通过整合结构质谱法分析蛋白质结构与蛋白质-配体复合物

摘要

质谱法（MS）已成为研究大分子组装体结构与动态的重要工具。本文整合了基于质谱的方法，用于探究蛋白质复合物的形成及配体结合。

摘要

蛋白质是一类重要的生物大分子，在细胞功能中发挥多种关键作用，包括基因表达、催化代谢反应、DNA修复与复制等。因此，深入理解这些过程可为细胞功能机制提供关键信息。整合性结构质谱（MS）方法能够提供有关蛋白质复合物组装、复合物连接性、亚基化学计量比、蛋白质寡聚化以及配体结合等方面的结构与动态信息。近年来，整合性结构质谱技术的进步使得对具有挑战性的生物体系（如大型DNA结合蛋白和膜蛋白）的表征成为可能。本实验方案描述了如何将多种质谱数据（如天然质谱和离子淌度-质谱联用技术，IM-MS）与分子动力学模拟相结合，以深入研究一种解旋酶-核酸酶DNA修复蛋白复合物。该整合方法为深入研究其他参与重要生物学过程的蛋白质复合物的配体结合提供了可行的分析框架。

引言

完整蛋白质及其复合物的原生质谱分析采用电喷雾和纳米电喷雾电离（nESI）技术，这些方法在电离过程中可保持蛋白质的折叠结构及非共价相互作用^1,2。在原生质谱（native MS）中，蛋白质及其复合物的结构在气相中以接近天然的状态得以保留^3,4。原生质谱可检测到多种带电荷的蛋白质离子，这些离子根据其质荷比（m/z）被分离，从而可计算出蛋白质或蛋白质-配体复合物的质量。该信息可用于确定完整蛋白质的化学计量比、亚基组成、配体结合情况以及相互作用网络^3,4,5,6。与其他技术（如X射线晶体学和核磁共振波谱法）相比，原生质谱具有多项优势⁵。首先，原生质谱是一种快速且高度敏感的技术，仅需数微升（2–3 µL）样品，且样品中复合物的终浓度可低至数个高nM至低µM范围⁶。其次，原生质谱可用于分析异质性蛋白质样品，从而能够同时检测多种蛋白质及寡聚状态。第三，原生质谱在分析前无需对蛋白质样品进行化学交联或蛋白标记等修饰。这些优势使结构质谱成为研究蛋白质复合物结构的有力工具。

原生质谱可与离子淌度（IM）联用，后者是一种测量蛋白质离子在电场中穿行所需时间的技术，从而能够确定碰撞截面（CCS）。CCS可提供低分辨率的结构信息，有助于获取蛋白质的拓扑结构和构象异质性信息。此外，该方法还可用于检验通过计算方法生成的蛋白质结构模型。

可通过离子迁移谱-质谱法（IM-MS）测量的碰撞诱导去折叠（CIU）来研究蛋白质气相稳定性。在CIU过程中，蛋白质离子在质谱仪内被加速，并通过与惰性缓冲气体发生更频繁的加速碰撞而被活化^7,8,9。这种碰撞活化过程会导致蛋白质部分去折叠，表现为碰撞截面（CCS）增大。该CCS变化及使蛋白质去折叠所需的能量可通过IM-MS进行测量。利用此方法，可测定配体结合对蛋白质稳定性的影响¹⁰。可通过溶液中断裂方法（例如添加有机溶剂）在溶液中生成亚复合物，以监测蛋白质复合物的类天然拓扑结构。蛋白质复合物的解离主要源于其内部非共价相互作用的破坏。这些亚复合物保持类天然的拓扑结构，在质谱检测时可揭示亚基间的连接信息。

结构生物学中的整合方法结合了多种技术，用于研究蛋白质及其复合物的结构与动态特性^3,4,5,6。原生质谱（Native MS）和离子迁移谱-质谱（IM-MS）已被用于揭示具有挑战性的生物系统的分子细节。已有多个应用实例，包括蛋白质组装途径的研究^11,12,13,14、蛋白质-蛋白质相互作用网络的分析^15,16,17、膜蛋白的研究^{6,18,19,20,21}，以及蛋白质-配体相互作用（如核酸）的研究^22,23,24。

