我们开发了一种简单且多功能的系统，用于在实验兔上饲喂硬蜱。该方法操作简便，使用易于获取的材料，并可根据不同实验条件进行调整。该技术可在整个饲喂期间方便地对蜱虫进行观察和/或取样。
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本文内容
摘要
摘要
在蜱虫研究中使用活体动物对于多种实验目的至关重要，包括在实验室中维持硬蜱种群。蜱虫的所有发育阶段（除卵外）均为吸血性，必须在附着于脊椎动物宿主时获取血液餐，才能顺利完成其生命周期。本文展示了一种利用易于开启的胶囊装置在兔子身上饲喂硬蜱的简便方法。该方法的优点包括操作简单、持续时间短，更重要的是可根据特定实验需求灵活调整。该方法允许在同一动物身上使用多个不同尺寸的饲喂室，从而可同时饲喂多个发育阶段的蜱虫或不同的实验组，减少总体动物使用量。所用材料无刺激性且易于获取，可最大程度降低动物不适，实验结束后动物可轻松恢复，并在符合伦理规范的前提下被领养或重复使用。
引言
硬蜱（Ixodidae）是众所周知的缓慢取食节肢动物，可在宿主身上附着数天甚至数周，具体时长取决于物种和发育阶段1。这类专性吸血节肢动物可传播多种病原体，如细菌、原虫和病毒，因而对人类和动物健康构成重大威胁1。在研究蜱虫生物学特性或评估新型防控方法时，建立有效的蜱虫饲喂系统对于合理设计实验并实现研究目标至关重要。近年来，已开发出多种人工蜱虫饲喂系统（避免使用活体动物）2,3,4，应尽可能采用这些方法。然而，这些系统尚无法完全替代在活体动物上的蜱虫饲喂，且在许多生理条件要求下并不适合作为科学实验的替代方案。因此，在某些情况下，使用实验动物宿主对于确保实验结果的相关性至关重要。
实验室饲养的新西兰兔已被证明是多种硬蜱科蜱虫最合适且最易获得的宿主5,6,7,8,9。目前常用于兔子上蜱虫吸血的两种策略包括：a) 在兔耳上覆盖棉布或袜子后让蜱虫吸血6,7；b) 将蜱虫置于固定于兔背的棉袋9、尼龙瓶10或氯丁橡胶饲养室11 中进行吸血。兔耳吸血法并非理想系统，因为蜱虫（尤其是早期阶段的幼虫或若虫）可能爬入耳道深处并附着吸血，这会使动物感到不适，且难以监测蜱虫的吸血过程或回收饱血蜱虫。该方法还受限于仅能在佩戴伊丽莎白圈保护的袜子完全覆盖的两只耳朵上设置两个蜱虫组，给动物带来显著不适。其他系统9,10,11显然更为先进，适用于硬蜱种群的长期维持。然而，这些系统在可同时设置的实验组数量以及饲养室可调节的尺寸和形状方面仍存在局限。此外，这些操作方案通常需要束缚兔子的后肢以防止抓挠，并使用伊丽莎白圈以避免动物自我理毛行为干扰实验。
本文提出一种简单、省力且高效的喂养方法，可将多个硬蜱群体置于粘附于兔背部并由外套覆盖的密闭小室中进行饲喂，从而避免实验过程中使用伊丽莎白圈或束缚四肢。具体而言，本系统采用由乙烯-醋酸乙烯酯（EVA）泡沫片制成的弹性胶囊，外覆蚊帐网，并使用快速固化（3分钟）且无刺激性的乳胶胶水将其粘附于剃毛后的兔背部。该技术可灵活固定多个所需尺寸或形状的胶囊，实验结束数周后，兔子可完全恢复。该系统主要适用于硬蜱的若虫和成虫阶段，稍加改进后也可用于幼虫的饲喂。基于EVA泡沫的硬蜱饲喂方法可推广至其他类型的脊椎动物宿主，例如绵羊（本文中展示了该替代方案之一）。
