及其对应的同型对照（图4）。
2. 计算每个标志物相对于相应同型对照的表达程度（中位数或几何平均值）。

结果

此处使用的单核细胞设门策略及流式细胞术分析（图1）成功区分了单核细胞亚群，并揭示了它们的相对比例。该样本中各亚群的比例计算结果为：经典型单核细胞占88.1%，中间型单核细胞占4.33%，非经典型单核细胞占7.49%。这些亚群设门未受到B细胞、T细胞、中性粒细胞或NK细胞的污染，这一点通过分别使用CD19、CD3、CD56和CD66b标记物得到了验证。通过评估其他细胞群的相对位置可以明确，在CD16/CD14图中，T细胞和中性粒细胞明显位于单核细胞“┐”形区域之外（图2A和2D）。然而，NK细胞和B细胞群均与非经典型单核细胞群存在部分重叠（图2B和2C）。设门策略的各步骤（图1D和1E）经确认可有效排除NK细胞（图3A）和B细胞（图3B）。尽管B细胞群中包含少量非经典型单核细胞，但其比例可忽略不计。

在分选各细胞亚群后，检测其对不同表面标志物的表达程度，其中M1型标志物包括CD64、CD86和CD120b，M2型标志物包括CD163、CD11b和CD93。与相应的同型对照相比，这些标志物均呈阳性表达，这可通过直方图的偏移明显观察到（图4）。各标志物的中位表达值均高于同型对照。

将此门控策略应用于一份分为四管的血样，经分别染色和分析后，各管之间的结果具有可比性（表4）。

图1：全人血中单核细胞门控策略的代表性示例。 (AFSC(A) 与 FSC(H) 图：通过设门选择面积与高度相等的细胞，从而去除细胞团块（FSC(A) 显著高于 FSC(H)）和碎片（FSC 极低），K = 1000。BFSC(A) 与 SSC(A) 图：根据单核细胞的 SSC/FSC 特性进行的广泛圈选。CCD16 与 CD14 图：通过特征性的“┐”形状设门以选中单核细胞。（D）CD16 与 HLA-DR 图：设门以选择 HLA-DR 阳性细胞并去除 NK 细胞。ECD14 与 HLA-DR：设门以排除B细胞（HLA-DR高表达/CD14低表达），从而分离单核细胞。F) 经选择的单核细胞在CD16上重新显示 与 CD14 图用于圈定单核细胞亚群。A-F 图中颜色表示细胞密度，蓝色和绿色代表低密度，红色和橙色代表高密度，黄色代表中等密度。 请点击此处以查看此图的放大版本。

图2：通过鉴定潜在污染细胞验证设门策略。 通过标记物鉴定潜在污染细胞 (AT细胞（CD3），（BB细胞（CD19），（C) 自然杀伤细胞（CD56）和（D) 中性粒细胞（CD66b）。左侧图示为按照设门策略鉴定各细胞群的结果 图1A 和 1B，颜色表示细胞密度，从高（红色）到低（蓝色）。右侧图层面板显示各细胞群（蓝色）叠加在最终的单核细胞CD16/CD14图上，以揭示这些细胞群与单核细胞（红色）的接近程度。 请点击此处以查看该图的放大版本。

图3：验证设门步骤可有效去除污染细胞。 热图显示了（A）CD56 和（B）CD19 表达水平从高（红色）到低（蓝色）的分布情况。设门步骤成功排除了高表达 CD56 的细胞（NK细胞）和高表达 CD19 的细胞（B细胞）。请点击此处查看此图的放大版本。

图4：单核细胞M1（CD120b）和M2（CD93）标志物的表达。 单核细胞M1和M2标志物表达的平滑直方图（蓝色）显示，与同型对照（红色）相比，（A）经典型、（B）中间型和（C）非经典型均出现明显偏移。 请点击此处查看该图的放大版本。

抗体	体积（50 µL 血液）	体积（16倍）800 µL 血液
CD14 - V450	0.75 µL	12 µL
CD16 - APC	0.5 µL	8 µL
HLA-DR-PerCP	0.625 µL	10 µL

表1：全血流式及主混合液所用抗体。

试管	PE 抗体	货号	同型对照	储存浓度	工作体积
1	IgG1	BD (555749)	NA	1.0 µg/20 µL	0.625 µL
2	CD163	BD (556018)	BD IgG1	0.125 µg/20 µL	5 µL
3	CD64	BD (558592)	BD IgG1	0.06 µg/20µL	10 µL
4	IgG1	BD (555749)	NA	1.0 µg/20 µL	1.25 µL
5	CD86	BD (555658)	BD IgG1	1.0 µg/20 µL	1.25 µL
6	CD11b	BD (561001)	BD IgG1	1.0 µg/20 µL	1.25 µL
7	IgG2a	R &D (IC003P)	NA	25 µg/mL	5 µL
8	CD120b (TNFRII)	R &D (FAB226P)	R &D IgG2a	25 µg/mL	5 µL
9	IgG1	BL (400112)	NA	0.2 mg/mL	2.5 µL
10	CD93	BL (336108)	BL IgG1	50 µg/mL	1.25 µL