然而，原生质谱（native MS）也存在其局限性。原生质谱测量通常在挥发性缓冲液（如乙酸铵水溶液）中进行，而某些蛋白质在此类缓冲液中无法保持其折叠的天然构象^3,25。尽管如此，近期研究表明，通过优化喷雾针尖直径（使用0.5 mm针尖），可直接从高离子强度的非挥发性缓冲液中生成蛋白质及蛋白质复合物离子，从而克服这一限制，且此类缓冲液更接近生理环境²⁶。此外，原生质谱利用电喷雾技术将非共价复合物从溶液中电离并转移至气相，因此所检测到的复合物相对丰度可能无法完全反映其在溶液中的真实情况^5,27。而且，与溶液环境相比，气相中疏水相互作用减弱，而静电相互作用增强并因此更占优势^3,28。

本文提供了利用天然质谱（native MS）、离子迁移质谱（IM-MS）、碰撞诱导解离（CIU）、溶液中断实验及建模方法进行蛋白质鉴定与配体结合研究的实验方案、数据分析与结果解读。以DNA修复复合物HerA-NurA作为模型系统。DNA双链断裂（DSBs）是最具细胞毒性和危害性的DNA损伤形式之一，可导致基因组不稳定，并最终引发人类癌症。同源重组是清除DSBs的主要修复机制，该过程由依赖ATP的解旋酶-核酸酶复合物HerA-NurA所调控²²。

结合天然质谱、离子迁移质谱与功能实验及建模分析，可研究以下内容：i）NurA在复合物组装、构象及稳定性中的作用；ii）双链DNA与复合物之间的相互作用及其对复合物整体稳定性的影响；iii）ATP结合的化学计量比及其对复合物组装的影响²²。总体而言，本研究通过将蛋白质复合物的构象变化和稳定性与核苷酸结合关联起来，加深了对HerA-NurA复合物分子机制的理解。该方案适用于任何与一种或多种配体类型相互作用的蛋白质复合物。

方案

1. 蛋白质及蛋白质-配体复合物天然质谱分析的样品制备

注意：为了通过原生质谱法（native MS）理解蛋白质复合物与配体结合的分子基础，合适的样品制备至关重要。本节旨在以结合DNA和核苷酸的HerA-NurA复合物为例，重点介绍质谱分析前必需的样品制备步骤。

1. 在1.5 mL离心管中制备浓缩纯化蛋白的20 µL分装液（通常浓度为15–30 µM）。
2. 用于ATP或ADP结合分析
   注意：加入浓度递增的不可水解ATP类似物——腺苷5′-O-(3-硫代三磷酸)四锂盐（ATP-γ-S）或腺苷5′-二磷酸（ADP）。不可水解的ATP衍生物可形成稳定的复合物，从而使得ATP结合态蛋白能够被捕获。其他可测试的不可水解ATP类似物包括AMP-PNP和ATP-γ-S-Mg²⁺。
   1. 对于HerA-NurA的研究，将5 µM纯化蛋白与ATP-γ-S和ADP在0–1 mM范围内不同浓度下混合。
   2. 为捕获ATP-γ-S与ADP的同时结合，可在相同或不同浓度下同时加入两种核苷酸。
   3. 加入2 mM MgCl₂，在25 °C干浴孵育器中孵育1小时。
      注意：使用nESI原生质谱（native MS）分析核苷酸结合时，高浓度下可能出现假性结合信号，因此必须考虑非特异性结合的影响²⁹。为研究非特异性结合，可加入2–5 mM之间的较高浓度核苷酸进行对照。
3. 用于DNA结合分析
   1. 以允许蛋白-DNA复合物形成的摩尔比混合蛋白与DNA。对于HerA及HerA-NurA，将5 µM纯化蛋白与DNA按1:1摩尔比混合。
   2. 将HerA-NurA或HerA-DNA混合物在25 °C干浴孵育器中孵育30分钟，直至达到结合平衡。孵育时间和温度可根据所研究蛋白的不同而调整。
   3. 将蛋白样品置换至适合质谱检测的缓冲液。通常使用pH 7–8、浓度在5 mM–1 M范围内的乙酸铵水溶液。其他适用于质谱的缓冲液包括乙二胺二乙酸盐（EDDA）和三乙胺乙酸盐（TEAA）³⁰。对于HerA-NurA研究，使用pH 7的200 mM乙酸铵溶液。
      注意：质谱分析前有多种缓冲液置换方法，例如使用离心浓缩管或层析柱。原生质谱的结果在很大程度上受限于样品质量，例如纯化过程中使用的缓冲液和加合物。因此，必须充分脱盐以获得分辨良好的质谱峰。
   4. 对于HerA-NurA配体结合研究，使用浓缩管将样品用200 mM乙酸铵缓冲液进行6–8次缓冲液置换。尽管该方法耗时较长，但可确保获得分辨良好的质谱峰，并实现对ATP/ADP结合物种的准确质量测定。

