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磷酸化肽段富集联合非标记定量质谱法研究前列腺癌磷酸化蛋白质组

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DOI：

10.3791/57996

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2018年8月2日

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1Graduate Program in Cellular and Molecular Pharmacology, School of Graduate Studies, Rutgers University, The State University of New Jersey, 2Graduate Program in Quantitative Biomedicine, School of Graduate Studies, Rutgers University, The State University of New Jersey, 3Department of Medicine, Division of Medical Oncology, Rutgers Robert Wood Johnson Medical School, 4Crump Institute for Molecular Imaging, Department of Molecular and Medical Pharmacology, Jonsson Comprehensive Cancer Center, UCLA Metabolomics Center, and California NanoSystems Institute, David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles, 5Mork Family Department of Chemical Engineering and Materials Science, University of Southern California, 6Pharmacology, Rutgers Robert Wood Johnson Medical School, 7Cancer Metabolism and Growth Program, Rutgers Cancer Institute of New Jersey

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本方案描述了一种从前列腺癌细胞系或组织中提取并富集磷酸化肽段以进行磷酸化蛋白质组分析的实验方法 通过 基于质谱的蛋白质组学

摘要

磷酸化蛋白质组学涉及对磷酸化蛋白质的大规模研究。蛋白质磷酸化是许多信号转导通路中的关键步骤，由激酶和磷酸酶严格调控。因此，对磷酸化蛋白质组的表征可能有助于发现肿瘤治疗中的新靶点和生物标志物。质谱技术能够全局性地检测和定量成千上万种独特的磷酸化事件。然而，与非磷酸化肽段相比，磷酸化肽段的丰度要低得多，这使得生化分析更具挑战性。为克服这一限制，在质谱分析前需要采用方法对磷酸化肽段进行富集。本文描述了一种从组织中提取蛋白质并将其消化为肽段的实验流程，随后采用基于抗体或基于二氧化钛（TiO2）的方法对酪氨酸磷酸化（pY）以及丝氨酸/苏氨酸磷酸化（pST）肽段进行富集。在完成样品制备和质谱分析后，我们继而通过液相色谱-质谱联用技术及分析软件对磷酸化肽段进行鉴定与定量。

引言

据估计，2018年将有约16.5万例新增病例和约2.9万例死亡由前列腺癌导致，使其成为美国男性中最常见的癌症，也是男性癌症相关死亡的第二大原因1。前列腺癌早期可通过手术切除或放射治疗局限于器官内的病灶进行治疗，接受前列腺切除术的患者十年复发率为20%至40%，接受放疗的患者十年复发率为30%至50%2。由于前列腺癌的生长依赖雄激素信号通路，因此对高危患者还可采用手术或药物去势治疗。然而，当癌症不再对雄激素剥夺治疗产生反应时，疾病会复发，表现为生化复发，即血清中前列腺特异性抗原（PSA）再次升高。在此疾病进展阶段，通常还可检测到转移灶。这种晚期阶段被称为转移性去势抵抗性前列腺癌，是该疾病的致死形式，其中位生存时间不足两年3。对于晚期疾病，治疗选择有限，包括第二代抗雄激素药物（如恩杂鲁胺和阿比特龙）以及以紫杉烷为基础的化疗药物（如多西他赛）。尽管已有上述治疗方法，疾病仍常继续进展。因此，发现和开发新的治疗手段对于改善晚期前列腺癌患者的诊疗至关重要。

基于质谱（MS）的方法通过检测数百至数千种肽段分析物，实现对蛋白质组的全局分析4特别是发现蛋白质组学，也称为数据依赖性采集（DDA），可实现数千种肽段的鉴定与定量4,5基于质谱的发现性蛋白质组学可进一步分为自上而下（top-down）蛋白质组学和自下而上（又称鸟枪法，shotgun）蛋白质组学，前者用于表征完整蛋白质，后者通过分析肽段来鉴定蛋白质5因此，在鸟枪法蛋白质组学中，样品制备阶段需在质谱分析之前进行蛋白水解，将蛋白质切割为肽段。最后通过数据库搜索将肽段回溯比对至蛋白质，以实现蛋白质鉴定。无标记方法以及多种同位素标记[例如，细胞培养中氨基酸的稳定同位素标记（SILAC）方法可用于在样品间对肽段进行定量比较6,7尽管同位素标记技术是金标准，但无标记方法已展现出相似的定量准确性8,9 在灵敏度和特异性之间具有相似的权衡10无标记定量技术可实现更广泛的覆盖范围，并允许在更多样本之间进行比较，而基于标记的方法则受限于成本和多重检测能力。6,7,8.

