需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用

方法文章

建模查理-玛丽-图斯病 体外 通过转染小鼠原代运动神经元

6.7K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/57988

⸱

2019年1月7日

 ,  , 
1Institut NeuroMyoGène, CNRS UMR5310, INSERM U1217, Université Lyon, 2Unité Fonctionnelle de Neurogénétique Moléculaire, Hospices Civils de Lyon, 3Centre de Biotechnologie Cellulaire, Hospices Civils de Lyon

本文内容

摘要

该技术的目的是从鼠类脊髓中制备高度富集的原代运动神经元（MNs）培养物。为了评估导致运动神经元疾病突变的影响，本文描述了这些分离的运动神经元的获取及其通过磁转染法进行转染的方法。

摘要

脊髓运动神经元（MNs）的神经退行性变与多种神经系统疾病相关，包括肌萎缩侧索硬化症、腓骨肌萎缩症（Charcot-Marie-Tooth病）和脊髓性肌萎缩症，这些疾病均伴有肌肉萎缩。脊髓运动神经元的原代培养已被广泛用于验证特定基因在上述疾病中的作用，并表征其突变所导致的细胞学后果。本实验方案基于Henderson及其同事二十多年前的开创性工作，建立了一种原代运动神经元培养模型。首先，我们详细描述了从小鼠胚胎脊髓前角分离运动神经元的方法，并利用密度梯度离心技术将运动神经元与邻近细胞分离。随后，我们介绍了一种利用磁转染技术高效转染运动神经元表达质粒的新方法。最后，我们展示了如何对原代培养的运动神经元进行固定和免疫染色。通过使用导致2型腓骨肌萎缩症的神经丝蛋白突变，本方案展示了一种定性研究目的蛋白表达及其在运动神经元生长、维持和存活中作用的方法。

引言

神经肌肉疾病包含多种在临床表现和遗传特征上各不相同的病理类型，其共同特征是肌肉和/或神经系统发生异常。随着测序技术的进步，在过去十年中已鉴定出数百个导致这些罕见疾病的相关基因（基因列表可参见神经肌肉疾病中心：http://neuromuscular.wustl.edu/index.html）。已发现的突变类型表明，同一基因的不同突变可导致不同的表型和疾病1,2,3，而不同基因的突变也可能产生相似的表型4,5。在此背景下，研究人员正致力于开发细胞模型，以期成为分析突变后果及病理机制的有力工具。

脊髓运动神经元的胞体较大，位于脊髓前角，其轴突较长，支配骨骼肌纤维，并通过在神经肌肉接头处释放乙酰胆碱实现随意运动。由于运动神经元会受到肌萎缩侧索硬化症、腓骨肌萎缩症（CMT）和脊髓性肌萎缩症等神经肌肉疾病的影响，Henderson 博士及其同事开发了首个实验方案6 可实现培养的 体外 脊髓运动神经元及神经营养因子GDNF的发现7 （胶质细胞源性神经营养因子）。自那以后，技术上的改进使得利用FACS对脊髓运动神经元及其亚型进行更精确的纯化成为可能8，但利用密度梯度进行富集的方法在目前从事原代脊髓运动神经元研究的实验室中仍然具有强大效力并被广泛使用9,10,11,12,13,14随后，还可利用表面标志物p75通过免疫淘选获得更高纯度的运动神经元。（NTR） 15,16,17.

脊髓包含不同亚型的颈段、胸段和腰段运动神经元（MNs），以及位于前角背腹轴上不同位置且支配不同靶标的内侧和外侧运动柱8,18。初级运动神经元培养物能够以生理比例回收所有这些运动神经元亚型。该技术的主要局限在于最终获得的运动神经元数量较少；事实上，从六个胚胎中大约可获得105个运动神经元，适用于显微镜观察，但对生物化学实验而言数量有限。若需进行具有更标准化亚型且运动神经元数量更充足（>106个细胞）的实验，应考虑使用胚胎干细胞来源的运动神经元18。