2. 用于研究蛋白质复合物和蛋白质-配体复合物的原生质谱采集与分析

注意：应优化质谱条件以获得高分辨峰，从而实现精确的质量测定。本节详细介绍了配备32k上限m/z四极杆的Q-ToF质谱仪上的优化参数。

1. 自制纳米电喷雾用毛细管，并按照Kirshenbaum所述方法进行仪器质谱校准，以实现精确的质量测定 等人¹.
2. 选择灵敏度、正离子采集模式和迁移率飞行时间（TOF）模式。
3. 打开捕集阱、API 和 IMS 气体。进行离子淌度分离时，初始氮气流速设为 60 mL/min，捕集区域氩气流速设为 8.4 mL/min，随后根据需要进行调整。
4. 设置合适的质荷比（m/z）采集范围。对于未知蛋白质，初始优化步骤应使用较宽的范围，例如 500–32,000 m/z。
5. 将待分析的蛋白质复合物溶液 2-3 µL 加载至镀金毛细管中，并将其插入毛细管支架。
6. 轻轻拧紧毛细管，将毛细管置于电喷雾离子源样品台上，滑动样品台至指定位置，开始采集数据。
7. 施加低纳流气体压力（0.00–0.05 Bar），直至毛细管尖端形成液滴。随后可逐步降低纳流压力，直至维持稳定喷雾。
8. 通过调节毛细管在 x、y、z 方向的位置来调整其相对于锥体的位置，并监测离子流以获得稳定的离子电流。施加 0.9–1.6 kV 范围内的毛细管电压。
9. 设置采样锥电压（50–120 V）、源偏置电压（60.0）、源温度（25 °C）和锥孔气体流量（0.0 L/h）。这些推荐的初始条件可根据需要进行调整。
10. 为获得分辨率良好的质谱图并最大化离子传输效率，需调整质谱参数并监测谱图变化。具体包括调节捕集池（2–8 mL/min）、氦气碰撞池（180 mL/min）和离子迁移率分离池（90 mL/min）中的气体流速，以在最高离子传输效率下实现最佳分离效果。
11. 如果电压偏移不足，请调整阱式碰撞能量。最佳起始范围为10-50 V。
    注意：提高捕获能量可去除非共价结合的加合物，但需注意避免发生碰撞诱导解离以及蛋白质-配体复合物的去折叠。进行离子淌度测量以确认仪器条件是否能使蛋白质保持天然折叠状态（步骤3）。
12. 通过优化捕集偏置电压来改善去溶剂化效果。最佳起始范围为 20–45 V。
13. 优化波速和波高以实现最佳的迁移率分离。详细的解释和操作步骤可在此处找到³¹对于 HerA-NurA 研究，使用 40 m/s 的波速和 550–650 V 的波高。
14. 使用仪器的其余默认参数。
15. 每次运行时准备一份无配体的样品作为对照用于分析（图1）。对于配体结合实验，需进行至少三次独立测量。
16. 使用 Masslynx 软件测定生成物的质量，鉴定配体结合情况（如 ATP 和 ADP 结合）以及寡聚状态图2 和 3。其他可用软件包括 UniDec³²，PULSAR³³ 和多毛纲虫属（Amphitrite）³⁴.
17. 为量化各物种的相对丰度，使用原始电喷雾电离质谱（ESI-MS）谱图中对应的离子强度（例如配体结合态、不同寡聚体） 等等.）或者，使用专用软件（如 UniDec 和 Massign）进行定量分析。³⁵ (图1 和 3 ).