此外，鸟枪法质谱（shotgun MS）还可用于研究翻译后修饰（PTMs），例如磷酸化11。由于磷酸化肽段在丰度上远低于总肽段，因此常采用多种方法对磷酸化肽段进行富集，包括基于抗体的磷酸化酪氨酸（pY）肽段免疫沉淀、二氧化钛（TiO2）富集以及固定化金属离子亲和色谱（IMAC）5,12。由于蛋白质磷酸化是多种细胞信号通路中的关键步骤，鸟枪法磷酸化蛋白质组学使研究人员能够探究不同癌症中的细胞信号变化，包括乳腺癌13、前列腺癌14、肾癌15以及卵巢癌16,17，从而更深入地理解癌症生物学机制，并发现潜在的新型治疗靶点。

这种无标记的鸟枪法磷酸化蛋白质组学方法是在Graeber课题组先前研究18,19,20的基础上建立并优化的。本实验方案首先描述了从组织中提取蛋白质和磷酸化蛋白质，并将其消化为肽段的过程。随后，我们详细说明了使用特异性磷酸酪氨酸抗体和TiO2富集磷酸化酪氨酸（pY）肽段的方法。我们还介绍了利用强阳离子交换（SCX）结合TiO2对磷酸丝氨酸/苏氨酸（pST）肽段进行富集的步骤。本方案最后介绍了将样品送至质谱（MS）平台，以及使用质谱分析软件鉴定和定量磷酸肽及其对应的磷酸化蛋白质。该实验方案的应用不仅限于前列腺癌，还可拓展至其他癌症类型及肿瘤学以外的研究领域。

方案

使用异种移植肿瘤的实验已获得罗格斯大学机构动物护理和使用委员会的批准，符合美国国立卫生研究院指南的规定。

1. 蛋白质提取

  1. 制备裂解缓冲液（表1）。（体积取决于待收获样本的数量。）对于 体外 细胞样品请进行步骤1.2；肿瘤组织请进行步骤1.3。
  2. 收集细胞
    1. 将细胞收集至50 mL锥形管中，在4 °C下以700 × g离心5 min。弃去上清液，将沉淀置于冰上保存。对所有培养皿重复此步骤，将细胞合并为一个沉淀。（通常，每5 mg蛋白需要约5个接近汇合的15 cm培养皿的细胞，但具体数量可能因细胞系而异，需由研究者根据实验经验确定。）
    2. 用30 mL预冷的磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤沉淀，于4 °C、700 × g离心5分钟，随后吸除PBS。每5 mg蛋白对应的细胞沉淀中加入1.5 mL裂解缓冲液，吹打数次使充分悬浮。跳至步骤1.4。
  3. 组织 harvesting
    1. 称取肿瘤重量，在培养试管中按每100 mg组织加入2 mL预冷的裂解缓冲液。（通常需要50至150 mg的组织湿重。）
  4. 使用手持式或台式匀浆器匀浆裂解液（每次脉冲15秒，重复2次）。在处理第一个样品前以及样品之间，依次使用10%次氯酸钠、70%乙醇和去离子水清洁匀浆器。
  5. 将匀浆样品在95 °C加热5分钟以进行还原和烷基化，然后在冰上冷却15分钟。在冰上对裂解液进行超声处理，共3次（即，脉冲30秒，脉冲间隔60秒）。此时样品不应呈黏稠状或出现团块。将裂解液于95 °C加热5分钟21.
  6. 在相同超声处理管中，使用摆桶转子在15 °C、3,500 × g条件下离心裂解液15分钟。收集上清液，弃去沉淀。
  7. 通过 Bradford 法测定蛋白质浓度22如有必要，用裂解缓冲液将裂解物稀释至5 mg/mL，于-20 °C保存。
    注意：实验可在此处暂停。将样品在 -80 °C 冻存，待日后继续实验。

