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强迫唾液分泌作为分析蚊虫传播能力的方法

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DOI：

10.3791/57980

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2018年8月7日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Bernhard Nocht Institute for Tropical Medicine, 2German Centre for Infection Research (DZIF)

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

为了有效控制蚊媒病毒的传播，了解相应蚊虫的媒介潜能尤为重要。本文将强制唾液分泌法描述为一种用于分析蚊虫媒介能力的方法。 白纹伊蚊 以及三种不同的 库蚊 寨卡病毒传播的媒介生物

摘要

媒介能力是指某种蚊子将蚊媒病毒（mobovirus）传播给脊椎动物宿主的潜在能力。具有感染性的病毒颗粒在蚊子吸血过程中通过其唾液传播。强制唾液分泌实验能够基于单只蚊子评估其传播潜力，从而避免使用动物实验。该方法适用于在短时间内于一次实验中分析大量蚊子。本研究采用强制唾液分泌实验分析了在德国捕获的856只个体蚊子，包括两种不同的尖音库蚊尖音亚种（Culex pipiens pipiens）生物型、环带库蚊（Culex torrentium）以及白纹伊蚊（Aedes albopictus），这些蚊子被实验性感染寨卡病毒（ZIKV），并在18 °C或27 °C下孵育两周或三周。结果显示，不同库蚊属（Culex）分类单元对ZIKV均不具备媒介能力。相反，白纹伊蚊（Aedes albopictus）对ZIKV具有易感性，但仅在27 °C条件下表现出传播能力，其传播率与平行测试的埃及伊蚊（Aedes aegypti）实验室种群相似。

引言

2015年，寨卡病毒（ZIKV），一种属于黄病毒科的蚊媒病毒（mobovirus） 黄病毒科， 在哥伦比亚和巴西出现后，迅速蔓延至美洲和加勒比地区，引发了一场流行病，导致大量与小头症和吉兰-巴雷综合征相关的临床病例1. 埃及伊蚊（Aedes aegypti）的蚊子 埃及伊蚊 和 白纹伊蚊 被视为寨卡病毒（ZIKV）的主要和次要传播媒介2，但该属的其他物种 伊蚊 也已被证实具有实验性传播媒介能力3与……相反 伊蚊 物种，大多数的 库蚊 迄今为止测试的物种均无法传播该病毒4. 仅仅，数据用于 致倦库蚊 结果不明确3目前，在中等温度条件下关于蚊媒对寨卡病毒（ZIKV）传播能力的信息仍然缺乏。<20 °C）。然而，这一信息对于评估该物种向中欧等温带地区可能扩散的风险具有重要意义。

一种对寨卡病毒（ZIKV）具有传播能力的媒介能够获取、维持、扩增并最终传播该病毒。因此，仅检测蚊虫整体或其部分组织（包括腿部、中肠、头部或唾液腺）中是否存在ZIKV，不足以确定其媒介能力。必须检测蚊虫释放的唾液中是否含有具有感染性的病毒颗粒。为了评估媒介能力，需同时测定感染率（IR，即ZIKV阳性蚊虫数占吸血后蚊虫总数的比例）和传播率（TR，即唾液中ZIKV阳性的蚊虫数占ZIKV阳性蚊虫总数的比例）。蚊虫的感染率可通过将蚊虫组织匀浆后进行靶向ZIKV的反转录实时聚合酶链反应（RT-qPCR）进行简便分析。此外，还可通过测定每只蚊虫体内的病毒拷贝数来进一步表征感染情况。相比之下，传播率的分析依赖于检测单只蚊虫唾液中是否存在具有活性的病毒颗粒。传统方法是让感染的蚊虫叮咬易感宿主动物，随后分析宿主是否出现病毒血症5。然而，该方法依赖合适的模式生物，成本较高，且受到动物福利法规的限制。为避免在传播率分析中使用实验动物并降低成本，已有研究描述了使用血液液滴的人工再饲喂系统6。然而，对大量个体蚊虫进行单只检测仍存在操作困难且耗时的问题。最早关于单只蚊虫唾液检测的实验方法于1966年报道7，近年来，强制唾液分泌实验已成为评估蚊虫媒介能力的首选方法3,8。