3. 获取与分析离子迁移谱-质谱（IM-MS）

注意：离子淌度质谱（IM-MS）根据离子在气相中的尺寸（质量）、形状和电荷对其进行分离。质荷比（m/z）谱图中每个可分辨的特征均对应一个漂移时间分布。IM-MS测量离子的漂移时间，该时间可用于计算碰撞截面（CCS）。利用漂移管获得的IM-MS数据所测得的漂移时间值可与CCS值呈线性相关³⁶。对于行波离子淌度质谱（TWIMS）测量，计算CCS值需要利用已知CCS值的蛋白质标准品建立校准曲线³⁷。由于紧凑结构与迁移池中缓冲气体的相互作用较少，其迁移速度比扩展或伸长结构更快³⁸。因此，IM-MS可用于检测天然折叠结构在气相中是否得以保持^39,40。本节概述了如何使用TWIMS测量IM-MS并计算蛋白质的CCS值。

1. 在优化仪器条件以实现稳定传输后（步骤 2），在保持良好谱图质量的前提下，尽可能降低碰撞能量和采样锥电压。
2. 使用已优化的波速和波高获取离子淌度-质谱（IM-MS）数据（步骤 2）。
3. 在保持相同波高的条件下（例如，40 V），在三种不同的波速下（例如，550、600 和 650 m/s）测量离子的漂移时间。
4. 为确定蛋白质离子的碰撞截面（CCS），需在与待测蛋白质相同的仪器条件下测量蛋白质校准物。最佳漂移时间校准需要使用已知CCS值的蛋白质进行测量。
   1. 选择四种校准物，其中两种质量高于待测蛋白质，另两种质量低于待测蛋白质³⁷。最重要的是，确保所用波高和波速与待测蛋白质测定时的参数一致。
5. 可手动计算CCS值⁴¹，或使用专用软件如PULSAR³³和Amphitrite³⁴进行计算（图 5）。
6. 为判断蛋白质在气相中是否保持类天然构象，需将实验测得的CCS值与基于高分辨率结构计算得到的理论CCS值进行比较。对于HerA-NurA，可采用MOBCAL软件中使用的投影近似法（PA）计算理论CCS值⁴²。其他方法包括轨迹法（TM）⁴²和精确硬球散射法（EHS）⁴³。

4. 用于原生质谱和离子迁移质谱引导结构测定的溶液内蛋白质复合物解离

注意：在某些情况下，蛋白质亚复合物可从与完整复合物相同的溶液中鉴定出来。然而，通过破坏溶液中的蛋白质相互作用以形成亚复合物，可以获得更进一步的结构信息，例如亚基间的连接性及复合物的组装方式。实现这一目的的方法有多种，例如添加有机溶剂、提高离子强度或调节pH值。为了深入了解HerA-NurA复合物的亚基连接性与复合物组装，本研究通过添加能够干扰亚基相互作用的溶剂，在溶液中生成了亚复合物。

1. 按照步骤1所述方法制备蛋白质样品，并将缓冲液置换为乙酸铵。
2. 以10%为增量，逐步加入10-40%的溶剂。常用的溶剂包括甲醇（MeOH）、二甲基亚砜（DMSO）或乙腈（ACN）。
   注意：此步骤可在聚丙烯微量离心管中进行。
3. 将混合物在冰上孵育1小时。
4. 对每种条件（步骤2和步骤3）获取离子淌度-质谱（IM-MS）谱图（图4）。
5. 使用SUMMIT软件⁴⁴对蛋白质亚复合物进行指认并构建蛋白质相互作用网络。或者，手动列出预期物种的理论质量表。
6. 为确认亚复合物处于折叠状态，需计算各亚复合物的实验碰撞截面（CCS）值，并按照步骤3所述方法与理论CCS值进行比较（表1、图5和图6）。

5. 使用碰撞诱导解折叠（CIU）研究蛋白质复合物的稳定性

注意：CIU 可用于探测配体结合后蛋白质及其复合物的结构稳定性。随后可使用专业软件包（如 PULSAR³³、Amphitrite³⁴ 和 CIU suite⁹）对目标蛋白质在有无配体存在条件下的气相去折叠过程进行建模。例如，本节概述了监测 HerA-NurA 复合物气相去折叠轨迹、并研究 DNA 和 ATP 结合对该复合物稳定作用的实验流程。

