建模查理-玛丽-图斯病 体外 通过转染小鼠原代运动神经元

摘要

该技术的目的是从鼠类脊髓中制备高度富集的原代运动神经元（MNs）培养物。为了评估导致运动神经元疾病突变的影响，本文描述了这些分离的运动神经元的获取及其通过磁转染法进行转染的方法。

摘要

脊髓运动神经元（MNs）的神经退行性变与多种神经系统疾病相关，包括肌萎缩侧索硬化症、腓骨肌萎缩症（Charcot-Marie-Tooth病）和脊髓性肌萎缩症，这些疾病均伴有肌肉萎缩。脊髓运动神经元的原代培养已被广泛用于验证特定基因在上述疾病中的作用，并表征其突变所导致的细胞学后果。本实验方案基于Henderson及其同事二十多年前的开创性工作，建立了一种原代运动神经元培养模型。首先，我们详细描述了从小鼠胚胎脊髓前角分离运动神经元的方法，并利用密度梯度离心技术将运动神经元与邻近细胞分离。随后，我们介绍了一种利用磁转染技术高效转染运动神经元表达质粒的新方法。最后，我们展示了如何对原代培养的运动神经元进行固定和免疫染色。通过使用导致2型腓骨肌萎缩症的神经丝蛋白突变，本方案展示了一种定性研究目的蛋白表达及其在运动神经元生长、维持和存活中作用的方法。

引言

神经肌肉疾病包含多种在临床表现和遗传特征上各不相同的病理类型，其共同特征是肌肉和/或神经系统发生异常。随着测序技术的进步，在过去十年中已鉴定出数百个导致这些罕见疾病的相关基因（基因列表可参见神经肌肉疾病中心：http://neuromuscular.wustl.edu/index.html）。已发现的突变类型表明，同一基因的不同突变可导致不同的表型和疾病^1,2,3，而不同基因的突变也可能产生相似的表型^4,5。在此背景下，研究人员正致力于开发细胞模型，以期成为分析突变后果及病理机制的有力工具。

脊髓运动神经元的胞体较大，位于脊髓前角，其轴突较长，支配骨骼肌纤维，并通过在神经肌肉接头处释放乙酰胆碱实现随意运动。由于运动神经元会受到肌萎缩侧索硬化症、腓骨肌萎缩症（CMT）和脊髓性肌萎缩症等神经肌肉疾病的影响，Henderson 博士及其同事开发了首个实验方案⁶ 可实现培养的 体外 脊髓运动神经元及神经营养因子GDNF的发现⁷ （胶质细胞源性神经营养因子）。自那以后，技术....

方案

所有涉及动物的实验程序均获得本机构伦理委员会的批准。

1. 溶液配制

1. 准备10 mL用L-15培养基透析的4% BSA溶液。
   1. 将牛血清白蛋白粉末以4%（w/v）浓度溶解于10 mL L-15培养基中。
   2. 将溶液加入截留分子量为20 kDa的20 mL透析盒中，于4 °C下在500 mL L-15培养基中透析3天，并持续搅拌。每天更换一次L-15培养基。
   3. 用0.22 µm滤膜过滤溶液，并分装至15 mL离心管中。于-20 °C保存。
      注：本方案中使用以下命名方式：未修饰的原始L-15培养基 = L-15培养基，酸性L-15培养基 = pH L-15，碱性L-15培养基 = 碳酸氢盐L-15。
2. 准备200 mL pH L-15培养基。
   1. 调节L-15培养基的pH值：首先，在洗瓶中放入若干块干冰。向L-15培养基中通入气体（CO₂），直至溶液变为橙色（约pH 6.4，约40个压力单位）。也可使用标准pH计调节pH值。
   2. 用0.22 µm滤膜过滤培养基，于4 °C保存一个月。
3. 准备100 mL碳酸氢盐L-15培养基。
   1. 将2.5 mL 7%碳酸氢钠溶液加入97.5 mL L-15培养基中，于4 °C保....

结果

培养24小时后，运动神经元（MNs）应已表现出显著的轴突生长（长度至少为胞体大小的6倍以上）。在随后的几天中，轴突应继续生长并出现分支（图2）。由于亚型特异性，不同亚型的运动神经元会呈现不同的形态。例如，支配躯干肌肉的中柱运动神经元，其轴突较短且分支较多，而支配肢体肌肉的外侧柱运动神经元则具有更长且分支较少的轴突¹⁸。

上述分离与培养技术最近被用于鉴定神经丝蛋白基因 NEFH 中一种新的突变，该突变导致常染色体显性遗传的轴突型腓骨肌萎缩症（CMT）¹³。在此研究中，铺板后两天，将纯化的运动神经元转染表达突变型 NEFH 与 eGFP 融合的质粒，或野生型 NEFH 与 eGFP 融合的质粒。两天后，突变型 NEFH-eGFP 沿细胞骨架网络形成聚集体。磁转染四天后，这些聚集体进一步发展为显著的核周包.......