2. 裂解液消化

  1. 使用 100 mM Tris（pH = 8.5）将样品稀释 12 倍，以减少胍盐浓度。将所有样品稀释至相同体积，以尽量减少因消化不均带来的影响。保留 12.5 µg 未消化的裂解液，用于在考马斯亮蓝染色凝胶上进行验证23。
  2. 对于 5 mg 蛋白质，加入 10 µg 赖氨酰内肽酶（Lys-C），在室温下孵育 5–6 小时。通过加入 1 M 未滴定 Tris（pH ~11）将 pH 调整至 8.0。
  3. 在 1 mM HCl（含 20 mM CaCl2）中配制 1 mg/mL 的经 TPCK（L-1-对甲苯磺酰胺-2-苯乙基氯甲基酮）处理的胰蛋白酶。按胰蛋白酶与蛋白质质量比 1:100 加入胰蛋白酶，在 37 °C 下孵育 3 小时。
  4. 加入与步骤 2.3 相同量的新鲜胰蛋白酶，在 37 °C 下过夜孵育。
  5. 保留 12.5 µg 已消化的裂解液，用于在考马斯亮蓝染色凝胶上确认消化是否完全23。

3. 反相萃取

  1. 记录裂解液体积。使用15 mL、截留分子量为10 kDa的滤器过滤样品。在15 °C条件下，使用摆桶转子（或固定角转子）以3,500 × g离心，直至截留液体积小于250 µL（约需45–60分钟）。收集滤过液，弃去截留液。
    注意：实验可在此处暂停。将样品在-80 °C冷冻，待日后继续操作。
  2. 为酸化样品，每毫升裂解液中加入约20 µL的5%三氟乙酸（TFA）。充分混匀后，使用pH试纸测定样品pH，并用5% TFA调节pH至2.5。
  3. 将C-18柱的短端连接至真空 manifold。将真空压力调节至17–34 kPa（或根据制造商说明操作）。使用玻璃移液管，以3 mL 100%乙腈（ACN）润洗柱子。切勿让柱子干燥。
  4. 使用玻璃移液管，以0.1% TFA溶液分两次、每次3 mL（共6 mL）平衡柱子。将酸化后的样品加载至柱中。每次上样量不超过3 mL。调节真空度，使流速维持在每秒约1–2滴。
  5. 使用玻璃移液管，以0.1% TFA溶液分三次、每次3 mL（共9 mL）洗涤柱子。随后用2 mL含40% ACN和0.1% TFA的洗脱液洗脱柱子。将洗脱液收集至两个玻璃培养管中，每管2 mL。弃去柱子。
  6. 用Parafilm封口膜覆盖洗脱液管，并用20G针头在膜上戳3–5个小孔。将洗脱液在干冰上冷冻至少30分钟，直至完全凝固。
  7. 将样品冷冻干燥过夜。次日，在关闭冻干机前确认样品已完全干燥。将管子置于50 mL锥形管中，用柔软擦拭纸包裹后，于-80 °C保存。
    注意：实验可在此处暂停。

4. pY 肽段的免疫沉淀与富集24

  1. 在每份样品中，用0.5 mL预冷的免疫沉淀（IP）结合缓冲液重悬冻干粉末。通过将第二份样品的0.5 mL重悬液转移至第一份样品中合并各份样品，并保留移液枪头。剧烈涡旋振荡（而非反复吹打）以确保样品完全溶解，然后转移至3.6 mL螺口冻存管中。
  2. 同步骤4.1，每根冻干管中再用0.5 mL IP结合缓冲液（表1）冲洗一次。使用同一移液枪头将冲洗液转移至3.6 mL螺口管中，以尽量减少样品损失。重复冲洗一次，最终重悬体积为2 mL（对应5 mg蛋白）。测定样品pH值，确保其约为7.4。若pH过低，逐次加入10 µL 1 M Tris（未滴定，pH ~11）；若pH过高，逐次加入10 µL稀释HCl（1:25或1:100）。
  3. 预清洗pY磁珠（每5 mg起始裂解液）
    1. 每个样品需要25 µg 4G10抗体和12.5 µg 27B10.4抗体。使用剪去尖端的p200移液枪将抗体分别转移至不同的微量离心管中，然后用450 µL预冷IP结合缓冲液清洗抗体2次。在4 °C下以100 × g离心1分钟，吸除上清液。 
    2. 使用IP结合缓冲液将磁珠重悬至储存浓度0.5 mg/mL。（切勿涡旋振荡磁珠。）将所需浆液（每个样品分别为50 µL 4G10抗体浆液和25 µL 27B10.4抗体浆液）分装至同一管中后，将储存管在4 °C下以200 × g离心1分钟。用上清液冲洗管壁，然后将磁珠放回冰箱储存。
  4. 将预清洗的pY磁珠加入螺口冻存管中的重悬样品溶液中。在4 °C下于翻转旋转仪上孵育过夜。
  5. 将螺口冻存管放入内衬柔软擦拭纸的50 mL离心管中，在100 × g下离心1分钟以沉淀磁珠。保留上清液，用于后续富集pST肽段。（pST肽段的富集从第7步开始，可与pY肽段处理并行进行）。
  6. 用300 µL IP结合缓冲液重悬磁珠，转移至2 mL微量离心管中，并在4 °C下以100 × g离心1分钟。
  7. 用200 µL IP结合缓冲液冲洗孵育管3次，每次将冲洗液转移至同一微量离心管中，然后离心沉淀。
  8. 在微量离心管中用500 µL IP结合缓冲液清洗磁珠3次，每次在100 × g下离心1分钟。随后用450 µL 25 mM NH4HCO3（pH 7.5）清洗磁珠4次，每次在100 × g下离心1分钟。每次均使用新鲜配制的25 mM NH4HCO3溶液。
  9. 在1,500 × g下离心1分钟，使用加样枪头将上清液彻底去除，操作时将枪头尖端略低于磁珠表面。
  10. 向磁珠中加入体积为磁珠体积4倍的0.1% TFA（即，每75 µg pY磁珠浆液加入300 µL 0.1% TFA）。充分混匀后，在37 °C下以1,000 rpm于恒温混匀仪中孵育15分钟。
  11. 将重悬液转移至0.2 µm离心滤膜管中。快速离心收集管，再用P10移液枪将残留液体转移至同一离心滤膜管中。在850 × g下离心1分钟。将洗脱液转移至低蛋白吸附微量离心管中。在40 °C下真空浓缩过夜，加热时间为300分钟。
    注意：实验可在此处暂停。将样品于-80 °C冷冻保存，待日后继续操作。