1. 在2-10 V的增幅范围内，逐步将捕集器加速电压从10 V升高至200 V，同时记录离子迁移率-质谱（IM-MS）数据，以在气相中逐步展开蛋白质。
   注意：记录更小的增量会产生更多待处理的数据文件，但该方法可提供分辨率更高的解折叠曲线，这对于分析折叠态与解折叠态之间的转变点至关重要。
2. 使用 PULSAR 分析获取的数据³³，多毛纲蠕虫属名双栉虫属³⁴ 或 CIU 套件⁹ 并生成以碰撞截面（CCS）为单位、作为加速电压函数的二维展开图步骤 3）。对于每种电荷态，这是通过在每个加速电压下叠加强度归一化的碰撞截面（CCS）分布而得到的图7 A-Bi).
3. 使用其中一个软件包生成理论去折叠图谱。数据将被拟合至去折叠模型，从而可量化发生去折叠转变时的碰撞能量，并确定蛋白质在有或无结合配体情况下的稳定性。³³去折叠转变是指一个物种根据其实验测得的碰撞截面（CCS）值，从一种状态转变为另一种具有较大CCS的状态。
4. 为了量化这些转变，使用 PULSAR 等算法和软件计算状态之间的转变中点。³³。这通常以变异系数（CV）表示₅₀即特定状态被耗尽50%时的碰撞（捕获）电压值。
5. 使用CV₅₀ 值，使用质心碰撞能量（KE）计算离子的总内能_COM)⁴⁵. KE_COM 由离子解折叠转变过程中可利用的总内能定义，并根据碰撞伙伴（蛋白质离子和中性气体）的动能和质量，按照公式（1）计算得出¹⁰
   KEcom (eV) = （公式 1）
   何处 Z 是离子电荷，M_N 为中性气体的质量，M_离子 是蛋白质离子的质量。
   注意：这是因为蛋白质的电荷依赖性CIU46,47。建议进行KE_COM 分析至多个电荷态（ 图7Aii).

6. 整合质谱中用于差分分子动力学模拟的建模流程

注意：利用蛋白质亚基或复合物的模型（例如来自晶体结构的模型），可通过差异分子动力学模拟（含配体与不含配体的蛋白质复合物）来确定配体存在对蛋白质结构和动力学的影响。本节详细说明进行差异分子动力学模拟所需建模步骤的工作流程及所需工具。

1. 鉴定构成该复合物的亚基图8A, 在步骤2和步骤3中）。参考现有亚基模型， 例如， 来自 RCSB 数据库（https://www.rcsb.org）的晶体结构。蛋白质的 UniProt 条目将包含已知晶体结构/NMR 结构的列表（http://www.uniprot.org）。如果这些结构不可用，可将理论序列输入 BLAST 以识别同源建模的合适模板（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/）。
2. 以正确的拓扑结构组装复合物（图8A-ii）。这可以通过多种方法实现。可将各个亚基拟合到EMDB中提供的电子显微镜图谱（https://www.ebi.ac.uk/pdbe/emdb/）中，以组装完整的复合物。使用分子动力学柔性拟合（MDFF）将PDB结构拟合到电子显微镜图谱的教程可在此处找到：http://www.ks.uiuc.edu/Training/Tutorials/science/mdff/tutorial_mdff-html/。
3. 鉴定复合物中缺失的区域（图8A-iii）。在PDB序列与理论序列之间进行多序列比对（MSA），以识别可能未被拟合到晶体结构中的残基，或源自晶体学实验的任何突变。可使用如T-Coffee（http://tcoffee.crg.cat/apps/tcoffee/do:regular）等网络服务器进行MSA。
4. 通过同源建模补全缺失的残基图8A-iv). 可使用 MODELLER 程序（https://salilab.org/modeller/）构建蛋白质复合物中缺失的残基。MODELLER 可输出包含 n 个不同重构构象的模型集合。可通过其离散优化蛋白质能量（Discrete Optimised Protein Energy, DOPE）评分来识别优质模型。软件官网提供了详细的使用教程（https://salilab.org/modeller/tutorial/）。
5. 对蛋白质复合物进行差分分子动力学（MD）模拟图8B以鉴定蛋白质中对特定环境变化产生响应的区域， 例如， 配体存在下的行为变化。在这些模拟中，以仅含蛋白质的模拟A（作为参照）的行为参数为基准，从含蛋白质与配体的模拟B中减去该基准值。通过计算模拟A与模拟B之间的差分均方根涨落（RMSF），可揭示蛋白质在配体依赖性条件下柔性增强或减弱的区域。
   1. 使用 GROMACS（http://www.gromacs.org）进行分子动力学模拟及后续分析。相关教程可访问：http://www.bevanlab.biochem.vt.edu/Pages/Personal/justin/gmx-tutorials/Lysozyme/index.html。为消除模型偏差，应首先构建配体结合复合物的结构，然后从中复制该蛋白结构但去除配体，从而获得与配体结合状态一致的蛋白模型。 