将野生型/突变型转基因转染至原代运动神经元（MNs），或对内源基因进行敲低，是解析生理病理通路的一种快速且有效的工具，尤其在缺乏小鼠模型的情况下尤为适用。磁转染（magnetofection）是一种可用于原代神经元转染的技术，其效果类似于脂质体转染（lipofection），但不具有相应的神经毒性。此外，该转染操作可在培养数天后的成熟神经元上进行 体外，与基于电穿孔的技术不同9然而，该技术的一个缺点是磁珠会结合培养物中的核酸，导致DAPI标记时产生背景噪音。病毒感染可能是转染运动神经元（MNs）最有效的方法；然而，磁转染无需病毒制备和细胞感染所需的一些安全操作步骤。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

所有涉及动物的实验程序均获得本机构伦理委员会的批准。

1. 溶液配制

  1. 准备10 mL用L-15培养基透析的4% BSA溶液。
    1. 将牛血清白蛋白粉末以4%（w/v）浓度溶解于10 mL L-15培养基中。
    2. 将溶液加入截留分子量为20 kDa的20 mL透析盒中，于4 °C下在500 mL L-15培养基中透析3天，并持续搅拌。每天更换一次L-15培养基。
    3. 用0.22 µm滤膜过滤溶液，并分装至15 mL离心管中。于-20 °C保存。
      注：本方案中使用以下命名方式：未修饰的原始L-15培养基 = L-15培养基，酸性L-15培养基 = pH L-15，碱性L-15培养基 = 碳酸氢盐L-15。
  2. 准备200 mL pH L-15培养基。
    1. 调节L-15培养基的pH值：首先，在洗瓶中放入若干块干冰。向L-15培养基中通入气体（CO2），直至溶液变为橙色（约pH 6.4，约40个压力单位）。也可使用标准pH计调节pH值。
    2. 用0.22 µm滤膜过滤培养基，于4 °C保存一个月。
  3. 准备100 mL碳酸氢盐L-15培养基。
    1. 将2.5 mL 7%碳酸氢钠溶液加入97.5 mL L-15培养基中，于4 °C保存。
  4. 制备IPCS（胰岛素-腐胺-转铁蛋白-亚硒酸钠）补充剂。
    1. 将2.5 mg胰岛素溶解于0.5 mL 0.1 M HCl中，再加入4.5 mL双蒸水。
    2. 将8 mg腐胺溶解于5 mL磷酸盐缓冲液（PBS）中。
    3. 将100 mg转铁蛋白溶解于10 mL PBS中。
    4. 将1 mg亚硒酸钠溶解于19.3 mL水中，调节pH至7.4，然后将溶液稀释10倍。
    5. 取1 mL胰岛素溶液、1 mL腐胺溶液、1 mL转铁蛋白溶液和0.1 mL亚硒酸钠溶液混合，得到3.1 mL IPCS补充剂溶液。于-20 °C保存。
  5. 制备0.02 mM孕酮溶液。
    1. 将1 mg孕酮溶解于1.6 mL 80%乙醇中。
    2. 用100%乙醇将溶液稀释100倍，于-20 °C保存。
  6. 制备100 mL完全L-15培养基。
    1. 将1.8 mL D-葡萄糖溶液（200 mg/mL）加入92 mL pH L-15中，使终浓度为3.5 mg/mL葡萄糖。
    2. 加入1 mL 100倍青霉素-链霉素溶液（10,000 U/mL）、2 mL热灭活马血清、3.1 mL IPCS混合液和0.1 mL孕酮溶液（2 × 10-5 M）。
    3. 用0.22 µm滤膜过滤培养基，于4 °C保存。
  7. 每项实验准备5 mL密度梯度溶液（终浓度为5.5%）。
    1. 将476 µL商品化的60%密度梯度介质加入4524 µL L-15培养基中（如可能，应使用不含酚红的L-15以增强界面处的视觉对比度；稀释比例为1:10.5）。
    2. 于4 °C保存2周，或于-20 °C冷冻保存。
  8. 制备10 mL培养基。
    1. 将200 µL补充剂加入9.6 mL神经元细胞培养基中。
    2. 将200 µL热灭活马血清（该成分倾向于诱导胶质前体细胞分化并抑制其增殖）加入25 µL谷氨酰胺和10 µL 2-巯基乙醇中。
    3. 用0.22 µm滤膜过滤培养基。
    4. 加入以下神经营养因子：睫状神经营养因子（CNTF）至终浓度10 ng/mL，脑源性神经营养因子（BDNF）和胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）至终浓度均为1 ng/mL。
    5. 于4 °C保存培养基。
  9. 制备50 mL解剖用培养基。
    1. 将2.25 mL葡萄糖溶液（200 mg/mL）加入47.05 mL HBSS中，再加入700 µL 1 M HEPES（pH 7.4）。于4 °C保存。
  10. 制备4% PFA溶液。
    1. 将20 g PFA溶解于500 mL PBS中。
    2. 在化学通风橱中将溶液加热至60 °C，并逐滴加入几滴1 M NaOH，直至溶液澄清。
    3. 用滤纸过滤溶液，并调节pH至7.2。于-20 °C保存。
      注：也可使用其他市售PFA溶液，用PBS稀释至4%。
  11. 使用前用70%乙醇清洁解剖工具（包括镊子、剪刀和硅胶培养皿），使用后用肥皂和清水清洗。