基于我们近期发表的中欧蚊虫媒介效能研究9我们描述了 Anderson 报道的强制唾液分泌方法 等.8 进行了一些修改。该方法可在高等级生物安全条件下（BSL-3）实现高通量的标准化实验，并包含基于细胞培养的检测方法以鉴定活病毒。本文所述实验共涉及856只蚊子，通过人工血液饲喂感染寨卡病毒（ZIKV），随后检测其唾液中是否存在具有感染性的病毒颗粒。用于实验的蚊子包括两个长期建立的实验室种群 埃及伊蚊 和 尖音库蚊尖音亚种 生物型 molestus (Cx. p. molestus），以及野外捕获的 尖音库蚊尖音亚种 生物型尖音库蚊（Cx. p. pipiens), Culex torrentium (Cx. torrentium以及两个 白纹伊蚊 种群。除两个中的一个外 白纹伊蚊 种群，该种群在意大利采集，而所有蚊子均在德国采集。

方案

1. 准备雌性蚊子

  1. 使用吸蚊器从大蚊笼中采集蚊虫（每个大蚊笼约采集400只）。
  2. 用二氧化碳（CO₂）麻醉蚊子2）7 秒。
  3. 每只塑料瓶中放入20只雌性果蝇Ø 50 mm × 100 mm
    注意：如果蚊子苏醒，再使用 3 秒的 CO₂2.
  4. 将蚊子饥饿处理过夜。

2. 人工血液餐

注意：所有步骤均在 BSL-3 条件下进行。

  1. 准备感染性血餐。
    1. 将病毒原液稀释至浓度为 1 × 108 斑块形成单位 (PFU)/mL。
      注意：病毒原液浓度通过组织培养感染剂量50法（TCID50）测定，并采用Spearman & Kärber算法计算10,11。
    2. 将血库提供的过期人血（血液保存液，已不适用于人类，但可用于蚊虫）与果糖（8%溶液）、过滤牛血清（FBS）及病毒工作液混合（过期人血:果糖:FBS:工作液 = 5:3:1:1）。
      注意：我们选择人血，因为人类是寨卡病毒（ZIKV）已知的天然哺乳动物宿主。
  2. 将140 µL血餐混合物冷冻，用于后续TCID50分析。
  3. 根据蚊种采用不同的人工饲喂方法进行饲喂：
    1. Aedes aegypti：使用膜饲系统饲喂30分钟（每个饲喂器1 mL）。
    2. Culex spp.：通过棉棒提供感染性血液过夜，且无需加热血液（每瓶300 µL）。
    3. Aedes albopictus：在塑料小瓶中加入两滴血餐混合物（每滴50 µL），让蚊虫取食2小时。无需加热血液。
      注意：蚊虫通常在前15分钟内完成取食。延长孵育时间是出于安全考虑。2小时后移除血滴，从而在筛选已吸血蚊虫时降低污染风险。
  4. 用CO2 麻醉蚊虫7秒。
    注意：若蚊虫苏醒，可再使用3秒CO2。
  5. 将完全吸血的蚊虫分选并计数后转移至新小瓶中。
  6. 在小瓶与瓶塞之间放置一块浸透果糖（8%溶液）的棉垫。
  7. 将蚊虫置于指定温度（18 °C 或 27 °C）、相对湿度80%的环境中培养14天或21天。
  8. 用浸透果糖的棉垫喂养蚊虫。每72小时每瓶补充1.5 mL果糖（8%溶液）（每瓶最多20只蚊虫，具体数量取决于取食率，参见步骤2.5）。

