乳酸脱氢酶螯合测定--一种简便、可靠的测定哺乳动物细胞中自噬性螯合活性的方法

摘要

本文介绍了一种简便、有效的测量哺乳动物细胞中大块自噬性螯合活性的协议。该方法以定量测定乳酸脱氢酶 (ldh) 在 sedimentable 细胞分数与总细胞 LDH 水平的比例。

摘要

大块自噬的特点是将大部分细胞质封存成双/多膜结构, 称为自噬体。这里介绍了一个用于监视此过程的简单协议。此外, 还提供了不同类型培养哺乳动物细胞在自噬诱导条件下的典型结果和实验验证。在大块自噬期间, 自噬体封存细胞质, 从而也可溶胞浆蛋白, 连同其他自噬性货物。乳酸脱氢酶是一种稳定、高度丰富的可溶性胞浆酵素, 无选择性地将其自噬体。因此, LDH 螯合的数量反映了散装自噬性封存的数量。为了有效、准确地测定细胞中 LDH 的封存, 我们采用了一种基于 electrodisruption 的分馏协议, 有效地将 sedimentable 与胞浆 ldh 分离, 其次是 sedimentable 酶活性的测定。分数与全细胞样本。自噬性螯合是通过从治疗细胞中减去未经处理细胞中 sedimentable LDH 的比例来确定的。LDH 螯合法的优点是它能定量测量内源性货物的自噬性封存, 而不是其他涉及螯合探针或半定量蛋白酶的异位表达的方法。自噬标记物或受体的保护分析。

引言

自噬 (希腊语为 "自我吃") 是一个进化保守的过程, 泡/溶酶体降解细胞内物质。在发现自噬相关的 ("ATG") 基因, 这是重要的是在酵母和人类的自噬, 并认识到自噬在人类健康和疾病中发挥重要作用 (承认2016诺贝尔医学或生理学奖, 以Ohsumi), 自噬已迅速成为细胞生物学^1,2最强烈的研究过程之一。

Macroautophagy (以下简称 "自噬") 的特点是将胞内膜池 ("phagophores") 扩展和折叠成密封、双层或多膜结构 ("自噬体"), 有效地封存从细胞质的其余部分包裹材料。自噬体与溶酶体融合后, 内 autophagosomal 膜和螯合货物均被降解和回收。自噬体可以在随机 (非选择性自噬) 和选择性 (选择性自噬) 方式中封存细胞质材料。大块自噬很可能代表了非选择性和选择性自噬的混合。

在1960代和70代 (自噬研究的 "形态学时代"), 自噬性封存主要通过超微结构分析来评估。在1980代和开始的1990代 ("生物化学时代") 每 Seglen 和同事-谁研究了自噬在主要鼠肝细胞-开发了第一种方法定量测量自噬性封存活动³。使用这些化验, Seglen 定义和描绘了自噬性溶酶通路⁴

方案

1. 细胞播种和治疗

1. 培养黏附细胞在 75 cm²组织培养烧瓶在一个湿式孵化器与 5% CO₂在37°c, 使用优选的培养基为有关的细胞类型。允许细胞生长, 直到它们到达接近汇合的细胞层。
   注: 使用 RPMI 1640 培养基辅以10% 胎牛血清 (血清), 用于 LNCaP、HEK293、小鼠胚成纤维细胞 (MEFs)、BJ、MCF-7 和 RPE-1 细胞。
   1. 用3毫升37摄氏度磷酸盐缓冲的生理盐水 (PBS) 冲洗细胞, pH 值为7.4。更换 PBS 与3毫升 0.25% (瓦特/v) 胰蛋白酶-ethylenediaminetetraacetate (EDTA), 并孵化瓶在一个湿润的孵化器与 5% CO₂在37°c, 直到细胞分离 (2–5分钟)。
   2. 并用重悬7毫升培养基中含有10% 个血清的分离细胞。在离心管中混合10µL 细胞悬浮整除与10µL 0.4% 台盼蓝, 使用0.5–20µL 吸管尖。使用相同的吸管尖端立即填充计数室幻灯片, 并计算自动单元格计数器中的单元格。
2. 使用含有10% 种血清的培养基, 并在12井组织培养板 (表面积 ~ 3.8 厘米²) 的每个井中使用无菌, 准备一个适当稀释 (见下文) 的细胞悬浮液1.1。2技术。允许生长在一个湿润的孵化器与 5%....