2. 多聚鸟氨酸/层粘连蛋白（Po/L）培养皿包被

注意：体积已调整为适用于包被24孔板。

  1. 如有需要，将一片无菌的12 mm盖玻片放入孔中。
  2. 用500 µL溶于水中的10 µg/mL多聚-L-鸟氨酸溶液包被各孔。
  3. 室温静置1小时。
  4. 吸除多聚-L-鸟氨酸溶液，室温晾干30分钟。
  5. 加入500 µL含3 µg/mL层粘连蛋白的碳酸氢盐L-15培养基，于37 °C孵育过夜。
    注意：包被后的孔可在37 °C培养箱中保存7天。对于长时间孵育，可在孔之间加入无菌PBS，以减少培养基蒸发。

3. 解剖

  1. 当胚胎处于E12.5胚胎期时，处死一只怀孕小鼠，并用70%乙醇清洁腹部。
  2. 切断两侧输卵管和阴道以取出子宫，并将其放入盛有冷PBS（不含Ca2+和Mg2+）的培养皿中。
  3. 收集所有胚胎，并转移至另一盛有新鲜冷PBS（不含Ca2+和Mg2+）的培养皿中。
  4. 将一个胚胎放入涂有硅胶并盛有解剖培养基（含HBSS、4.5 g/L葡萄糖和7 mM HEPES，pH 7.4）的培养皿中。
    注意：胚胎解剖应在显微镜下使用洁净的精细镊子和剪刀进行。也可使用未涂硅胶的普通培养皿进行解剖。
  5. 使用镊子代替剪刀，去除头部、尾部及内脏组织。
  6. 用镊子将胚胎腹部朝下固定在硅胶表面。
  7. 用另一对镊子，将其中一个尖端插入头端脊髓中央管内。
  8. 闭合镊子，撕开几毫米的背侧组织。
  9. 重复此操作，向尾端方向推进，直至整个脊髓完全打开（图1B）。
  10. 将头端脊髓（脑干部分）从身体上分离。
  11. 翻转胚胎，使打开的脊髓面紧贴硅胶表面。
  12. 夹住脊髓头端，用镊子夹住胚胎头部并向外拉，以完整取出脊髓。
    注意：脑膜和背根神经节（DRGs）应保留在胚胎残体上。若仍有残留附着于脊髓，则需小心将其剥离。在此步骤中，也可收集DRGs用于感觉神经元培养（见讨论部分）。
  13. 将脊髓在硅胶表面展平，使用手术刀沿两侧中线切开，去除背侧半部分。再用手术刀将中间部分切成10段，转移至新离心管中。