表2：用于全血流式的M1/M2-PE荧光标记单克隆抗体。

试管	抗体	工作体积
11	CD3	5 µL
12	CD19	5 µL
13	CD66b	1.25 µL
14	CD56	5 µL

表3：用于淋巴细胞（T细胞、B细胞）、中性粒细胞和NK细胞的PE荧光素标记单克隆抗体。

试管	经典型百分比	中间型百分比	非经典型百分比
1	84.3	5.11	10.1
2	84.2	5.05	10.5
3	84.3	5.03	10.7
4	81.6	5.03	12.1

表4：一份血液样本经分别染色和分析后得到的单核细胞亚群比例。

讨论

全血流式细胞术是研究单核细胞的理想方法，因为该方法在接近其生理微环境的条件下检测细胞，有助于深入了解单核细胞在感染和炎症状态中的作用。此外，使用新鲜（即未经处理的）血液样本可最大程度减少因储存或操作引起的细胞改变或转化^18,19，例如已知的冻融过程对单核细胞造成的影响²⁰。建议尽快进行样本处理，因为在处理前将样本置于室温下可能导致某些标志物表达上调¹⁹。M1和M2标志物的最佳浓度通过滴定确定，对于任何新抗体都应进行滴定，以限制非特异性结合，同时确保检测到的信号偏移程度反映的是抗原表达水平，而非抗体不足所致。使用裂解液去除红细胞并固定白细胞是本实验方案中的关键步骤，因为红细胞的存在可能干扰流式细胞术检测结果^21,22。需要注意的是，尽管某些裂解液适用于免洗涤染色流程，但在本实验中，加入洗涤步骤后所获得的细胞群体更为清晰。

在比较单核细胞标志物表达时，流式细胞仪的正确设置也至关重要。我们建议研究人员保持对照微球的目标荧光强度一致，并对所用仪器进行质量控制，以确保在不同日期检测不同样本时结果的一致性。此外，同型对照可用于帮助解读由非特异性抗体结合产生的非特异性背景信号。单核细胞表面Fc受体表达水平较高¹¹，因此容易发生非特异性结合。值得注意的是，不同单核细胞亚群的非特异性结合水平存在差异，因此在比较不同亚群间标志物表达程度时，使用同型对照尤为重要。

另一个需要考虑的重要标准是设门步骤的采用。一些研究表明，在FSC(A)/SSC(A)图中对单核细胞群设置严格的门以去除大多数非单核的CD16阳性细胞至关重要^23,24,25，但这可能导致部分单核细胞丢失，因为非单核细胞在FSC/SSC图上可能与单核细胞存在重叠²⁶。相反，为了排除可能污染单核细胞的其他血细胞，除CD14和CD16外，加入第三个单核细胞标记物是必要的^26,27。因此，HLA-DR常被使用，且是理想的选择，因为NK细胞和中性粒细胞不表达HLA-DR^17,28。尽管淋巴细胞（B细胞和T细胞）可能表达HLA-DR，但它们在CD14表达方面与单核细胞不同。虽然HLA-DR是理想的第三个标记物，CD86也曾被推荐使用^5,27,29，但本文未采用，因为CD86同时也是M1型极化的标志物，因此本研究旨在评估其在不同单核细胞亚群上的表达水平。

验证所用设门策略至关重要。尽管已知自然杀伤细胞（NK细胞）若未被设门排除，可能与非经典单核细胞存在重叠²⁸，但我们注意到B细胞也可能与非经典单核细胞重叠（图2B）；这种情况在其他研究中是否出现，可能取决于荧光染料的选择、仪器配置、检测器灵敏度，甚至所研究的疾病状态。在此，重叠的B细胞表现出高水平的HLA-DR表达，在图1D中选择HLA-DR阳性细胞时并未将其排除。相反，为去除B细胞，我们额外使用了CD14/HLA-DR的散点图，利用B细胞HLA-DR表达较高而CD14表达较低的特性，使其与非经典单核细胞区分开来。

