本文介绍了一种在哺乳动物细胞中测量整体自噬捕获活性的简单且经过充分验证的实验方案。该方法基于定量分析可沉淀细胞组分中乳酸脱氢酶（LDH）所占的比例，并将其与细胞总LDH水平进行比较。
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方法文章
乳酸脱氢酶封存检测——一种测定哺乳动物细胞大分子自噬封存活性的简单可靠方法
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
大自噬的特征是将细胞质的大片段包裹进称为自噬体的双层/多层膜结构中。本文描述了一种监测该过程的简单方案，并提供了在多种培养的哺乳动物细胞中，自噬诱导条件下该方法的典型结果及实验验证。在大自噬过程中，自噬体会包裹细胞质，从而非选择性地将可溶性胞质蛋白及其他自噬货物一同包裹进去。乳酸脱氢酶（LDH）是一种稳定且丰度很高的可溶性胞质酶，可被非选择性地包裹进自噬体中。因此，LDH的包裹量反映了大自噬包裹的总量。为了高效且准确地测定细胞中LDH的包裹情况，我们采用基于电穿孔裂解的分级分离方法，有效分离可沉淀的LDH与胞质中的LDH，随后测定沉淀组分与全细胞样品中的酶活性。自噬包裹量通过处理组细胞中可沉淀LDH的比例减去未处理组细胞中的相应比例来确定。LDH包裹检测法的优点在于，它能够定量测定内源性自噬货物的包裹情况，而不同于其他需要异位表达包裹探针或对自噬标志物或受体进行半定量蛋白酶保护分析的方法。
引言
自噬（希腊语意为"自我吞噬"）是一种在进化上保守的细胞内物质通过液泡/溶酶体途径进行降解的过程。随着自噬相关（"ATG"）基因的发现——这些基因在酵母和人类的自噬过程中起重要作用，以及认识到自噬在人类健康与疾病中具有重要意义（大隅良典于2016年因此获得诺贝尔生理学或医学奖），自噬迅速成为细胞生物学中最受关注的研究过程之一1,2。
大自噬（下文简称为 "自噬"）的特征是细胞内膜囊（"吞噬泡"）的扩展和折叠，形成封闭的双层或多层膜结构（"自噬体"），从而将包裹的物质与细胞质其余部分有效隔离。自噬体与溶酶体融合后，其内层膜及所包裹的物质被降解并循环利用。自噬体可以以非特异性（非选择性自噬）或特异性（选择性自噬）的方式包裹细胞质成分。大规模自噬很可能同时包含非选择性自噬和选择性自噬的混合过程。
20世纪60年代和70年代"形态学时代" 自噬研究领域，自噬性隔离主要通过超微结构分析进行评估。20世纪80年代至90年代初（"生化时代"根据研究大鼠原代肝细胞自噬作用的Per Seglen及其同事所建立的方法，首次实现了对自噬性包封活性的定量检测3利用这些检测方....
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方案
1. 细胞接种与处理
- 在75 cm²培养瓶中培养贴壁细胞2 含5% CO₂的湿润化培养箱中的组织培养瓶2 在 37 °C，使用相应细胞类型的最佳培养基。让细胞生长至接近汇合的单层状态。
注意：LNCaP、HEK293、小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）、BJ、MCF-7 和 RPE-1 细胞使用添加 10% 胎牛血清（FBS）的 RPMI 1640 培养基。- 用 3 mL 洗涤细胞 37 °C 磷酸盐缓冲液（PBS），pH 7.4。将 PBS 替换为 3 mL 0.25%（w/v）胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（EDTA），并在含 5% CO₂ 的湿润培养箱中孵育培养瓶2 在 37 °C 直到细胞脱落（2–5 分钟）。
- 用含有10% FBS的7 mL培养基重悬细胞，混匀 10 µL 细胞悬液等分试样与 10 µL 0.4% 台盼蓝置于微量离心管中，使用 0.5–20 µL 移液枪头。使用同一枪头立即填充计数板载玻片，并在自动细胞计数仪中计数细胞。
- 使用含10% FBS的培养基对步骤1.1.2所得细胞悬液进行适当稀释（见下文注释），每孔加入1 mL稀释后的细胞悬液至12孔组织培养板中（表面积约3.8 cm²）2) 采用无菌技术操作。置于含5% CO₂的加湿培养箱中培养。2<....