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方案
注意：本研究中，家兔饲养于标准笼具中，并提供食物和水 随意摄取 在法国食品、环境与职业健康局 & 安全（ANSES）认证的动物设施，位于法国马松-阿尔福。动物由两名经验丰富的技术人员每天监测两次，观察是否存在任何异常皮肤反应、健康问题或并发症。实验房间的门口内侧贴有双面胶带，以防止蜱虫意外逃逸，确保房间安全。该方法最佳操作方式为两人协作，但一名经验丰富的操作者也可独立完成。尽管大多数兔子性情温顺、安静，但在操作过程中仍可能出现应激迹象。为防止兔子挣扎造成自伤，可一手轻握其颈部皮肤，另一手托住其后躯，进行手动固定。一只六个月大的兰布伊埃特母羊饲养于法国阿福国立兽医学校（ENVA）的生物医学研究中心（CRBM）设施中，饮水和饲料均定时供应。 随意摄取 每天检查两次。
注意：本实验室已获得动物实验伦理委员会 ComEth Anses/ENVA/UPEC 批准使用兔子和绵羊进行蜱虫饲喂，许可证编号分别为 01741.01 和 11/10/16-5B。由于本实验仅使用无病原体的蜱虫，本研究中使用的所有兔子均已通过法国巴黎白兔协会提供领养。
1. 胶囊的制备
- 从EVA泡沫板上裁剪出所需尺寸的胶囊形状图1A）。将外角修圆（图1B胶囊的尺寸应适当，以尽量减少将其粘附到兔皮肤时意外脱落的风险。
注意：胶囊框架的厚度应约为 8 mm。对于幼虫、若虫以及小型成年蜱种，使用厚度为 5 mm 的泡沫片 Ixodes1 厘米厚的泡沫板适用于体型较大的成年蜱虫，例如 Amblyomma sp. 硬蜱属 sp. 等等。 胶囊的大小根据实验需求而定。例如，对于20 Ixodes 成虫配偶对、200只若虫或1000只幼虫，我们使用5 x 5 cm的内胶囊尺寸2，6 x 7 厘米2 或 7 x 9 厘米2分别。 - 剪下8 mm宽的自粘钩面搭扣带（参见 材料表）并将它们粘贴到准备好的EVA泡沫框架上（图1C).
- 从自粘式毛面胶带中裁剪出相同尺寸的条状物（参见 材料表）并将它们固定到连接在EVA泡沫框架上的钩面部分（图1D).
- 将适当大小的细密蚊帐网（网孔小于50 µm）裁剪至与EVA泡沫框架相同的尺寸，并粘贴到自粘钩面图 1E 和 1F如有必要，剪除突出部分。
注意：此类胶囊可用于硬蜱若虫和成虫的饲喂，而幼虫饲喂则需要采用不同的胶囊封口系统。补充图1以防止幼虫从固定好的钩面-毛面搭扣处意外逃出。
2. 蜱感染前家兔的准备
- 用剪刀剃除将要使用的兔背部和体侧部位的毛发（图2A).
- 将无刺激性乳胶胶水涂抹于制备好的胶囊整个表面，静置1分钟图2B).
- 用手指将胶囊按压在皮肤上（尤其是角落处）约 3 分钟以粘牢图 2C 和 二维).
注意：当粘贴多个胶囊时，务必确保它们之间至少保留 5 mm 的间距（图 2E 和 2F）。我们通常避免使用脊柱区域，但在必要时也可使用。 - 轻轻抬起胶囊，目视检查其与皮肤的粘附情况。若发现未粘附的区域，使用刮刀涂抹胶水，并再按压3分钟。
- 用防护胶带包裹兔子的后爪，以防止损伤背心图2G).