5. pY 肽段的二氧化钛富集25

  1. 将干燥的磷酸化肽重悬于200 µL的50%乙腈、0.1%三氟乙酸溶液中。涡旋混匀后，在10,000 × g离心30秒。重复一次，以充分重悬。
  2. 制备TiO2 含有可容纳 200 µL 样品的磁珠的吸头。
    1. 轻敲枪头小端，使样品移至该端。加入 200 µL 100% ACN 清洗枪头，然后将枪头倒置，弹动小端使液体向盖端移动。
    2. 使用剃须刀片切下尖端的小部分，并将其置于 低蛋白吸附管（避免使用聚苯乙烯管，因为TiO2会粘附在管壁上。）打开管盖，插入微量移液器以吸出残留的ACN。用200 µL 100% ACN重复洗涤一次。此时TiO2微珠已位于低蛋白结合管中，用于后续步骤。
    3. 预处理 TiO2 用500 µL 100%乙腈清洗2次。用移液器吹打混匀磁珠与溶剂。在100 × g下离心1分钟。
    4. 条件 TiO2 用500 µL 0.2 M磷酸钠缓冲液（pH ~7）洗涤2次。用300 µL平衡缓冲液洗涤磁珠3次。由于TiO2 非常致密，珠子会迅速沉降。
  3. 向低蛋白结合管中加入 400 µL 50% ACN、0.1% TFA，随后加入 84 µL 乳酸。将重悬的磷酸化肽转移至低蛋白结合管中，于室温下用翻转混合仪孵育 1 小时。
  4. 以 100 × g 离心 1 分钟，使磁珠沉淀。用 300 µL 平衡缓冲液洗涤磁珠表1) 2倍体积，100 × g 离心1分钟。
  5. 用300 µL洗涤缓冲液洗涤磁珠2次。将磁珠转移至0.2 µm离心滤管中，在1,500 × g下离心1分钟。
  6. 将滤过装置转移至一支洁净的1.5 mL低蛋白结合管中，用200 µL 0.9% NH₄HCO₃溶液洗脱2次3 在 H2O. 使用 pH 试纸测定 pH 值，应介于 10 至 11 之间。将洗脱液抽真空过夜浓缩至干燥，以蒸发氨。

6. 用于质谱分析的磷酸化酪氨酸肽段脱盐

  1. 用15 µL含0.1% TFA的溶液通过涡旋重悬磷酸化肽，并在10,000 × g离心30秒以充分溶解。重复此步骤1次，确保充分重悬。切勿上下吹打。
  2. 使用结合容量为5 µg的C-18小柱，按照制造商提供的方案对样品进行纯化。
  3. 通过真空浓缩将洗脱液体完全干燥，此过程需1–2小时。将干燥后的磷酸化肽重悬于12.5 µL质谱分析溶液中（见表1），或根据研究者所在质谱蛋白质组学核心设施的建议进行操作。涡旋混匀后，在10,000 × g短暂离心30秒。重复此操作2次，确保充分重悬。样品现已准备好提交至质谱分析平台（步骤11）。
    注意：以下步骤仅适用于pST肽的富集。