4. 脊髓细胞悬液

  1. 重复此解剖步骤，共处理6至8根脊髓。
  2. 让脊髓组织块沉降至离心管底部，吸除HBSS，加入1 mL Ham-F10培养基。
  3. 加入10 µL胰蛋白酶（2.5% w/v；终浓度0.025%），于37 °C孵育10分钟。
  4. 为终止酶消化反应，将组织碎片转移至新的15 mL离心管中，该管预先加入800 µL完全L-15培养基、100 µL 4%（w/v）BSA和100 µL DNase（1 mg/mL溶于L-15培养基）。
  5. 使用P1000移液器吸取1 mL液体，吹打混悬两次。静置2分钟使碎片沉降，将上清液收集至新的15 mL离心管中。
  6. 向残留的组织碎片中加入900 µL完全L-15培养基、100 µL 4%（w/v）BSA和100 µL DNase（1 mg/mL溶于L-15培养基）。
  7. 使用P1000移液器吸取1 mL液体，吹打混悬6次。静置2分钟使碎片沉降，将上清液加入第4.5步获得的15 mL离心管中。
  8. 向残留的组织碎片中加入900 µL完全L-15培养基、100 µL 4%（w/v）BSA和100 µL DNase（1 mg/mL溶于L-15培养基）。
  9. 使用P1000移液器吸取1 mL液体，吹打混悬10次。静置2分钟使碎片沉降，将上清液加入第4.5步获得的15 mL离心管中。后续操作使用此上清液。
  10. 使用P1000移液器，轻轻将2 mL 4%（w/v）BSA垫层加至含有上清液的离心管底部。以470 × g离心5分钟。
  11. 吸除上清液，用2 mL完全L-15培养基重悬细胞沉淀。

5. 通过梯度密度进行MN富集

  1. 将细胞悬液分装至两个15 mL离心管中（每管1 mL），然后每管加入2 mL完全L-15培养基。若起始样本为6枚胚胎，则每管加入相当于3枚胚胎的样本，置于3 mL培养基中。
  2. 缓慢将密度梯度溶液加入每根试管底部，加入量为2 mL，以获得清晰的界面。
  3. 在室温下以830 × g离心15分钟。此步骤后，小细胞应位于管底，而运动神经元（MNs）等大细胞应位于密度梯度溶液与培养基的界面处。
  4. 收集界面处的细胞，吸取1至2 mL转移至新的15 mL离心管中。调整体积 用L-15培养基调pH至10 mL。
  5. 向离心管底部加入 2 mL 4% BSA 垫层 在室温下以470 × g离心5分钟。
  6. 移除上清液，并将沉淀重悬于3 mL完全L-15培养基中。
  7. 重复步骤 5.5。
  8. 吸除上清液，将细胞沉淀重悬于2 mL完全培养基中。使用血细胞计数板在相差显微镜下对细胞数量和活力进行计数。
    注意：对于6个脊髓样本，预期细胞数量约为1 x 105 运动神经元。

6. MN 培养

  1. 将运动神经元（MNs）稀释至适当密度，通常在24孔板中每孔加入500 µL培养基，含5,000至10,000个细胞。
    注意：6孔板和96孔板的接种密度分别约为30,000个和1,500个细胞。
  2. 使用P1000移液器吸除层粘连蛋白（laminin）溶液。
  3. 立即将稀释于培养基中的运动神经元（MNs）转移至包被好的培养板中，避免干燥。
  4. 在37 °C条件下培养2天。

7. MNs 的磁转染

注意：以下步骤中使用的试剂用量适用于24孔板的一个孔的转染。如需其他规格，请参考生产商的说明书。

  1. 进行DNA制备时，将1 µg DNA重悬于50 µL神经元培养基中，并涡旋振荡5秒。
  2. 进行微珠管制备时，将1.5 µL微珠重悬于50 µL神经元培养基中。
  3. 将50 µL微珠溶液加入50 µL DNA溶液中，室温孵育20分钟（总体积 = 100 µL）。
  4. 孵育期间，从将要转染的孔中吸出100 µL培养基。
    注意：将磁力板放入培养箱中，使其预热至37 °C。
  5. 将100 µL DNA/微珠混合液转移至孔中，并将培养板置于37 °C磁力板上孵育20–30分钟。
  6. 在检测cDNA表达前，至少等待24小时。