结果

天然质谱结果揭示了HerA-NurA复合物的寡聚状态、组成及拓扑结构（图1）。由于非共价相互作用在气相中得以保留，对ATP-γ-S和ADP滴定实验进行的天然质谱分析确定了核苷酸与HerA-NurA的成对结合情况（图2），并表明提高ATP-γ-S浓度会增加六聚体HerA的相对强度（图3）。通过溶液中断裂实验结合天然质谱获得了有关亚基相互作用的结构信息，结果与理论质量相符（图4 和表1）。

蛋白质及其复合物的实验碰撞截面（CCS）值源自离子迁移质谱（IM-MS）实验（图5）。这些值是对分子形状的旋转平均气相横截面积的计算，用于描述蛋白质的构象状态。将CCS值与X射线晶体学获得的理论测量值进行比较，若两者吻合良好，则表明蛋白质的天然构象在气相中得以保留（表1）。这验证了使用CCS值构建蛋白质组装体低分辨率模型的可行性⁴⁸。

可针对每种电荷态离子计算实验碰撞截面（CCS）。具有天然构象的蛋白质构象体可能产生CCS值相近的电荷态离子。然而，较高电荷态离子的库仑排斥作用增强，可能导致蛋白质在气相中发生去折叠，从而使其CCS值大于理论CCS值。因此，通常采用最低电荷态离子的CCS值⁴⁹。对于HerA-NurA复合物，溶液中的解离实验（针对HerA以及有或无DNA存在下的HerA-NurA）提示其组装路径始于单体，随后逐步形成完整的六聚体HerA（HerA₆）与二聚体NurA（NurA₂）在DNA存在下的复合物（图6）。

apo（无配体）状态与配体结合状态之间CIU解折叠曲线的差异，定义了配体结合后复合物稳定性的变化。较高的CV₅₀ 或KE_COM值表明气相中离子的稳定性更高。CIU和KE_COM分析显示，DNA结合态的HerA-NurA复合物比无DNA的复合物更稳定（图7Aii）。在各自ATP结合状态下的CIU-MS分析表明，结合四个ATP-γ-S的状态会降低复合物在气相中的稳定性，而所有结合位点均被占据的六分子ATP-γ-S结合状态则最为稳定（图7Bii）。_native MS_可以揭示HerA的离散核苷酸结合状态；然而，它无法区分是哪些HerA亚基结合了ATP以及结合发生的具体位置。这些信息可通过针对六聚体HerA及HerA-NurA复合物进行的显式溶剂分子动力学（MD）模拟获得，模拟流程遵循所总结的工作流程（图8）。

图1. 分析HerA-NurA非共价复合物的寡聚状态、组成及拓扑结构。(A) HerA、HerA-NurA以及HerA-NurA在DNA存在下的质谱图（15.4 kDa，25 bp双链DNA）。HerA亚复合物以六聚体和七聚体形式存在。NurA二聚体结合至HerA六聚体并诱导其发生寡聚态转换。DNA结合于形成的HerA-NurA复合物（结果改编自Z. Ahdash et al., 2017²²）。(B) 使用UniDec³²计算鉴定出的各物种的相对强度。请点击此处查看该图的放大版本。

图 2。原生电喷雾电离质谱（Native ESI-MS）揭示了核苷酸与 HerA-NurA 的结合机制。质谱图：（A）HerA-NurA 和（B）HerA-NurA-DNA 在逐渐增加的（i）ATP-γ-S 和（ii）ADP 浓度下的变化。通过将实测质量与理论质量进行比较，确定结合的 ATP-γ-S 或 ADP 数量。质谱图上标出了实测质量及结合的核苷酸数目。ATP-γ-S 和 ADP 的滴定实验确定了 HerA-NurA 单独存在以及与 DNA 形成复合物时核苷酸的依次结合情况，表明存在一种循环反应机制（结果改编自 Z. Ahdash et al., 2017²²）。 请点击此处查看此图的放大版本。