注意：此步骤为可选，主要用于防止外套损坏，而非防止蜱虫胶囊损坏。 - 将兔子的前腿穿过兔衣的孔洞，套上兔衣并系紧颈部， 确保兔子呼吸顺畅。此步骤中不要将后肢穿过弹性固定套，且保持拉链打开。图2H).
3. 蜱虫寄生
- 将蜱虫放入塑料注射器（根据个体数量选择1 mL或5 mL）中，注射器针头端剪掉并用棉花塞住（图1G）。若需感染少量蜱虫，可使用镊子操作。
注意：为维持蜱虫种群，可让吸饱血的雌蜱在注射器（5 mL或10 mL）内产卵并孵化，注射器口用蚊帐网覆盖并用橡皮圈固定12，以避免在将幼虫施用于宿主时进行繁琐的操作（图1H）。此外，完全吸血的幼虫也可在注射器（补充图1I；5 mL或10 mL）中蜕皮，以便直接用若虫感染兔子。 - 将注射器从胶囊的开口角落深入插入，并推动注射器活塞以接种蜱虫。缓慢旋转活塞，使其贴近兔子皮肤，以清除仍附着在活塞上的残留蜱虫，同时将注射器从胶囊中抽出（图2I）。
注意：若部分蜱虫爬出胶囊，可用镊子将其放回。 - 重新粘合魔术贴，封闭胶囊。
- 将兔子的后腿插入背心后部的弹性固定套中，并拉上拉链。
注意：确保背心颈部与兔子颈部之间可容纳一根食指，以保证舒适性，并防止兔子啃咬背心。 - 将兔子放回笼中（图2J）。
注意：从感染到采集饱血蜱虫的时间因蜱虫种类及其发育阶段而异。例如，Ixodes scapularis 和 Ixodes ricinus 成虫、若虫和幼虫的吸血时间分别为6–9天、3–4天和2–3天。Levin 和 Shumacher（2016）9 提供了29种硬蜱在实验室条件下的生活周期参考文献列表。
4. 蜱虫的采集与监测
- 将兔子从笼子中取出，带到实验台，并拉开夹克的拉链。
- 用手轻轻固定兔子。打开胶囊，解开尼龙搭扣（图 2K 和 2L），通过轻刷饱血的幼虫（补充图1）或若虫将其收集到塑料培养皿中，成虫则使用镊子收集（图2L）。如需获取部分吸血（未完全饱血）的蜱虫，可使用蜱虫移除工具或镊子将其取下。
注意：如需维持蜱虫种群，请参见步骤3.1中的说明。根据具体蜱种，在适当的湿度和温度条件下饲养饱血蜱虫。 - 如有需要，重新扣紧尼龙搭扣以关闭胶囊。
5. 兔子的恢复
- 从胶囊上完全移除蚊帐网，并将夹克留在兔子身上（图 2M）。
- 等待 3-4 周，尝试通过轻轻修剪胶囊的一个角将其移除（图 2N）。如果胶囊仍牢固附着，则一周后重复此步骤。
- 取下夹克，让兔子在笼中恢复。
注意：一旦取下胶囊，应检查兔子皮肤是否有异常反应。通常无需治疗，但若出现刺激，可使用润肤乳液。 - 如果实验方案允许，恢复后的兔子（图 2O）可重复使用或用于领养。
注意：已有研究表明，兔子在反复接触蜱虫侵染后会产生对蜱虫的抵抗力13；因此，除非实验需要，不建议再次侵染。
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结果
本文首次提出一种利用EVA泡沫胶囊在剃毛兔背部进行硬蜱饱血饲养的详细分步实验方法，胶囊外覆盖防护背心，图 1 和 图2）。当需要在同一宿主上对不同蜱虫组进行实验时，该方案适用，也可用于硬蜱的大规模饲养。实验室中蜱虫的吸血成功率主要取决于蜱虫个体的健康状况以及兔宿主对该特定蜱种的适宜性，而非技术本身。我们采用的将EVA泡沫胶囊粘附于兔背部的系统，在饲喂多种硬蜱不同发育阶段个体时已被证明具有很高的成功率。表1）也可适用于其他类型的实验动物宿主，例如绵羊（图3).