结果

使用这里描述的协议, 大量自噬性螯合活动在许多不同的哺乳动物细胞系, 包括 LAPC4, DU145, Huh7, PNT2A, HeLa, VCaP, H3122, Hec1A, MCF-7, 小鼠胚胎成纤维细胞 (T47D), U2OS,HEK293、BJ 和 LNCaP 细胞进行了测量。在基本条件下 (在完全营养丰富的培养基中), 或者在急性饥饿的血清和氨基酸细胞 (一种真正的自噬诱导条件²²) 下, 对螯合进行评估。结果表明, 在饥饿条件下的乳酸脱氢酶螯合活性在不同细胞系上有很大差异, 从 LAPC4、DU145、Huh7 和 PNT2 细胞 (未显示的数据) 到 LNCaP 细胞的 1.6%/小时的检测水平不等 (图2 A)。在饥饿的原代大鼠肝细胞中观察到的速率高于上述细胞系, 通常从 2.5–4%²³。在基本条件下, 乳酸脱氢酶的螯合几乎无法检测到一半的细.......

讨论

总之, 这里描述的协议是一种可靠和广泛适用的方法来监测哺乳动物细胞中的大块自噬性封存活动。与原来的方法^12,16相比, 我们已经删除了一些不必要的步骤, 简化了几个剩余的步骤, 并引入了一个实质性的降尺度。因此, 该协议在成本和时间效率方面有了很大的改进, 与原始协议相比, 现在可以在不到一半的时间内处理相同数量的样本。对于24个样本, 步骤 2–3 (1 天) 需要大约½ h 的准备工作和 3 h 的有效工时, 而步骤 4 (天 2) 可以执行在 ~ 2 h (时间估计, 因为所有必要的缓冲区事先准备)。由于在1天的化验通常是在细胞治疗之前, 包括 3–4 h 孵化与曝气生物滤过或其他抑制剂的 autolysosomal LDH 降解, 这是方便分两天的化验。然而, 也有可能在一天内完成整个化验。在这种情况下, 在步骤3.6 和3.7 中, 可以节省对液氮中的样品进行快照冻结的时间。尽管没有使用当前的协议进行测试, 但可能会完全跳过冻融步骤, 因为在没有此步骤²³的情况下.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1.5 mL 和 2 mL 微量离心管	Eppendorf	211-2130 和 211-2120
12 孔板	Falcon	353043
Accumax  细胞分离解决方案	创新的细胞技术	A7089	将等分试样保持在 -20 °C;C 多年，在冰箱中存放几个月
巴弗洛霉素 A1	Enzo	BML-CM110-0100	溶于 DMSO
BJ 细胞	ATCC	CRL-2522	传代时使用 <30
牛血清白蛋白 （BSA）	VWR	422361V
Burker 计数室	Fisher Scientific	139-658585
Countess 细胞计数室载玻片	ThermoFisher Scientfic	C10228
Countess II 自动细胞计数仪	ThermoFisher Scientfic	AMQAX1000
Burker 计数室	盖玻片Fisher Scientific	139-658586
Criterion Tris-HCl 凝胶，4–20%、26 孔、15 和 micro;长， 13.3 厘米 x 8.7 厘米 （宽 x 长）	Bio-Rad	3450034
DTT	Sigma-Aldrich	D0632
厄尔平衡盐溶液 （EBSS）	Gibco	24010-043	浓度为 0.1% 葡萄糖
EDTA	Sigma-Aldrich	E7889
电穿孔比色皿 （4 mm）	Bio-Rad	1652088
指数衰减波电穿孔仪	BTX Harvard仪器&	nbsp;EMC 630
胎牛血清 （FBS）	Sigma	F7524	在 RPMI 1640 培养基中 HEK293 细胞中 10% 终浓度
	ATCC	CRL-1573
咪唑	Sigma-Aldrich	56750	高压灭菌 65 mM 溶液并在冰箱中保存数月
培养箱;自动流红外直热 CO2 培养箱	NuAire	NU-5510E
Lipofectamine RNAiMAX 转染试剂	ThermoFisher	13778150
LNCaP 细胞	ATCC	CRL-1740	传代时使用 <30