图3. 测定ATP-γ-S浓度增加对HerA寡聚状态的影响。（A）在不同ATP-γ-S浓度下HerA的质谱图。（B）通过UniDec去卷积软件³²计算得到的不同物种相对强度的图表。随着ATP-γ-S浓度的增加，HerA六聚体的相对强度也随之增加。质谱图中标注了结合的ATP-γ-S分子数量（结果改编自Z. Ahdash et al., 2017²²）。请点击此处查看此图的放大版本。

图 4. （A）HerA 和（B）HerA-NurA 在溶液中断裂后（i）单独存在以及（ii）在 DNA 存在下的质谱图及亚复合物解离产物。溶液中断裂实验使用了 10–40% 的乙腈、甲醇（MeOH）或二甲基亚砜（DMSO），结果形成了多种亚复合物。请点击此处查看该图的放大版本。

图5. 在CCS轴上显示的复合物及生成的亚复合物的离子淌度到达时间分布。每个亚复合物的图标与图4谱图中标注的图标相对应。亚复合物的实验值与计算得到的质量和CCS值列于表1，所有数据均显示实验值与计算值之间具有良好一致性（考虑到行波离子淌度质谱分辨率的典型不确定性为±5-8%³⁷）。请点击此处查看该图的放大版本。

图6。由溶液中断裂的原位质谱（native MS）和离子迁移质谱（IM-MS）生成的HerA-NurA复合物组装路径。彩色圆圈表示各亚复合物被检测到的条件：原位（绿色，断裂前）、甲醇（黄色）、二甲基亚砜（DMSO，紫色）或乙腈（红色）。请点击此处查看该图的放大版本。

图7. 研究（A）DNA对HerA-NurA的稳定作用以及（B）ATP结合对HerA-NurA-DNA的稳定作用。（i）气相CIU-MS图谱和（ii）质心碰撞能量（KEcom）计算结果表明，双链DNA的存在可稳定HerA-NurA复合物，且结合六个ATP-γ-S的状态最为稳定。图中展示了不同电荷态下的稳定化效应。图表使用PULSAR³³生成。（A）部分结果改编自Z. Ahdash et al., 2017²²。请点击此处查看该图的放大版本。

图8. 差分分子动力学模拟建模流程。(A) 通过从现有亚基构建拓扑结构并重建缺失的残基，生成待研究的复合物。(B) 对有或无配体的蛋白质复合物进行分子动力学模拟的流程。首先单独对蛋白质进行分子动力学模拟，作为参考状态，并从蛋白质-配体复合物的模拟结果中扣除该参考状态。随后计算两次模拟之间的差分均方根涨落（RMSF），以确定配体结合的影响。请点击此处查看该图的放大版本。

复合物 / 亚复合物	理论质量 (kDa)	实验质量 (kDa)	理论碰撞截面积 (Ų)	实验碰撞截面积 (Ų) [电荷]	条件 HN
HerA6-NurA2	416.22	417.85	14531	14577 [42+] 14599 [43+] 14608 [44+] 14637 [45+]	10-20% ACN, 10-40% DMSO, 10% MeOH
HerA6-NurA2-dsDNA	431.72	432.27	-	14661 [39+] 14728 [40+] 14781 [41+] 14837 [42+]	10% ACN, 10% MeOH
NurA1	39.12	38.18	3254	2618 [10+] 2746 [11+] 2878 [12+]	10-40% ACN, 10% MeOH, 20-40% DMSO
NurA2	78.24	78.36	4890	4903 [16+] 4614 [17+] 4537 [18+] 4666 [19+]	10-40% MeOH, 20-40% DMSO
HerA1	56.33	56.32	4131	3647 [14+] 3792 [15+] 3950 [16+]	10-40% ACN, 40% DMSO
HerA2	112.66	112.95	6475	5648 [20+] 5747 [21+] 5842 [22+] 5996 [23+]	40% Meth, 10-40% ACN
HerA3	168.99	169.39	8607	7501 [25+] 7616 [26+] 7717 [27+] 7867 [28+]	10-40% MeOH, 10-40% CAN, 40% DMSO
HerA3 + DNA	183.99	184.976	-	7655 [26+] 7990 [27+] 8107 [28+]	10-30% ACN
HerA4	225.32	226.2	10477	9205 [30+] 9287 [31] 9493 [32+] 9961 [33+]	10-40% MeOH, 10-40% ACN
HerA4 +DNA	240.82	241.33	-	9637 [31+] 9756 [32+] 9830 [33+]	10-30% ACN
HerA5	281.65	282.75	11853	10847 [36+] 10958 [37+] 11161 [38+]	30-40% ACN
HerA6	337.98	339.3	12517	12335 [38+] 12386 [39+] 12498 [40+] 12590 [41+] 12676 [42+] 13019 [43+]	10-40% MeOH, 10-40% ACN
HerA6 +DNA	353.48	354.626	-	12890 [40+] 13081 [41+] 13184 [42+] 13273 [43+] 13463 [44+] 13576 [45+]	30% ACN
HerA7	394.3	395.85	13901	14154 [42+] 14219 [43+] 14261 [44+] 14285 [45+] 14335 [46+]	10-40% MeOH, 10-40% ACN, 10-40% DMSO
HerA7 +DNA	409.8	410.62	-	14414 [41+] 14510 [42+] 14558 [43+] 14598 [44+] 14630 [45+] 14641 [46+]	10% ACN