7. pST 肽的反相萃取

  1. 通过肽定量检测法测定步骤 4.6 所得上清液中的肽浓度。进行 pST 质谱分析所需的足够量为 2.5 mg。
  2. 用 5% TFA 将 pH 值调节至 3.5。
  3. 将 C-18 柱的短端连接至真空 manifold。将真空压力设置在 17 至 34 kPa 之间（或根据制造商说明操作）。用 3 mL 的 100% ACN 润湿色谱柱，切勿让柱子变干。
  4. 用 0.1% TFA（分两次，每次 3 mL，共 6 mL）平衡色谱柱。将酸化后的样品加载到柱子中，每次加入量不得超过 3 mL。调节真空度，使流速约为每秒 1–2 滴。
  5. 用 0.1% TFA（分三次，每次 3 mL，共 9 mL）洗涤柱子。用 2 mL 的 40% ACN、0.1% TFA 进行洗脱。将洗脱液收集为两份，每份 2 mL，分别置于玻璃培养管中。弃去柱子。
  6. 用封口膜覆盖洗脱液管，并用 20G 针头在膜上戳 3–5 个小孔。将洗脱液在干冰中冷冻至少 30 分钟，直至完全凝固。
  7. 将选定的组分冷冻干燥过夜。次日，在关闭冻干机前确保样品已完全干燥。将试管置于含柔软擦拭纸的 50 mL 锥形管中，于 -80 °C 保存。
    注意：实验可在此处暂停。

8. pST 肽的强阳离子交换（SCX）

  1. 将冻干肽在2 mL缓冲液A中重悬表1)。合并每个样品的组分。（溶液将呈浑浊状态。）
  2. 准备真空 manifold。将 SCX 柱连接至一个已移除活塞的 3 mL 注射器上。将真空压力调节至 17 至 34 kPa（或根据制造商说明书操作）。
  3. 用4 mL乙腈冲洗SCX柱，随后用4 mL缓冲液A平衡。
  4. 从第8.1步中取出2 mL样品上样，并立即收集流出液。加入3 mL A:B（80.9:19.1）缓冲液，收集流出液。将每份样品的流出液合并，分装至2 mL低蛋白吸附管中。
  5. 将所有样品真空浓缩至原始体积的约30%。（此步骤约需2–4小时。）将同一份样品的各等分部分合并至一个低蛋白吸附管中。
  6. 将C-18柱的较短端连接至真空 manifold。将真空压力调节至17–34 kPa（或根据制造商说明书操作）。用3 mL的100% ACN润洗柱子2次。 不 让柱子干燥。
  7. 用 3 mL 0.1% TFA 平衡柱子两次。将样品加载到柱子中。每次加入体积不要超过 3 mL。调节真空度，使流速约为每秒 1 - 2 滴。
  8. 用 3 mL 0.1% TFA 洗柱 2 次。用 4 mL 50% ACN、0.1% TFA 洗脱柱子。

9. 磷酸化丝氨酸/苏氨酸肽段的二氧化钛富集

  1. 准备装在吸头中的 TiO2 微珠，该吸头可容纳 200 µL 样品
    1. 轻轻敲击吸头的小头端，使微珠移至该端。取下帽盖，将微珠倒入一个聚丙烯 15 mL 圆锥管中。
    2. 加入 200 µL 100% 乙腈（ACN），将吸头颠倒数次，并轻弹小头端，使液体向帽端移动。使用剃刀片切下吸头的小头端，并将其置于聚丙烯 15 mL 圆锥管上方。取下帽盖，插入微量移液器将残留的乙腈推出。用 200 µL 100% 乙腈重复洗涤一次。此时 TiO2 微珠已位于 15 mL 圆锥管中，用于后续步骤。
    3. 用 500 µL 100% 乙腈对 TiO2 进行预处理，重复 2 次。用移液器混匀微珠与溶剂。在 100 × g 条件下离心 1 分钟。
    4. 用 500 µL 0.2 M 磷酸钠缓冲液（pH ~7）对 TiO2 进行活化处理，重复 2 次。用 300 µL 平衡缓冲液洗涤微珠，重复 3 次。
  2. 将洗脱的磷酸化肽转移至聚丙烯 15 mL 圆锥管中。加入 560 µL 乳酸，在室温下使用翻转式旋转仪孵育 1 小时。
  3. 在 100 × g 条件下离心 1 分钟，使微珠沉淀。用 300 µL 平衡缓冲液（表 1）洗涤 3 次，每次在 100 × g 条件下离心 1 分钟。
  4. 用 300 µL 漂洗缓冲液漂洗微珠 2 次。将微珠转移至 0.2 µm 离心过滤器中。在 1,500 × g 条件下离心 1 分钟。
  5. 将滤器单元转移至一个新的 1.5 mL 低蛋白吸附离心管中。用 200 µL 含 0.9% NH3 的 H2O 溶液洗脱 2 次。每次洗脱前让溶液在磷酸化肽上静置 2 分钟。测定 pH 值，应介于 10 至 11 之间。
  6. 将洗脱液在真空下浓缩至完全干燥，过夜蒸发氨。

