我们建立了一种新的手术技术用于 在体 大鼠单个肝叶灌注模型作为深入研究的前提 体内 未来部分肝脏组织工程
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摘要
摘要
器官工程是一种用于生成可移植肝脏替代物的新型策略。近年来， 体内 肝脏组织工程，包括 体内 器官脱细胞后重新接种细胞的方法，已成为一种颇具前景的策略 离体 肝脏组织工程。然而，术后存活尚未实现。本研究旨在开发一种新型外科手术技术 体内 大鼠选择性肝叶灌注作为前提条件 体内 肝脏组织工程。我们仅通过左外叶建立旁路循环，随后用肝素化生理盐水灌注左外叶。实验共分为4组（n 每组3只大鼠，根据不同的灌注时间（20分钟、2小时、3小时和4小时）进行分组。模型建立成功的指标包括动物存活情况，以及肉眼可见的颜色变化和组织学上门管区及肝窦内红细胞的缺失。在对左外叶进行选择性灌注后，我们观察到左外叶确实由红色变为淡黄色。组织学评估显示，门静脉分支、中央静脉及肝窦内均无可见的血细胞。当重新开放被阻断的血管后，左外叶恢复为红色。12只大鼠中有12只在手术后存活超过一周。我们是首个报道该手术模型的团队 体内 单个肝叶灌注，可实现超过一周的长期存活。与先前发表的报道相比，本技术最重要的优势在于在整个操作过程中维持了70%肝脏的灌注。该技术的建立为 体内 大鼠部分肝脏组织工程，包括脱细胞与再细胞化
引言
器官移植的适应证正在不断扩大。相比之下，器官捐献率和器官总体质量却在下降，导致移植物需求日益增加。加入肝移植等待名单的患者数量持续上升（例如，2016年美国新增患者11,340例，而2015年为10,636例1尽管付出了巨大努力，可用器官的数量仍无法满足临床需求。由于肝病发病率上升，许多终末期肝病患者在等到供体器官之前，便在移植等待名单上死亡。为了满足对供体肝移植物的巨大需求，研究人员正在积极探索基于肝脏组织工程原理的替代方案。2如今，一种新开发的肝脏组织工程技术有望克服这一短缺问题。
肝脏组织工程包含两个步骤：首先生成无细胞支架，然后对支架进行细胞重植。为了获得生物来源的无细胞肝脏支架，需对离体肝脏进行灌注 通过 通过灌注离子型或非离子型去垢剂来处理血管系统，从而去除肝脏中的细胞成分。在以往大多数研究中，通常采用十二烷基硫酸钠与Triton X-100联合灌注肝脏，以获得生物来源的无细胞肝脏支架。该方法可完全清除所有细胞，同时保留细胞外基质的结构。随后，将器官支架重新接种成熟细胞，包括肝细胞、内皮细胞系，以及原代肝细胞，可同时或不同时联合应用内皮细胞或间充质干细胞（MSC）。大多数研究人员关注于 离体 肝脏组织工程3,4<....
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方案
饲养和所有操作均符合德国动物福利法规。所有纱布、覆盖衣物和手术器械均在手术前经过高压灭菌并做好准备。所有操作均在无菌条件下进行。
1. 手术前大鼠的准备
- 将大鼠放入诱导室中，使用4%异氟烷蒸气和100%氧气（流速0.5 L/min）麻醉约3分钟，直至大鼠完全麻醉。
- 将大鼠从诱导室中取出，并测量其体重。
- 剃除腹部手术区域的毛发。
- 将动物再次放入异氟烷诱导室中额外麻醉2分钟，以加深麻醉程度。
- 将大鼠仰卧位放置于手术台上。
- 将麻醉面罩固定在大鼠口鼻部位，并以2%异氟烷蒸气和100%氧气持续供气（流速0.5 L/min）维持麻醉状态。
- 用胶带固定四肢。
- 在双眼涂抹兽用眼膏，防止角膜干燥。
- 皮下注射0.05 mg/kg的丁丙诺啡，以缓解手术期间的疼痛。
- 用碘酊对腹部手术区域进行三遍消毒，再用70%酒精进行两遍脱碘处理。
- 在切口周围放置无菌纱布，仅暴露腹部手术区域。
- 当大鼠足趾夹捏回缩反射消失时，开始进行手术操作。
2. 大鼠剖腹手术
- 使用剪刀和电凝器做腹部横向皮肤和肌肉切口。
- 用4-0聚丙烯缝线将剑突固定并向头侧牵拉。
....