表1. 通过溶液中断实验生成的HerA-NurA及其亚复合物的实验与计算质量及碰撞截面（CCS）值。

讨论

质谱（MS）在表征蛋白质复合物的化学计量比、相互作用及亚基结构方面正发挥着日益重要的作用。离子迁移率-质谱（IM-MS）数据可用于确定多组分复合物中亚基的空间拓扑排列。与其他现有的结构生物学方法相比，质谱具有多项优势。天然质谱（Native MS）是一种快速且高度敏感的技术，可用于分析异质性蛋白质样品。当与溶液中断实验相结合时，可监测蛋白质组装体的解离途径。结合晶体结构或同源建模，结构质谱所提供的信息为研究蛋白质-配体相互作用提供了有力工具，并可构建接近天然状态的结构模型及组装路径¹¹。

本文描述了使用整合质谱法（integrative MS）分析含有一种或多种配体的蛋白质-配体相互作用的化学计量比和组成的必要实验步骤。该流程包括质谱样品制备、数据采集、数据分析，以及利用计算工具整合质谱数据。为此，我们采用结合了三种配体（DNA、ATP 和 ADP）的DNA解链复合物HerA-NurA异源寡聚蛋白作为模型系统。本方案展示了如何使用当前可用的软件辅助进行数据分析和结果展示。

获得高质量的质谱图对于配体结合分析至关重要，因此，仔细的样品制备步骤十分关键，包括蛋白质纯化、配体滴定和缓冲液置换。在研究配体结合时，纳电喷雾电离（nESI）天然质谱的一个局限性是会发生非特异性结合。非特异性结合在电喷雾过程中液滴去溶剂化阶段发生，这会提高配体浓度，从而改变蛋白质/配体的比例²⁹。核苷酸结合导致的脱辅基蛋白与结合核苷酸的蛋白质之间的质量差异相对较小，因此不会改变电离效率^50,51。

我们使用了Synapt G2-Si质谱系统开展本研究，但这些方案同样适用于利用其他市售的纳米电喷雾质谱仪对不同的蛋白质-配体复合物进行研究。整合性结构质谱技术在解决日益复杂的生物学问题中正发挥着越来越重要的作用。本文所述的工作流程与技术特别适用于解析蛋白质复合物及蛋白质-配体形成过程中的结构变化及其构建机制，而这些过程往往难以通过传统的结构生物学方法进行研究。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
5′-三磷酸腺苷-3-硫四锂盐	Merck Millipore	119120-25MG
5′-二磷酸腺苷	Sigma-Aldrich	20398-34-9
乙酸铵溶液	Sigma-Aldrich	A2706
微型 Bio-Spin 层析柱	Bio-Rad	7326204
Vivaspin 浓缩管	Sartorius	Z614041-25EA
六水合氯化镁	Sigma-Aldrich	246964
TraceSelect 级水	Sigma-Aldrich	95305
硼硅酸盐毛细管	Harvard Apparatus	300060