10. 用于质谱分析的 pST 肽段脱盐

  1. 轻轻敲击吸头的小端，使材料移至该端。加入 200 µL 的 100% 乙腈（ACN）冲洗吸头，然后将吸头倒置，轻弹小端，使液体流向盖端。
  2. 使用剃刀切下吸头的小端，并将其置于一个聚丙烯 15 mL 圆锥管上。打开管盖，插入微量移液器将残留的乙腈推出。用 200 µL 的 100% 乙腈重复洗涤一次。此时，TiO₂ 微珠已位于聚丙烯 15 mL 圆锥管中，用于后续步骤。
  3. 使用结合容量为 100 µg 的 C-18 吸头对样品进行纯化。（遵循生产商的说明。）
  4. 通过真空浓缩将洗脱液体完全干燥。此过程需要 1 - 2 小时。
  5. 将干燥的磷酸化肽重悬于 12.5 µL 质谱溶液中（或按照研究人员的质谱蛋白质组学核心设施建议的条件进行）。涡旋混匀后，在 10,000 × g 离心 30 秒。重复 2 次，以充分重悬。（切勿反复吹打。）

11. 质谱分析

  1. 将样品提交至质谱蛋白质组学核心实验室，按照其推荐的设置进行液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析。示例设置如下（详见表2的总结）：
    1. 取5 µL样品上样至捕获柱（2 cm长 × 75 µm内径），以5 µL/min流速用0.1% TFA冲洗5分钟。
    2. 将捕获柱与纳米分析柱（20 cm × 75 µm）连接，流速为300 nL/min。
    3. 磷酸化酪氨酸（pY）与磷酸化丝/苏氨酸（pST）样品所用的分段线性梯度（以含0.16%甲酸和80%乙腈的0.2%甲酸溶液为梯度）有所不同：
      1. 对于pY样品，采用以下梯度洗脱：4–15%梯度持续5分钟，15–50%梯度持续40分钟，50–90%梯度持续5分钟。
      2. 对于pST样品，采用以下梯度洗脱：4–15%梯度持续30分钟，15–25%梯度持续40分钟，25–50%梯度持续44分钟，50–90%梯度持续11分钟。
    4. 采用数据依赖性采集模式获取质谱数据，循环进行全扫描（分辨率120,000），随后对强度最高的20个离子进行二级质谱（HCD，相对碰撞能量27%），动态排除时间为20秒。
  2. 质谱运行完成后，将质谱原始文件导入质谱分析软件，用于鉴定和定量磷酸化肽段。（本实验使用MaxQuant软件8,26,27。除非表3中另有说明，均采用默认设置。）

结果

本方案详细描述了一种蛋白质提取与消化方法，随后进行磷酸化肽段富集及质谱分析（图1）。本方案中所用所有缓冲液和溶液的组成列于表1。依次使用Lys-C和胰蛋白酶可实现高效的蛋白质消化。消化前裂解液的考马斯亮蓝染色凝胶可用于确认蛋白质的存在，而消化后裂解液的染色则可确认消化是否完全（图2A）。对于完全消化，除Lys-C的30 kDa条带和胰蛋白酶的23.3 kDa条带外，15 kDa以上不应出现任何条带。添加Lys-C还可减少漏切位点的数量（图2B）。由于酪氨酸磷酸化肽段（pY肽段）仅占磷酸化蛋白质组的2%28，因此首先使用特异性识别pY的抗体对pY肽段进行免疫沉淀，以实现其富集。所得上清液则作为丝氨酸/苏氨酸磷酸化肽段（pST肽段）富集的起始材料。pY免疫沉淀可有效分离pY肽段与pST肽段，其中pY样品中鉴定出的磷酸化肽段平均约85%为pY（图3A），而pST样品中鉴定出的磷酸化肽段超过99%为pST（图3B）。两种样品均采用二氧化钛法富集磷酸化肽段。质谱就绪样品中磷酸化肽段的预期比例为30%–50%（图4A）。由于pY肽段数量远少于pST肽段，pY样品中磷酸化肽段富集比例的变异性可能更大。就磷酸化肽段种类而言，检测到的大多数磷酸化肽段含有一个或两个磷酸化基团（图4B）。