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结果
使用本方案中描述的方法，测量了多种不同哺乳动物细胞系中的巨自噬捕获活性，包括 LAPC4、DU145、Huh7、PNT2A、HeLa、VCaP、H3122、Hec1A、MCF-7、T47D、U2OS、PC3、G361、小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）、RPE-1、HEK293、BJ 和 LNCaP 细胞。在基础条件下（使用完全、营养丰富的培养基）或在急性缺乏血清和氨基酸的细胞中评估了捕获活性（a 真正有效的 自噬诱导条件22）。结果表明，在饥饿条件下，不同细胞系中的乳酸脱氢酶（LDH）截留活性存在显著差异，LAPC4、DU145、Huh7 和 PNT2 细胞中该活性几乎检测不到（数据未显示），而在 LNCaP 细胞中则约为 1.6%/h（图2A）。在饥饿状态下的原代大鼠肝细胞中观察到的速率高于上述细胞系，通常为2.5–4%/h23在基础条件下，所测试的细胞系中有一半几乎.......
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讨论
综上所述，本文所述方案是一种可靠且广泛应用的方法，可用于监测哺乳动物细胞中的整体自噬捕获活性。与原始方法12,16相比，我们删除了多个不必要的步骤，简化了其余部分步骤，并进行了显著的规模缩小。因此，该方案在成本和时间效率方面得到了极大改进，现在处理相同数量的样本所需时间不到原始方案的一半。对于24个样本，第2–3步（第1天）大约需要½小时的准备时间和3小时的有效操作时间，而第4步（第2天）可在约2小时内完成（时间估算基于所有必要缓冲液已预先配制好的前提）。由于第1天的检测通常需要在细胞处理之后进行，包括使用Baf或其他自溶酶体LDH降解抑制剂孵育3–4小时，因此将检测分为连续两天进行较为方便。然而，整个检测也可在同一天内完成。在这种情况下，在第3.6 和3.7步中将样本在液氮中速冻将节省时间。尽管当前方案尚未验证 这一操作，但很可能可以完全省略冻融步骤，因为在原代大鼠肝细胞中进行的更复杂版本检测已无需此步骤23。
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致谢
本工作获得了挪威研究理事会、奥斯陆大学、安德斯·亚尔基金会、南森基金会以及亨里克·霍曼纪念遗产基金的资助。我们感谢 Noboru Mizushima 博士提供的 ATG5+/+ MEFs 和 ATG5-/- MEFs，Masaaki Komatsu 博士提供的 ATG7+/+ MEFs 和 ATG7-/- MEFs，以及 Shizuo Akira 博士提供的 ATG9A+/+ MEFs 和 ATG9A-/- MEFs。我们感谢 Frank Sætre 提供的技术支持，以及 Per O. Seglen 博士在方法学方面的建设性讨论。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1.5 mL 和 2 mL 微量离心管 | Eppendorf | 211-2130 和 211-2120 | |
| 12 孔板 | Falcon | 353043 | |
| Accumax 细胞解离液 | Innovative Cell Technologies | A7089 | 分装后于 -20 °C 可保存数年，冰箱中可保存数月 |
| Bafilomycin A1 | Enzo | BML-CM110-0100 | 溶于 DMSO |
| BJ 细胞 | ATCC | CRL-2522 | 使用代次 <30 |
| 牛血清白蛋白 (BSA) | VWR | 422361V | |
| Burker 计数室 | Fisher Scientific | 139-658585 | |
| Countess 细胞计数板 | ThermoFisher Scientfic | C10228 | |
| Countess II 自动细胞计数仪 | ThermoFisher Scientfic | AMQAX1000 | |
| Burker 计数室盖玻片 | Fisher Scientific | 139-658586 | |
| Criterion Tris-HCl 凝胶，4–20%，26 孔，15 µL，13.3 cm × 8.7 cm (W × L) | Bio-Rad | 3450034 | |
| DTT | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| Earle's 平衡盐溶液 (EBSS) | Gibco | 24010-043 | 含 0.1% 葡萄糖 |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E7889 | |
| 电穿孔比色皿 (4 mm) | Bio-Rad | 1652088 | |
| 指数衰减波电穿孔仪 | BTX Harvard Apparatus | EMC 630 | |
| 胎牛血清 (FBS) | Sigma | F7524 | RPMI 1640 培养基中终浓度为 10% |
| HEK293 细胞 | ATCC | CRL-1573 | |
| 咪唑 | Sigma-Aldrich | 56750 | 将 65 mM 溶液高压灭菌后置于冰箱中可保存数月 |
| 培养箱；Autoflow IR 直接加热 CO2 培养箱 | NuAire | NU-5510E | |
| Lipofectamine RNAiMAX 转染试剂 | ThermoFisher | 13778150 | |