第14天或第21天的强制唾液分泌实验

注意：所有步骤均在 BSL-3 条件下进行。

  1. 在96孔板中，每孔加入200 µL培养基（DMEM培养基，含3% FBS、100 U/mL青霉素、100 mg/mL链霉素、5 µg/mL两性霉素B、2 mM L-谷氨酰胺、1%非必需氨基酸（NEAA）、1%丙酮酸钠），接种2 × 104个Vero细胞。
  2. 准备唾液分泌装置：
    1. 将一块方形玻璃板（20 × 20 cm）以30°角放置在实验台上。
      注意：由于生物安全实验室内的负压环境，必须采用此倾斜角度。若玻璃板水平或垂直放置，液体会泄漏。
    2. 在玻璃板表面贴上双面胶带。
    3. 将油泥搓成直径约0.5 cm的条状，水平固定在距双面胶带1 cm处。
    4. 剪去10 µL滤芯吸头尖端最前端的0.3 cm。
      注意：建议在进入生物安全实验室前预先准备好此步骤。
    5. 用10 µL磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）填充滤芯吸头。
    6. 将滤芯吸头放置在油泥上，吸头朝向粘性胶带一侧。
    7. 轻轻按压，固定滤芯吸头。
  3. 准备蚊虫：
    1. 用CO2麻醉蚊虫。
    2. 去除蚊虫的足和翅膀，使其固定不动。
    3. 将活体蚊虫固定在粘性胶带上，位于滤芯吸头正上方。
    4. 轻柔地将蚊虫的喙插入滤芯吸头中。
    5. 进行30分钟的唾液分泌实验。
    6. 取下滤芯吸头，并丢弃油泥和胶带。

4. 唾液的处理

注意：步骤 4.1–4.6.2 需在 BSL-3 条件下进行。

  1. 将内容排入含有 10 µL PBS 的反应管中。
  2. 轻轻混匀，并将内容物转移至预先准备好的 96 孔板的孔中，每份样品使用一个孔。
  3. 在 37 °C、5% CO2 条件下孵育 7 天。
  4. 使用双目显微镜检查细胞是否存在细胞病变效应（CPE）。
  5. 若孔中出现 CPE 阳性结果，用移液器吸取 140 µL 上清液至反应管中，用于 RNA 提取。
  6. 使用 RNA 提取试剂盒纯化 RNA。
    1. 将 140 µL 上清液与 560 µL AVL 缓冲液（病毒裂解缓冲液）混合，并在室温下孵育 10 分钟。
    2. 加入 560 µL 乙醇（96%），涡旋混匀样品。
      注意：此步骤后样品已被灭活，可移出 BSL-3 实验室。
    3. 将 630 µL 样品移入离心柱中，以 6,000 x g 离心 1 分钟。
    4. 弃去滤液，将剩余的 630 µL 样品加入同一离心柱中，重复离心一次。
    5. 向离心柱中加入 500 µL 洗涤缓冲液 1，清洗结合在膜上的 RNA，然后以 6,000 x g 离心 1 分钟。
    6. 弃去收集管，将离心柱放入新的收集管中，加入 500 µL 洗涤缓冲液 2，以 12,500 x g 离心 3 分钟。
    7. 弃去收集管，将离心柱放入一个 1.5 mL 反应管中。
    8. 加入 50 µL 洗脱缓冲液，在室温下孵育 1 分钟。
    9. 以 6,000 x g 离心 1 分钟，然后弃去离心柱。
  7. 通过 RT-qPCR 分析样品中的 ZIKV RNA。

5. 蚊虫尸体的处理

注意：步骤 5.1–5.5 需在 BSL-3 条件下进行。

  1. 去除蚊虫的虫体，并将每个虫体放入一个反应管中。
    注意：实验可在此处暂停，并将样品在 -80 °C 下保存。
  2. 向反应管中加入 500 µL 匀浆液（不含任何添加剂的 DMEM）。
  3. 使用手动电动匀浆器对虫体进行匀浆，每个样品需使用新的研杵。
  4. 取 200 µL 匀浆液加入 96 孔板中，用于纯化。
    注意：实验可在此处暂停，并将样品在 -80 °C 下保存。
  5. 将 96 孔板在 60 °C 下孵育 60 分钟以进行灭活。
  6. 通过自动化核酸纯化系统进行 RNA 纯化。
    注意：实验可在此处暂停，并将样品在 -80 °C 下保存。