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结果
十二只雄性（12-13周龄）Lewis大鼠用于评估选择性肝叶灌注的效果。实验分为四组（n 每组3只大鼠。通过采用20分钟、2小时、3小时和4小时的不同灌注时间，按照上述步骤操作，我们成功实现了 体内 单叶灌注
在体实验 左外叶灌注：
肝素化生理盐水灌注后，可通过观察结果确认左门静脉与左肝外侧静脉的准确解剖定位及成功插管。成功定位与插管的首个指标是观察到左外侧肝叶流出的液体为含有灌注液的血液混合物 通过 流体出口（图4A）。通过观察肝素化生理盐水灌注后左外叶颜色的变化，进一步验证了手术灌注模型的成功。左外叶的颜色由鲜红色变为淡黄色，表明左.......
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讨论
通过使用导管阻断并插管左门静脉作为液体入口，同时使用另一导管阻断并插管左外侧肝静脉作为液体出口，我们成功建立了 体内 左外叶存在液体旁路，表明尽管该技术因血管细小难以插管且出血风险较高而极具挑战性，但仍具有可行性。即使接受长达4小时灌注的实验大鼠，术后至少存活1周，说明大鼠能够耐受该手术操作。
在下述部分中，我们将描述技术上最具挑战性且最关键的三个步骤，以及如何成功掌握它们。首先，在分离和结扎左门静脉的过程中，由于目标门静脉与周围肝实质存在紧密的空间关系，分离血管时有较高的出血风险。我们建议使用显微镊子而非剪刀来分离左门静脉，通过仔细撕开左门静脉周围相连的无血管组织实现。其次，在左门静脉前壁切口的操作中，若前壁切口过大，可能增加切口修复的难度，并提高血管吻合后发生狭窄的概率。我们建议使用带针导管而非剪刀，以制作大小合适的切口。第三，在阻断左肝外侧静脉时，若对左肝外侧静脉暴露段的阻断位置不当，则无法为后续插管操作留出足够的暴露空间。我们建议夹闭位置应靠近左肝中叶侧，而非位于左肝外侧静脉暴露段的中央区域。
我们比.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者谨此感谢耶拿大学医院解剖学研究所 I 的 Jens Geiling，他绘制了大鼠肝脏解剖结构的示意图。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 灌注泵 | |||
| Perfusor VI | B. Braun, Melsungen | ||
| 导管 | |||
| Versatus-W 导管 | Terumo | SR+DU2419PX | 24G, 0.74×19mm |
| Versatus-W 导管 | Terumo | SR+DU2225PX | 22G, 0.9×25mm |
| 显微外科器械 | |||
| 显微剪刀 | F·S·L | No. 14058-09 | |
| 显微止血夹钳 | F·S·L | No.18055-05 | |
| 显微夹钳施加器 | F·S·L | No. 18057-14 | |
| 直头显微镊 | F·S·L | No. 00632-11 | |
| 弯头显微镊 | F·S·L | No. 00649-11 | |
| 显微持针器 | F·S·L | No. 12061-01 | |
| 普通外科器械 | |||
| 标准剪刀 | F·S·L | ||
| 蚊式钳 | F·S·L | ||
| 有齿镊 | F·S·L | ||
| 带齿镊 | F·S·L | ||
| 持针器 | F·S·L | ||
| 缝线 | |||
| 4-0 Prolene | ethicon | ||
| 4-0 ETHICON*II | ethicon | ||
| 6-0 丝线 | ethicon | ||
| 11-0 聚酰胺 | ethicon |
参考文献
- Kim, W. R., et al. OPTN / SRTR 2016 Annula Data Report: Liver. American Journal of Transplantation. Suppl. 1, 172-253 (2018).
- Palakkan, A. A., Hay, D. C., Anil Kumar, P. R., Kumary, T. V., Ross, J. A. Liver tissue engineering and cell sources: issues and chal....
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