讨论

该方案的一个关键点在于，小鼠胚胎必须在发育的特定时间窗口（E12.5）进行解剖，以最大化最终获得的运动神经元（MNs）数量。此外，为获得最佳产量，解剖操作应于上午或下午早些时候进行。在E12.5之前（例如， 在E11.5之后，解剖难度增加，尤其是去除脑膜的操作更为困难。E12.5之后，所获得的运动神经元数量显著下降。为控制胚胎发育阶段，首先于每日结束时将成年雌鼠与雄鼠合笼。次日早晨将成年鼠分笼，并检查雌鼠是否存在阴道栓。若发现阴道栓，则认定胚胎发育处于E0.5阶段。本实验通常采用一种活力强且繁殖性能优良的小鼠品系。本方案所用的繁殖群体源自美国密苏里州培育的种群，品系命名为CF1（Carworth Farms strain 1）。该品系于1967年引入法国Charles River Laboratories，并被命名为OF1（Oncins France 1）。

第二个关键点是离心步骤，其对培养物的纯度有显著影响。运动神经元（MNs）在脊髓细胞中所占比例较低（约1%），目标是获得一个在其他脊髓神经元细胞中包含40%至50%运动神经元、且胶质细胞前体少于5%的培养物。为.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
材料
硅胶解剖皿	生命系统仪器设备	DD-90-S-BLK-3PK	Sylgard
圆形盖玻片	NeuVitro，Knittel 玻璃	GG-12-Pre	12 mm
滑动Lyzer小室	ThermoFisher Scientific	66030	20,000 MWCO ；30 mL
滤器单元	Millipore	SCGVU02RE
GP 无菌注射器滤器	Millipore	SLGP033RS
4孔板	ThermoFisher Scientific	167063	Nunclon Delta 处理板
镊子	杜蒙特的FST	11252-20	#5 镊子
剪刀	杜蒙特的FST	14060-10	精细剪刀
手术刀	杜蒙特的FST	10035-20	弯形刀片
手术刀	杜蒙特的FST	10316-14	微型手术刀
培养皿	格赖纳	663102	ø x h = 100 x 15 mm
15 mL 聚丙烯管	Falcon	352096
滤纸	Watman	1001125	圆形，直径125毫米
玻璃培养皿载玻片	Lab-Tek	154526	4孔板
质粒 pCAGEN	Addgene	#11160
脊髓运动神经元的原代培养、磁转染及免疫染色方法	公司	目录编号	评论
溶液与培养基
牛血清白蛋白	Sigma-Aldrich	A9418
L-15 培养基	ThermoFisher Scientific	11415056
L-15 培养基，无酚红	ThermoFisher Scientific	21083027
胰岛素	Sigma-Aldrich	I6634
腐胺	Sigma-Aldrich	P5780
伴清蛋白	Sigma-Aldrich	C7786
亚硒酸钠	Sigma-Aldrich	S5261
孕酮	Sigma-Aldrich	P8783
聚-DL-鸟氨酸	Sigma-Aldrich	P8638
层粘连蛋白	Sigma-Aldrich	L2020
2.5% 胰蛋白酶，10 倍浓度	ThermoFisher Scientific	15090046
DNA酶	Sigma-Aldrich	DN25
不含 Ca、Mg 的 PBS	ThermoFisher Scientific	14190144	不含 Mg2+ 钙2+
碳酸氢钠	ThermoFisher Scientific	25080094
神经元细胞培养基	ThermoFisher Scientific	A3582901	Neurobasal Plus 培养基
HBSS	Sigma-Aldrich	H6648-500ML
HEPES缓冲液 1 M	ThermoFisher Scientific	15630056
密度梯度介质	Sigma-Aldrich	D1556	Optiprep
补充培养基	ThermoFisher Scientific	A3582801	B-27 Plus
马血清，热灭活	ThermoFisher Scientific	26050-088
L-谷氨酰胺 200 mM	ThermoFisher Scientific	25030024
2-巯基乙醇	ThermoFisher Scientific	31350010
青霉素/链霉素	ThermoFisher Scientific	15140122	10,000 U/mL
名称	公司	目录编号	评论
免疫荧光
PBS，10 倍浓缩液	ThermoFisher Scientific	X0515	不含 Mg2+ Ca2+
多聚甲醛（PFA）	Sigma-Aldrich	441244
正常山羊血清	Sigma-Aldrich	G6767
甘氨酸	Sigma-Aldrich	G7126
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787
胆碱乙酰转移酶（CHAT）	Chemicon	Ab144P
非磷酸化神经丝蛋白H（SMI32）	Biolegends	SMI-32P	IF 1:1000
Islet-1	DSHB	40.2D6
Islet-2	DSHB	39.4D5
Hb9	DSHB	81.5C10
Vectashield 封片剂	Vector Lab	H-1000
β3微管蛋白（Tuj1克隆）	Biolegends	801201	IF 1/1000
Lc3b	Cell Signaling Technology	#2775	免疫荧光，1:200