| LNCaP 细胞 | ATCC | CRL-1740 | 使用代次 <30 |
| 3-甲基腺嘌呤 (3MA) | Sigma-Aldrich | M9281 | 100 mM 储存液溶于 RPMI，-20 °C 保存。 使用前于 65 °C 加热 10 分钟，工作终浓度为 10 mM |
| 制冷微量离心机 | Beckman Coulter Life Sciences | 368831 | |
| 带软模式功能的制冷微量离心机 | Eppendorf | Eppendorf 5417R | |
| MRT67307 盐酸盐 (ULKi) | Sigma-Aldrich | SML0702 | 抑制 ULK 激酶活性。溶于 DMSO。 |
| MaxMat 多功能分析仪 | Erba Diagnostics | PL-II | |
| MCF7 细胞 | ATCC | HTB-22 | |
| NADH | Merck-Millipore | 1.24644.001 | |
| Nycodenz | Axis-Shield | 1002424 | |
| Opti-MEM 低血清培养基 | ThermoFisher | 31985062 | |
| 磷酸盐缓冲液 (PBS) | Gibco | 20012-019 | |
| 移液器吸头 3 (0.5–20 µL) | VWR | 732-2223 | Thermo Fischer ART 防污染吸头 |
| 移液器吸头 (1–200 µL) | VWR | 732-2207 | Thermo Fischer ART 防污染吸头 |
| 移液器吸头 (100–1,000 µL) | VWR | 732-2355 | Thermo Fischer ART 防污染吸头 |
| 移液器 | ThermoFisher | 4701070 | Finnpipette F2 GLP 套件 |
| 聚-D-赖氨酸 | Sigma-Aldrich | P6407-10X5MG | 用无菌 H2O 配制成 1 mg/mL 储存液。该溶液在 -20 °C 至少可稳定保存 1 年。 |
| 丙酮酸盐 | Merck-Millipore | 1066190050 | |
| RPE-1 细胞 (hTERT RPE-1) | ATCC | CRL-4000 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 21875-037 | |
| SAR-405 | ApexBio | A8883 | 抑制 III 类磷脂酰肌醇 3-激酶 (PIK3C3)。溶于 DMSO。 |
| Silencer Select 阴性对照 #1 (siCtrl) | ThermoFisher/Ambion | 4390843 | |
| Silencer Select ATG9 靶向 siRNA (siATG9A) | ThermoFisher/Ambion | s35504 | |
| Silencer Select FIP200 靶向 siRNA (siFIP200) | ThermoFisher/Ambion | s18995 | |
| Silencer Select ULK1 靶向 siRNA (siULK1) | ThermoFisher/Ambion | s15964 | |
| Silencer Select ULK2 靶向 siRNA (siULK2) | ThermoFisher/Ambion | s18705 | |
| Silencer Select GABARAP 靶向 siRNA (siGABARAP) | ThermoFisher/Ambion | s22362 | |
| Silencer Select GABARAPL1 靶向 siRNA (siGABARAPL1) | ThermoFisher/Ambion | s24333 | |
| Silencer Select GABARAPL2 靶向 siRNA (siGABARAPL2) | ThermoFisher/Ambion | s22387 | |
| 磷酸二氢钠二水合物 (NaH2PO4 • 2H2O) | Merck-Millipore | 1.06580.1000 | |
| 磷酸氢二钠二水合物 (Na2HPO4 • 2H2O ) | Prolabo | 28014.291 | |
| 蔗糖 | VWR | 443816T | 水中终浓度为 10%；经 0.45 µm 滤膜过滤后置于冰箱中可保存数月 |
| 毒胡萝卜素 | Sigma-Aldrich | T9033 | 抑制 SERCA 内质网 Ca2+ 泵。溶于 DMSO。 |
| Triton X-405 | Sigma-Aldrich | X405 | 终浓度 1% |
| 台盼蓝染液 0.4% | Molecular Probes | T10282 | |
| 胰蛋白酶-EDTA (0.25% w/v 胰蛋白酶) | Gibco | 25200-056 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P2287 | 终浓度 0.01% |
参考文献
- Rubinsztein, D. C., Frake, R. A. Yoshinori Ohsumi's Nobel Prize for mechanisms of autophagy: from basic yeast biology to therapeutic potential. J R Coll Physicians Edinb. 46 (4), 228-233 (2016).
- Mizushima, N.
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