本文所述方案基于对经4-硫尿嘧啶标记的酵母细胞中纯化的新生mRNA进行全基因组水平的定量分析。该方法能够将mRNA合成与mRNA降解过程分离，从而准确测量RNA聚合酶II的转录活性。
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方法文章
Saccharomyces cerevisiae 中利用 4-硫代尿嘧啶进行代谢标记及新合成 mRNA 的定量作为 RNA 聚合酶 II 活性的替代指标
本文内容
摘要
摘要
转录组学研究在分析稳态RNA时，可能会忽略RNA聚合酶II转录的整体缺陷。事实上，mRNA合成的全局性降低可能被mRNA降解速率的同步下降所补偿，从而恢复正常的稳态水平。因此，独立于mRNA降解的全基因组mRNA合成定量，是反映RNA聚合酶II转录活性的最佳直接指标。本文介绍一种在Saccharomyces cerevisiae（S. cerevisiae）中对新生RNA进行非干扰性代谢标记的方法。具体而言，细胞在含有尿嘧啶类似物4-硫尿嘧啶的培养基中培养6分钟，随后纯化并定量标记的新生转录RNA，以测定每种个体mRNA的合成速率。此外，通过使用标记的Schizosaccharomyces pombe细胞作为内参标准，可实现不同S. cerevisiae菌株间mRNA合成水平的比较。结合本实验方案，并将数据拟合至动态动力学模型，还可推导出相应的mRNA降解速率。
引言
细胞通过动态改变其基因表达程序，对内源性和外源性信号作出响应。近年来，全基因组范围的研究方法取得了巨大进展，使得能够在不同条件下精确而全面地描述转录组的变化。在大多数转录组学研究中，通常采用微阵列杂交或高通量测序技术来定量总稳态RNA组分中的RNA水平。在特定扰动下的转录变化可能表现出多种结果，包括特定基因的表达改变，或大量基因的上调或下调。基因表达是RNA聚合酶及其他影响RNA水平的过程共同作用所形成的精细调控平衡——即稳态——的结果。RNA聚合酶II的转录过程包含三个不同阶段（起始、延伸和终止），并与mRNA加工、胞质转运、翻译及降解过程高度关联且相互交织。
最近的多项研究表明，mRNA 的合成与降解是相互偶联的机制，且在量化总稳态 RNA 时，可能会忽略突变或刺激条件下的转录效应。首先，通过分析 mRNA 稳态水平来检测转录变化，始终依赖于 mRNA 的半衰期。一旦引入扰动，具有较长半衰期的 mRNA 的稳态水平受到的影响远小于半衰期较短的 mRNA。因此，对 RNA 合成变化的检测明显偏向于短寿命转录本，而对长寿命 mRNA 物种的分析可能无法揭示转录速率的动态变化。其次，已有若干研究报道，在酵母和哺乳动物中，分析 mRNA 稳态水平时可能忽略转录的全局性变化。这很可能是由于 mRNA 合成与降解之间存在偶联机制，导致 mRNA 水平被缓冲所致。上述局限性促使研究人员开发了新的实验方案，通过分析新转录的 mRNA 来独立于降解过程地定量 mRNA 合成。近年来，已提出....
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方案
1. 细胞培养及SAGA亚基的雷帕霉素耗竭
- 对于每种 S. cerevisiae 菌株及重复实验，包括野生型或对照菌株，从新鲜平板上挑取单菌落接种至 5 mL YPD 培养基（2% 蛋白胨、1% 酵母提取物和 2% 葡萄糖）中。
- 在 30 °C 条件下，以持续振荡（150 rpm）培养 S. cerevisiae 细胞过夜。
- 测定 600 nm 处的光密度（OD600），并将菌液用 YPD 培养基稀释至 OD600 约为 0.1，总体积为 100 mL，继续培养至 OD600 达到约 0.8。
- 同时，从新鲜平板上挑取一单菌落 S. pombe 细胞接种至 50 mL YES 培养基（0.5% 酵母提取物；250 mg/L 腺嘌呤、组氨酸、尿嘧啶、亮氨酸和赖氨酸；3% 葡萄糖）中，并在 32 °C 条件下以持续振荡（150 rpm）过夜培养。
- 测定 S. pombe 过夜培养物的 OD600，并将菌液用 YES 培养基稀释至 OD600 约为 0.1，总体积为 500 mL，继续培养至 OD600 约为 0.8。
- 对于每种 S. cerevisiae 锚定去除（anchor-away）菌株及重....