6. 分析

  1. 使用 RT-qPCR 定量病毒 RNA 拷贝数。
    注意：RNA 拷贝数的计算基于所有寨卡病毒（ZIKV）阳性蚊虫体样本的平均值，不包括 ZIKV 阴性蚊虫。
  2. 计算感染率（IR），定义为感染 ZIKV 的蚊虫体数量与吸血雌蚊总数之比。
  3. 计算传播率（TR），定义为 ZIKV 阳性唾液蚊虫数量与 ZIKV 阳性蚊虫体数量之比。对于未检测到 ZIKV 阳性蚊虫体的蚊种-温度组合，无法计算传播率。

结果

Aedes aegypti 在至少热带气候条件下被公认为是寨卡病毒（ZIKV）的有效传播媒介12。因此，我们采用 Ae. aegypti 作为阳性对照，在27 °C温度和80%湿度条件下建立检测方法，并分析其感染率（IR）和传播率（TR）。感染率和传播率的定义参照 Fortuna et al.13 的既往描述。经病毒攻击的 Ae. aegypti 在感染后14天和21天（dpi）的感染率分别为50%和72%，传播率分别为42%和31%（图1A 和 1B）。随后，在热带和温带气候条件下，对欧洲地区的蚊虫进行了寨卡病毒感染与传播能力的检测。

在27 °C培养温度下，除Cx. p. pipiens和Cx. torrentium个体仅在14 dpi呈ZIKV阳性外，所有蚊种在14 dpi和21 dpi均表现出ZIKV感染。所有Aedes物种的感染率（IR）更高（介于50%至72%之间），且病毒RNA浓度（每只蚊虫标本106至109拷贝RNA）也高于不同Culex分类群，后者感染率介于0%至32%之间，病毒载量为每只蚊虫标本103至104拷贝RNA。所有Aedes物种均检测到ZIKV阳性唾液（传播率TR为13–42%），而所有Culex分类群的唾液样本中均未检测到ZIKV（图1A和1B）。值得注意的是，在21 dpi时，来自德国的Ae. aegypti和Ae. albopictus传播率相似（均为30%），而来自意大利的Ae. albopictus传播率则显著较低（13%）。

在18 °C的适中温度下孵育受感染的蚊子，结果显示伊蚊属（Aedes）中的病毒载量普遍较低（每只蚊子含104–106个RNA拷贝），不同库蚊属（Culex）分类群中的病毒载量也较低（每只蚊子含102–104个RNA拷贝）。然而，在18 °C的孵育温度下，所研究的任何蚊种均未观察到寨卡病毒（ZIKV）的传播。

不同蚊种在18°C和27°C下的温度与传播率柱状图；数据比较。
图1：实验感染寨卡病毒（ZIKV）蚊虫的传播率。 不同蚊种对ZIKV的媒介能力研究结果。六种不同的蚊类分类单元被感染ZIKV后，在27 °C或18 °C下孵育14天（A）或21天（B）。传播率（TR）定义为ZIKV唾液阳性蚊虫数量与ZIKV虫体阳性蚊虫总数之比。共检测蚊虫856只，每个时间点/温度/蚊种分类单元至少包含30只个体。请点击此处查看该图的高清版本。

讨论

先前的研究表明，通过强制唾液分泌获得的结果与经典的再喂养实验结果一致6。然而，无论是再喂养实验还是本研究中介绍的强制唾液分泌方法，均无法直接证实唾液分泌活性或实时监测唾液的释放过程。为了证实唾液分泌活性，可对样本中唾液所含的其他成分（例如：蛋白质、碳水化合物、等）进行检测。此外，通过额外的定量PCR（qPCR）可检测病毒RNA拷贝数。但这种方法需要将唾液样本分装用于不同分析，可能在病毒颗粒数量极低的情况下降低细胞培养实验的灵敏度，进而可能导致对传播率的低估。