8. 固定与染色

  1. 用 PBS 洗涤培养物 2 次。
  2. 在4% PFA/PBS中室温孵育培养物20分钟。
  3. 用 PBS 洗涤培养物 2 次。
  4. 在室温下，将样品在500 µL封闭缓冲液（PBS，4% BSA，2%正常血清，0.3% Triton X-100，0.1 M甘氨酸）中孵育1小时。
    注意：正常血清应来源于与二抗相同的物种（例如， 正常山羊血清
  5. 在4 °C下用250 µL封闭缓冲液稀释的一抗溶液孵育过夜。
    注意：例如，TUJ1 的使用浓度为 1/1000，SMI32 的使用浓度为 1/1,000，Lc3b 的使用浓度为 1/200。
  6. 用 PBS 洗涤培养物 3 次。
  7. 在250 µL封闭缓冲液中，将培养物与荧光素标记的二抗稀释后于室温孵育1小时。
  8. 用 PBS 洗涤培养物 3 次。
  9. 使用封片剂将样本封固于玻璃载玻片上。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

培养24小时后，运动神经元（MNs）应已表现出显著的轴突生长（长度至少为胞体大小的6倍以上）。在随后的几天中，轴突应继续生长并出现分支（图2）。由于亚型特异性，不同亚型的运动神经元会呈现不同的形态。例如，支配躯干肌肉的中柱运动神经元，其轴突较短且分支较多，而支配肢体肌肉的外侧柱运动神经元则具有更长且分支较少的轴突18。

上述分离与培养技术最近被用于鉴定神经丝蛋白基因 NEFH 中一种新的突变，该突变导致常染色体显性遗传的轴突型腓骨肌萎缩症（CMT）13。在此研究中，铺板后两天，将纯化的运动神经元转染表达突变型 NEFH 与 eGFP 融合的质粒，或野生型 NEFH 与 eGFP 融合的质粒。两天后，突变型 NEFH-eGFP 沿细胞骨架网络形成聚集体。磁转染四天后，这些聚集体进一步发展为显著的核周包...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

该方案的一个关键点在于，小鼠胚胎必须在发育的特定时间窗口（E12.5）进行解剖，以最大化最终获得的运动神经元（MNs）数量。此外，为获得最佳产量，解剖操作应于上午或下午早些时候进行。在E12.5之前（例如， 在E11.5之后，解剖难度增加，尤其是去除脑膜的操作更为困难。E12.5之后，所获得的运动神经元数量显著下降。为控制胚胎发育阶段，首先于每日结束时将成年雌鼠与雄鼠合笼。次日早晨将成年鼠分笼，并检查雌鼠是否存在阴道栓。若发现阴道栓，则认定胚胎发育处于E0.5阶段。本实验通常采用一种活力强且繁殖性能优良的小鼠品系。本方案所用的繁殖群体源自美国密苏里州培育的种群，品系命名为CF1（Carworth Farms strain 1）。该品系于1967年引入法国Charles River Laboratories，并被命名为OF1（Oncins France 1）。

第二个关键点是离心步骤，其对培养物的纯度有显著影响。运动神经元（MNs）在脊髓细胞中所占比例较低（约1%），目标是获得一个在其他脊髓神经元细胞中包含40%至50%运动神经元、且胶质细胞前体少于5%的培养物。为...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