完成质谱分析后，将质谱原始文件载入质谱分析软件。实验中使用的参数设置如表3所列，但不同软件之间以及同一软件的不同版本之间参数可能有所不同。未列出的参数均保持默认设置，包括肽段-谱图匹配（PSM）的错误发现率（FDR）截断值为1%，修饰肽段鉴定的Andromeda最低得分设为4027。设定定位概率截断值大于0.75，可分别过滤掉约5%的pY肽段、15%的pS肽段和34%的pT肽段（图5A）。应用这些筛选条件后，在质谱分析结束时预期可鉴定到的磷酸化肽段数量约为300个pY肽段（起始蛋白量为5 mg）以及约7,500个pS肽段和640个pT肽段（起始肽段量为2.5 mg），分别来自相应的富集制备样品（图5B）。重复实验的次数以及磷酸化肽段信号强度的变异性决定了统计比较所需的充分检验效能。在四组独立实验中，每组包含生物学重复双样本或三样本，计算了所检测磷酸化肽段的变异系数百分比（%CV）。较低变异性的分布情况（例如，图5C中的pST组1–5）表明样品采集、制备及质谱运行过程具有一致性。相反，较高变异性的分布（例如，图5C中的pST组6）表明数据噪声较大，在后续差异分析中需要更大的倍数变化才能检测出显著差异。

蛋白质提取与质谱分析工作流程图；包括固相萃取（SPE）、强阳离子交换（SCX）、酪氨酸磷酸化（pY）及丝氨酸/苏氨酸磷酸化（pST）富集。
图1：工作流程图。 从样品中提取并消化蛋白质。通过固相萃取（SPE）提取肽段，并采用免疫沉淀法富集磷酸化酪氨酸（pY）肽段。同时，在pY免疫沉淀步骤的上清液中富集磷酸化丝氨酸/苏氨酸（pST）肽段。对上清液进行强阳离子交换（SCX）分离，以去除高电荷肽段，从而降低离子抑制效应。12两种样品均进行磷酸化肽段富集 通过 二氧化钛（TiO2)。样品净化后，采用液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）测定磷酸化肽段的丰度。随后将原始数据导入质谱分析软件以鉴定磷酸化肽段。 请点击此处以查看此图的放大版本。

Lys-C 和胰蛋白酶消化的蛋白质电泳；磷酸化富集分析的柱状图。
图2：消化效果的评估。 (A三个样本 12.5 µg 裂解液在预消化、Lys-C 消化后及胰蛋白酶消化后的结果如图所示。考马斯亮蓝染色凝胶显示，经 Lys-C 与胰蛋白酶依次作用后，消化产物条带清晰。分子量（MW）标准蛋白标记物的单位为千道尔顿（kDa）。B) A 添加Lys-C后，漏切现象减少。在pY和pST富集样品中，无漏切的磷酸化肽段比例分别从48%提高到64%，以及从60%提高到84%（平均值）。图中总结了2次未添加Lys-C和5次添加Lys-C实验所获得的数据。误差线表示标准差，来源于2次独立实验的38个pY和38个pST样本（未添加Lys-C），以及5次独立实验的62个pY和60个pST样本（添加Lys-C）。 请点击此处查看此图的放大版本。

磷酸化富集饼图；pY、pS、pT的比较比率；实验结果。
图3：pY和pST磷酸肽的富集情况。 这些图示显示了来自（A）pY或（B）pST富集样品中pSTY磷酸肽的百分比。通过pY免疫沉淀和二氧化钛进行的pY富集，使85%的磷酸肽为pY肽，而在pST富集样品中仅有0.1%的磷酸肽为pY。这些数值来源于一次代表性实验的Phospho (STY)Sites.txt文件分析结果，已过滤掉污染物、反向序列以及定位概率低于0.75的磷酸肽。 请点击此处查看该图的放大版本。