在文献中，针对单核细胞亚群本身的设门方式也有多种不同方法，包括使用象限法（通过象限标记将亚群分隔开）、矩形或梯形框选法¹³（为每个亚群单独绘制框选区域），这些方法在框选位置上也存在差异，从而决定了某一亚群的终点与另一亚群的起点。这些差异可能反映了单核细胞实际上是一个从经典型向非经典型逐步分化的连续细胞群体，而非截然不同的独立亚群。然而，由于识别亚群的技术差异可能导致计算出的单核细胞亚群比例不同，因此设门方法应尽可能采用客观标准而非主观判断，以提高方法的稳健性和可重复性。一些研究使用CD16的同型对照来确定经典型与中间型亚群之间的边界³⁰。另一方面，对于中间型与非经典型亚群之间的分界，有研究建议可采用垂直或倾斜的分界线，具体选择由研究者决定，但前提是该方法必须具有可重复性；不过，为便于不同研究之间的比较，推荐使用矩形设门^13,30,31。本研究中，通过使用斑马图（zebra plot）并应用客观的视觉判读规则，提高了设门的客观性，因为斑马图在传统等高线图的基础上，为每个等概率区间叠加了颜色梯度，提供了额外的可视化线索。经典型亚群的右边界设定为使该群体在其种群中位数周围均匀分布。中间型与非经典型亚群之间的划分也进行了标准化处理，即中间型亚群的基部与经典型群体内同心圆的底部对齐（i.e., 中间型亚群明显高表达CD14，符合标准命名规范¹）。

尽管一些研究建议使用额外的标志物（如C-C趋化因子受体2型（CCR2）或6-磺酸基乳糖-N-乙酰氨基葡萄糖（SLAN））来成功地对单核细胞进行计数并揭示其临床意义^32,33，但在我们实验室中，许多单核细胞功能标志物的表达水平在不同个体间存在广泛差异¹⁴。这种变异可能限制了这些标志物在基于表达水平定义细胞亚群方面的实用性。此外，已有研究采用自动化的计算方法来可视化和聚类单核细胞亚群，包括可视化交互式随机邻域嵌入（viSNE）、t-分布随机邻域嵌入（tSNE）或基于密度归一化事件的生成树进展分析（SPADE）^34,35，这些方法可根据所使用的多种标志物组合提供细胞的可视化图谱。虽然这些方法已被证明可提高单核细胞亚群分类中设门策略的准确性，但其缺点在于需要使用大量抗体（及相应的荧光素通道）。该方法的适用性取决于具体研究问题；例如，在细胞计数研究中，增加的实验复杂性可能并无必要。

采用本技术分选的单核细胞，其比例与文献报道一致，且可清晰确定三个亚群表面标志物的表达。总体而言，本文所述技术与方法为单核细胞亚群比例计数及表面标志物表达分析提供了标准化且简便的方案，该方法亦可扩展用于其他标志物的检测，从而验证其在多种不同条件下的功能作用。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
BD 真空采血管套装	Becton Dickinson	367286
BD 真空抗凝采血管（含 K2E 5.5 mg），3.0 mL	Becton Dickinson	7128959
磷酸盐缓冲液（PBS）	Lonza	17-516F
5 mL 聚苯乙烯圆底 FACS 管（12 mm × 75 mm 型）	Invitro technologies	352054
V450 标记小鼠抗人 CD14 抗体 [MφP9]	BD Biosciences	560349
APC 标记小鼠单克隆抗 CD16 抗体 [3G8]	Abcam Australia	ab140477
PerCP 标记抗人 HLA-DR 抗体 [L243]	BioLegend	307628
PE 标记小鼠 IgG1 κ 同型对照抗体 [MOPC-21]	BD Biosciences	555749	批号 # 4283901
PE 标记小鼠抗人 CD163 抗体 [GHI/61]	BD Biosciences	556018	批号 # 2335626
PE 标记小鼠抗人 CD64 抗体 [10.1]	BD Biosciences	558592	批号 # 36768
PE 标记小鼠抗人 CD86 抗体 [2331 (FUN-1)]	BD Biosciences	555658	批号 # 3109766
PE 标记小鼠抗人 CD11b/Mac-1 抗体 [ICRF44]	BD Biosciences	561001	批号 # 3228959
PE 标记小鼠 IgG2A 同型对照抗体 [20102]	R&D Systems	IC003P	批号 # 1212031
PE 标记人 TNF RII/TNFRSF1B 抗体 [22235]	R&D Systems	FAB226P	批号 # 612051
PE 标记小鼠 IgG1 κ 同型对照抗体 [MOPC-21]	BioLegend	400112	批号 # B220359
PE 标记抗人 CD93 抗体 [VIMD2]	BioLegend	336107	批号 # B143544
PE 标记小鼠抗人 CD3 抗体 [SK7]	BD Biosciences	347347	批号 # 3010929
PE 标记小鼠抗人 CD19 抗体 [HIB19]	BD Biosciences	561741	批号 # 2307721
PE 标记小鼠抗人 CD56 抗体 [B159]	BD Biosciences	561903	批号 # 3011796
PE 标记抗人 CD66b 抗体 [G10F5]	BioLegend	305105	批号 # B154037
OptiLyse C	Beckman Coulter	A11895
37% 甲醛溶液	Sigma	F1635
BD FACSCanto II 流式细胞仪	BD Biosciences
全自动血液分析仪 XT-1800i	Sysmex
GS-6R 离心机	Beckman
FlowJo 软件 v10.0.7	Tree Star Inc