我们感谢“"神经遗传学发展协会"为Jacquier博士提供的博士后资助，以及AFM-Telethon通过MyoNeurAlp战略计划提供的支持。我们还要感谢Chris Henderson博士、William Camu博士、Brigitte Pettmann博士、Cedric Raoul博士和Georg Haase博士，他们参与了该技术的开发与改进，并传播了相关知识。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
材料
硅胶解剖皿生命系统仪器设备DD-90-S-BLK-3PKSylgard
圆形盖玻片NeuVitro，Knittel 玻璃GG-12-Pre12 mm
滑动Lyzer小室ThermoFisher Scientific6603020,000 MWCO ；30 mL
滤器单元MilliporeSCGVU02RE
GP 无菌注射器滤器MilliporeSLGP033RS
4孔板ThermoFisher Scientific167063Nunclon Delta 处理板
镊子杜蒙特的FST11252-20#5 镊子
剪刀杜蒙特的FST14060-10精细剪刀
手术刀杜蒙特的FST10035-20弯形刀片
手术刀杜蒙特的FST10316-14微型手术刀
培养皿格赖纳663102ø x h = 100 x 15 mm
15 mL 聚丙烯管Falcon352096
滤纸Watman1001125圆形，直径125毫米
玻璃培养皿载玻片Lab-Tek1545264孔板
质粒 pCAGENAddgene#11160
脊髓运动神经元的原代培养、磁转染及免疫染色方法公司目录编号评论
溶液与培养基
牛血清白蛋白Sigma-AldrichA9418
L-15 培养基ThermoFisher Scientific11415056
L-15 培养基，无酚红ThermoFisher Scientific21083027
胰岛素Sigma-AldrichI6634
腐胺Sigma-AldrichP5780
伴清蛋白Sigma-AldrichC7786
亚硒酸钠Sigma-AldrichS5261
孕酮Sigma-AldrichP8783
聚-DL-鸟氨酸Sigma-AldrichP8638
层粘连蛋白Sigma-AldrichL2020
2.5% 胰蛋白酶，10 倍浓度ThermoFisher Scientific15090046
DNA酶Sigma-AldrichDN25
不含 Ca、Mg 的 PBSThermoFisher Scientific14190144不含 Mg2+ 钙2+
碳酸氢钠ThermoFisher Scientific25080094
神经元细胞培养基ThermoFisher ScientificA3582901Neurobasal Plus 培养基
HBSSSigma-AldrichH6648-500ML
HEPES缓冲液 1 MThermoFisher Scientific15630056
密度梯度介质Sigma-AldrichD1556Optiprep
补充培养基ThermoFisher ScientificA3582801B-27 Plus
马血清，热灭活ThermoFisher Scientific26050-088
L-谷氨酰胺 200 mMThermoFisher Scientific25030024
2-巯基乙醇ThermoFisher Scientific31350010
青霉素/链霉素ThermoFisher Scientific1514012210,000 U/mL
名称公司目录编号评论
免疫荧光
PBS，10 倍浓缩液ThermoFisher ScientificX0515不含 Mg2+ Ca2+
多聚甲醛（PFA）Sigma-Aldrich441244
正常山羊血清Sigma-AldrichG6767
甘氨酸Sigma-AldrichG7126
Triton X-100Sigma-AldrichT8787
胆碱乙酰转移酶（CHAT）ChemiconAb144P
非磷酸化神经丝蛋白H（SMI32）BiolegendsSMI-32PIF 1:1000
Islet-1DSHB40.2D6
Islet-2DSHB39.4D5
Hb9DSHB81.5C10
Vectashield 封片剂Vector LabH-1000
β3微管蛋白（Tuj1克隆）Biolegends801201IF 1/1000
Lc3bCell Signaling Technology#2775免疫荧光，1:200