3-甲基腺嘌呤 （3MA）	Sigma-Aldrich	M9281	储备液 100 mM 在 -20 °C 的 RPMI 中。将原料加热至 65 °C;C 10 分钟，并在 10 mM 终浓度下使用
冷冻微量离心机	Beckman Coulter Life Sciences	368831
具有软模式功能的冷冻微量离心机	Eppendorf	Eppendorf 5417R
MRT67307盐酸盐 （ULKi）	Sigma-Aldrich	SML0702	抑制 ULK 激酶活性。溶于 DMSO。
MaxMat 多分析仪仪器	Erba Diagnostics	PL-II
MCF7 细胞	ATCC	HTB-22
NADH	Merck-Millipore	1.24644.001
Nycodenz	Axis-Shield	1002424
Opti-MEM 减血清培养基	ThermoFisher	31985062
磷酸盐缓冲盐水 （PBS）	Gibco	20012-019
移液器吸头 3 （0.5-20 µL）	VWR	732-2223	Thermo Fischer ART Barrier 吸头
移液器吸头（1-200 µL）	VWR	732-2207	Thermo Fischer ART Barrier 吸头
移液器吸头（100-1,000 &L）	VWR	732-2355	Thermo Fischer ART Barrier 吸头
移液器	ThermoFisher	4701070	Finnpipette F2 GLP 试剂盒
聚-D-赖氨酸	Sigma-Aldrich	P6407-10X5MG	在无菌 H2O 中制备 1 mg/mL 储备液。该溶液在 -20 ° 下稳定;C 至少 1 年。
丙酮酸	Merck-Millipore	1066190050
RPE-1 细胞 （hTERT RPE-1）	ATCC	CRL-4000
RPMI 1640	Gibco	21875-037
SAR-405	ApexBio	A8883	抑制磷酸肌醇 3-激酶 III 类 （PIK3C3）。溶于 DMSO。
Silencer Select 阴性对照 #1 （siCtrl）	ThermoFisher/Ambion	4390843
Silencer Select 靶向 ATG9 的 siRNA （siATG9A）	ThermoFisher/Ambion	s35504
Silencer Select FIP200 靶向 siRNA （siFIP200）	ThermoFisher/Ambion	s18995
Silencer Select ULK1 靶向 siRNA （siULK1）	ThermoFisher/Ambion	s15964
Silencer Select 靶向 ULK2 的 siRNA （siULK2）	ThermoFisher/Ambion	s18705
Silencer Select 靶向 GABARAP 的 siRNA （siGABARAP）	ThermoFisher/Ambion	s22362
Silencer Select GABARAPL1靶向 siRNA （siGABARAPL1）	ThermoFisher/Ambion	s24333
Silencer Select GABARAPL2靶向 siRNA （siGABARAPL2）	ThermoFisher/Ambion	s22387
磷酸二氢钠二水合物 （NaH2PO4 & 2H2O）	Merck-Millipore	1.06580.1000
磷酸氢二钠二水合物 （Na2HPO4 & 2H2O ）	Prolabo	28014.291
蔗糖	VWR	443816T	水中 10% 的最终浓度;通过 0.45 µ 过滤;m 过滤并在冰箱中保存数月
Thapsigargin	Sigma-Aldrich	T9033	抑制 SERCA ER Ca2+ 泵。溶于 DMSO。
Triton X-405	Sigma-Aldrich	X405	1% 最终
台盼蓝染色剂 0.4%	Molecular Probes	T10282
胰蛋白酶-EDTA（0.25% w/v 胰蛋白酶）	Gibco	25200-056
吐温-20	Sigma-Aldrich	P2287	0.01% 最终