为了获得可重复的实验结果，必须确保所有蚊子在实验结束前均保持存活。这需要通过肉眼观察蚊子的身体活动情况来进行监控。此外，对于特定蚊种，需使用已知可由该蚊种传播的对照病毒进行饲喂实验，以验证唾液分泌检测方法的适用性。反之，每一种引入实验的病毒都必须在易感蚊子中进行测试。

强迫唾液分泌检测具有多种优势。可在受控的标准条件下，于单个样本基座上同时检测大量蚊虫，且不违反动物福利法规9。

该方法已被多个实验室采用。然而，具体的实验设置可能存在差异，从而导致不同实验室之间的结果出现差别。其中一个关键组分是用于收集唾液的毛细管，其材质可以是玻璃14或塑料15。为了符合生物安全等级3级昆虫饲养室的高安全标准，我们使用塑料滤芯吸头代替玻璃毛细管，从而降低受伤风险。此外，滤芯吸头还具有优势，即所收集的液体可轻松通过移液器进行转移。

本文所述的强制唾液分泌实验装置基于两名研究人员协作完成并分担任务。其中一人负责解除蚊虫活动能力，同时另一人准备强制唾液分泌装置。这种方法显著缩短了操作时间，并最大限度减少了样本混淆的风险，因为无需在解除活动能力的工作区与唾液分泌板之间来回切换。此外，该方法允许在解除蚊虫活动能力后立即将其放置于强制唾液分泌装置上。较短的蚊虫操作时间对于成功实现强制唾液分泌至关重要。最后，在整个实验过程中可直接对蚊虫的活动性进行实时监测。

本文介绍的唾液分泌检测方法可用于评估蚊虫种类的传播潜力。然而，要回答某些其他特定问题（例如，感染脊椎动物所需的蚊虫叮咬次数），可能仍需进行动物实验。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

感谢Ella Weinert、Michelle Helms和Marlis Badusche提供的出色技术协助，感谢Jessica Börstler对Culex蚊子的分析，感谢Norbert Becker和Björn Pluskota提供Aedes albopictus卵，以及Olli Vapalahti提供病毒毒种。ML由莱布尼茨协会资助；资助编号SAW-2014-SGN-3。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Inject+matic SleeperInject+matic
Bugdorm-1 昆虫饲养笼BugDorm Store
果蝇培养管carl rothPK11.2用于蚊子的塑料小瓶
果蝇培养管塞carl rothPK15.1
恒温恒湿培养箱BinderKBF-240
血液储存的人类血液，已过期，不可用于医学用途
Dumont-Pincette 电子不锈钢镊子DumontB40c
Vero 细胞BNITM
闪光灯式吸虫器Bioquip2809
双面胶带无特定供应商
Gammex 无粉 AMT 手套Ansell在 BSL3 实验室进行穿刺操作时出于安全考虑所必需
RealStar 寨卡病毒 RT-PCR 检测试剂盒altona diagnostics591013
MagMax 病原体 RNA/DNA 提取试剂盒Thermo fisher scientific4462359用于蚊虫个体的 RNA 提取
Qiamp 病毒 RNA Mini 试剂盒Qiagen52906用于上清液的 RNA 提取
滤芯吸头（20 µL）Sarstedt701,116,210剪去吸头尖端前 3 mm
手动电动匀浆器carl roth已售罄
手动电动匀浆器用微型研磨杵carl rothCXH8.1
DMEM 培养基P0403550
L-谷氨酰胺 青霉素/链霉素PANP0819100
两性霉素 BPANP06-0110
果糖carl roth4981.5
磷酸盐缓冲液PANP04-36500
FBSPAN
丙酮酸钠PANP0443100
MEM 非必需氨基酸PANP0832100
Hemotek 饲血装置HemotekPS6
Light CyclerRoche480 II
Light Cycler 软件Roche480 SW 1.5.1
油泥无特定供应商
King Fisher Flex 核酸纯化系统ThermoFisher scientific
Aedes albopictus卵采集自德国弗赖堡
双目显微镜MOTICSMZ-168
双目显微镜光源MOTICMLC-150C
CO2 培养箱Thermo scientificMIDI 40

参考文献

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