参考文献

  1. Gonzalez, M. A., et al. A novel mutation in VCP causes Charcot-Marie-Tooth Type 2 disease. Brain. 137 (11), 2897-2902 (2014).
  2. Johnson, J. O., et al. Exome sequencing reveals VCP mutations as a cause of familial ALS. Neuron. 68 (5), 857-864 (2010).
  3. Watts, G. D. J., et al. Inclusion body myopathy associated with Paget disease of bone and frontotemporal dementia is caused by mutant valosin-containing protein. Nature Genetics. 36 (4), 377-381 (2004).
  4. Brown, R. H., Al-Chalabi, A. Amyotrophic Lateral Sclerosis. New England Journal of Medicine. 377 (2), 162-172 (2017).
  5. Taylor, J. P., Brown, R. H., Cleveland, D. W. Decoding ALS: from genes to mechanism. Nature. 539 (7628), 197-206 (2016).
  6. Henderson, C. E., Bloch-Gallego, E., Camu, W. Purified embryonic motoneurons. Nerve Cell Culture: A Practical Approach. , 69-81 (1995).
  7. Henderson, C. E., et al. GDNF: a potent survival factor for motoneurons present in peripheral nerve and muscle. Science. 266 (5187), 1062-1064 (1994).
  8. Schaller, S., et al. Novel combinatorial screening identifies neurotrophic factors for selective classes of motor neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (12), E2486-E2493 (2017).
  9. Jacquier, A., et al. Alsin/Rac1 signaling controls survival and growth of spinal motoneurons. Annals of Neurology. 60 (1), 105-117 (2006).
  10. Raoul, C., et al. Chronic activation in presymptomatic amyotrophic lateral sclerosis (ALS) mice of a feedback loop involving Fas, Daxx, and FasL. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (15), 6007-6012 (2006).
  11. Madji Hounoum, B., et al. Wildtype motoneurons, ALS-Linked SOD1 mutation and glutamate profoundly modify astrocyte metabolism and lactate shuttling. Glia. 65 (4), 592-605 (2017).
  12. Magrane, J., Sahawneh, M. A., Przedborski, S., Estevez, A. G., Manfredi, G. Mitochondrial Dynamics and Bioenergetic Dysfunction Is Associated with Synaptic Alterations in Mutant SOD1 Motor Neurons. Journal of Neuroscience. 32 (1), 229-242 (2012).
  13. Jacquier, A., et al. Cryptic amyloidogenic elements in mutant NEFH causing Charcot-Marie-Tooth 2 trigger aggresome formation and neuronal death. Acta Neuropathologica Communications. 5, (2017).
  14. Aebischer, J., et al. IFNγ triggers a LIGHT-dependent selective death of motoneurons contributing to the non-cell-autonomous effects of mutant SOD1. Cell Death and Differentiation. 18 (5), 754-768 (2011).
  15. Wiese, S., et al. Isolation and enrichment of embryonic mouse motoneurons from the lumbar spinal cord of individual mouse embryos. Nature Protocols. 5 (1), 31-38 (2010).
  16. Camu, W., Henderson, C. E. Purification of embryonic rat motoneurons by panning on a monoclonal antibody to the low-affinity NGF receptor. Journal of Neuroscience Methods. 44 (1), 59-70 (1992).
  17. Conrad, R., Jablonka, S., Sczepan, T., Sendtner, M., Wiese, S., Klausmeyer, A. Lectin-based Isolation and Culture of Mouse Embryonic Motoneurons. Journal of Visualized Experiments. (55), (2011).
  18. Wichterle, H., Lieberam, I., Porter, J. A., Jessell, T. M. Directed differentiation of embryonic stem cells into motor neurons. Cell. 110 (3), 385-397 (2002).
  19. Francius, C., Clotman, F. Generating spinal motor neuron diversity: a long quest for neuronal identity. Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (5), 813-829 (2014).
  20. Neto, E., et al. Compartmentalized Microfluidic Platforms: The Unrivaled Breakthrough of In Vitro Tools for Neurobiological Research. The Journal of Neuroscience. 36 (46), 11573-11584 (2016).
  21. Matsuda, T., Cepko, C. L. Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (1), 16-22 (2004).
  22. Sleigh, J. N., Weir, G. A., Schiavo, G. A simple, step-by-step dissection protocol for the rapid isolation of mouse dorsal root ganglia. BMC Research Notes. 9, (2016).
  23. Yu, L., et al. Highly efficient method for gene delivery into mouse dorsal root ganglia neurons. Frontiers in Molecular Neuroscience. 8 (2), (2015).
  24. Malin, S. A., Davis, B. M., Molliver, D. C. Production of dissociated sensory neuron cultures and considerations for their use in studying neuronal function and plasticity. Nature Protocols. 2 (1), 152-160 (2007).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

探索更多文章

运动神经元培养脊髓解剖密度梯度离心磁转染转染原代运动神经元富集神经丝免疫染色共聚焦显微镜分析Charcot-Marie-Tooth病建模轴突运输评估神经退行性变机制
建模查理-玛丽-图斯病 体外 通过转染小鼠原代运动神经元
联系我们
向图书馆推荐

隐私政策

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。