该方法的主要优点在于操作简便、材料易得（材料表），以及最重要的一点——采用方便开合的系统，可在蜱虫吸血过程中实现便捷的...
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讨论
整个实验方案中最重要的步骤是将胶囊牢固地粘贴到剃毛后的皮肤上。因此，必须持续施加压力至少3分钟，尤其是胶囊的各个角落。将蜱虫接种到胶囊内时，应将其放置在与开口对角的远端角落，以避免在密封过程中蜱虫逃逸。设计实验时，需确保所有胶囊均被外套覆盖，以防止动物啃咬或抓挠造成损坏。同时，应确保外套颈部松紧适度：既要足够紧以防止啃咬，又要足够宽松以保证兔子的舒适。
所述技术的主要优点之一是其操作简便，且可对胶囊的大小和数量进行调整。在我们的实验过程中，未观察到胶囊从皮肤上脱落的情况。然而，兔子偶尔可能会损坏胶囊的外层护套（但不会损坏胶囊本身）。
在兔子身上，我们观察到，由于兔子的体温影响，蜱虫在脱离宿主后，在囊袋中会迅速失水干涸（主要是幼虫和若虫等未成熟阶段）。因此，我们建议估算 特定蜱种及发育阶段的吸血持续时间，以便在其脱落后立即进行饱血蜱的收集。尽管本系统已用于多种硬蜱物种的饲养（表1），但兔子并非所有硬蜱物种的天然宿主14。这一局限性可通过将...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢法国国家农业研究院（INRA）的Evelyne Le Naour、Alain Bernier（INRA）以及法国食品、环境与职业健康安全局（ANSES）的Océane Le Bidel提供的技术协助。Consuelo Almazán获得了巴斯德研究所新兴传染病整合生物学实验室卓越计划（LabEx IBEID）提供的博士后奖学金支持。实验所用的兔子和绵羊由法国食品、环境与职业健康安全局（ANSES）采购。本研究部分得到了美国国立卫生研究院资助项目RO1AI090062（资助对象：Y. Park）的支持。我们感谢Jeffrey L. Blair博士对本文手稿的审阅。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 新西兰兔（2.5–3.5 kg） | Charles River | 菌株编号 571 | |
| 兰布伊埃特羊 | 本地无蜱虫农场 | 雌性，6个月大 | |
| 5 毫米厚 EVA 泡沫 | 角色扮演服装店 | EVA-PE451kg（950毫米 × 450毫米） | 可使用 Cosplay Shop 出售的 10 mm PE45 kg 泡沫材料制作大型成年蜱虫模型 |
| 泡沫板 9" X 12" 6 mm-白色 | 亚马逊 | FOAMSHT6-20 | 6 mm EVA 泡沫可通过亚马逊购买，作为 Cosplay Shop 所售泡沫的替代品 |
| 全长兔外套 | 哈佛仪器有限公司 | 620077 - 中号，6270078 - 大号 | |
| 无毒乳胶胶水 | 撕裂强度测试仪 | 织物 &和皮革粘合剂 | |
| 管状棉质矫形衬套 | BSN 医疗 | 9076（12-15 厘米宽） | |
| 蚊帐网眼 | 创意休闲 | 超细滤网尼龙织物 | 任何孔径小于50的蚊帐或窗帘材料 μm 是合适的。 |
| Leukoplast | BSN 医疗 S.A.S | LF 72361-02 | |
| 粘扣带 | AIEX 仓库 | AIEX 39.37英尺/12米魔术贴自粘胶带卷，20毫米宽度，白色 | 由亚马逊配送 |
| 快干胶 | Fixtout | 超级胶水 |
参考文献
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- Kröber, T., Guerin, P. M. In vitro feeding assays for hard ticks. Trends in Parasitology. 23 (9), 445-449 (2007).
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