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结果
在进行新转录RNA的代谢标记时，需要控制多个方面：标记的时间和效率、外参加入比例、提取方案以及生物素化效率（包括信噪比）等。这些条件已被其他研究者广泛而系统地验证过7,10,11。本文主要关注样本经RT-qPCR、微阵列或测序处理后可立即进行的数据解读与初步分析。对不同突变菌株的分析表明，该方法不仅能够检测到mRNA合成的显著全局性下降（例如在SAGA突变的S. cerevisiae菌株中），还能在组蛋白H2B单泛素化受到抑制时，检测到RNA聚合酶II活性的轻微降低。
我们对SAGA酶活性的分析表明其在染色质上具有广泛的招募作用15，而这一现象在SAGA突变株的稳态mRNA水平分析中并未显现。由于SAG.......
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讨论
尽管全基因组水平分析转录变化的工具仍在不断改进，但仅通过定量RNA稳态水平来分析转录组，可能无法准确反映RNA聚合酶II活性的变化。事实上，mRNA水平不仅受RNA合成的调控，还受到其成熟和降解过程的影响。为了在排除mRNA降解干扰的情况下测量mRNA的合成，近年来已开发出多种不同的实验方案，用于分析酵母和哺乳动物中的新生转录。
用于定量新生转录的最广泛使用方案之一是GRO-seq1。尽管GRO-seq的主要优势在于能够以高分辨率和低背景揭示处于转录活跃状态的RNA聚合酶，但它存在两个明显缺点，降低了其吸引力：（i）该技术操作难度较高，需要分离细胞核；（ii）细胞核的操作会对系统引入一定干扰28。另一种替代方法是NET-seq，该方法依赖于对新生RNA、模板DNA和RNA聚合酶II之间形成的极为稳定的三元复合物进行免疫沉淀，随后对所获得转录本的3'末端进行测序。该方法能够在单碱基分辨率下表征新生RNA，并可通过免疫沉淀修饰形式的RNA聚合酶II（例如丝氨酸-5磷酸化）来研究mRNA加工事.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢拉斯洛·托拉（Laszlo Tora）的支持，以及 V. Fisher、K. Schumacher 和 F. El Saafin 的有益讨论。T.B. 获得了玛丽·居里-ITN 奖学金（PITN-GA-2013-606806，NR-NET）和 ARC 基金会的资助。本工作得到了法国国家科研署（ANR-15-CE11-0022 SAGA2）基金的支持。本研究还得到了法国国家科研署管理的“未来投资计划”框架项目（ANR-10-IDEX-0002-02）下的法国国家科研署卓越实验室基金（ANR-10-LABX-0030-INRT）的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 4-硫代尿嘧啶 | Sigma-Aldrich | Cat# 440736 | |
| 雷帕霉素 | Euromedex | Cat# SYN-1185 | |
| Countess II FL 全自动细胞计数仪 | ThermoFisher | N/A | |
| RiboPure RNA 纯化试剂盒（酵母） | ThermoFisher | Cat# AM1926 | |
| NanoDrop 2000 分光光度计 | ThermoFisher | ND-2000 | |
| TURBO DNA-free 试剂盒 | ThermoFisher | AM1907 | |
| EZ-Link HPDP 生物素 | ThermoFisher | Cat# 21341 | |
| 硫芦丁 | Abcam | ab143556 | |
| µMACS 链霉亲和素试剂盒 | Miltenyi Biotec | Cat# 130-074-101 | |
| Transcriptor 逆转录酶 | Roche | 03 531 295 001 | |
| SYBR Green I Master | Roche | 4707516001 | |
| GeneChip 酵母基因组 2.0 芯片 | ThermoFisher | 900555 | |
| GeneChip 液体处理工作站 450 | ThermoFisher | 00-0079 | |
| GeneChip 扫描仪 3000 7G | ThermoFisher | 00-0210 |
参考文献
- Gardini, A. Global Run-On Sequencing (GRO-Seq). Methods in Molecular Biology. 1468, 111-120 (2017).
- Churchman, L. S., Weissman, J. S. Nascent transcript sequencing visualizes transcription at nucleotide resolution. Nature. 469 (7330), 368-373 (2011).
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重印与许可