蛋白质磷酸化分析；散点图与饼图比较 pY 和 pST 比值，数据分析。
图 4：使用二氧化钛进行磷酸化肽段富集。（A）显示了四次独立实验中各样本检测到的磷酸化肽段占总肽段的百分比。（B）该图展示了四次独立实验中单磷酸化、双磷酸化及多磷酸化肽段的平均组成。A 图中的误差线表示标准差。请点击此处查看该图的高清版本。

分析 pY、pS、pT 百分比及鉴定结果的柱状图与散点图；小提琴图显示 %CV。
图 5：预期的磷酸化位点残基鉴定结果。（A）该图显示来自 pY 富集（左）和 pST 富集（右）的鉴定结果（IDs）的磷酸化定位概率。满足 > 0.75 概率阈值的鉴定结果平均百分比分别为 pY 93%、pS 75% 和 pT 52%。（B）具有 >0.75 定位概率的鉴定结果平均数量为：pY 300 个、pS 7,500 个、pT 640 个。（C）该图显示磷酸化肽段变异系数百分比（%CV）的小提琴图。仅当在每个生物学重复或三联样本组中均检测到信号强度值时，才进行 %CV 评估。数据来自四次独立实验。图 A 和 B 中的误差线表示四次独立实验中 34 个 pY 样本和 34 个 pST 样本的标准差。请点击此处查看该图的放大版本。

缓冲液体积成分
6 M 盐酸胍裂解缓冲液50 mL6 M 盐酸胍，100 mM Tris（pH 8.5），10 mM 三(2-羧乙基)膦，40 mM 氯乙酰胺，2 mM 原钒酸钠，2.5 mM 焦磷酸钠，1 mM β-甘油磷酸钠，500 mg 正辛基糖苷，加超纯水至体积
100 mM 焦磷酸钠50 mL2.23 g 十水焦磷酸钠，加超纯水至体积
1 M β-甘油磷酸钠50 mL15.31 g β-甘油磷酸钠，加超纯水至体积
5% 三氟乙酸20 mL将 1 mL 100% 三氟乙酸加入 19 mL 超纯水中
0.1% 三氟乙酸250 mL将 5 mL 5% 三氟乙酸加入 245 mL 超纯水中
pY 洗脱缓冲液250 mL0.1% 三氟乙酸，40% 乙腈，加超纯水至体积
pST 洗脱缓冲液250 mL0.1% 三氟乙酸，50% 乙腈，加超纯水至体积
免疫沉淀结合缓冲液200 mL50 mM Tris（pH 7.4），50 mM 氯化钠，加超纯水至体积
25 mM 碳酸氢铵，pH 7.510 mL将 19.7 mg 溶解于 10 mL 无菌超纯水中，用 1 N 盐酸调节 pH 至 7.5（约 10–15 µL/10 mL 溶液），现配现用
1 M 磷酸盐缓冲液，pH 71,000 mL423 mL 1 M 磷酸二氢钠，577 mL 1 M 磷酸氢二钠
平衡缓冲液14 mL6.3 mL 乙腈，280 µL 5% 三氟乙酸，1740 µL 乳酸，5.68 mL 超纯水
洗涤缓冲液20 mL9 mL 乙腈，400 µL 5% 三氟乙酸，10.6 mL 超纯水
质谱溶液10 mL500 µL 乙腈，200 µL 5% 三氟乙酸，9.3 mL 超纯水
缓冲液 A250 mL5 mM 磷酸二氢钾（pH 2.65），30% 乙腈，5 mM 氯化钾，加超纯水至体积
缓冲液 B250 mL5 mM 磷酸二氢钾（pH 2.65），30% 乙腈，350 mM 氯化钾，加超纯水至体积
0.9% 氢氧化铵10 mL300 μL 29.42% 氢氧化铵，9.7 mL 超纯水

表1：缓冲液与溶液。 本表列出了本实验方案中所用缓冲液和溶液的组成。

LC-MS/MS 设置
参数pY 设置pST 设置
上样体积 (µL)5
上样流速 (µL/min)5
梯度流速 (nL/min)300
线性梯度（0.16% 甲酸，80% 乙腈含 0.2% 甲酸）（百分比）4 - 15%，持续 5 分钟4 - 15%，持续 30 分钟
15 - 50%，持续 40 分钟15 - 25%，持续 40 分钟
50 - 90%，持续 5 分钟25 - 50%，持续 44 分钟
50 - 90%，持续 11 分钟
全扫描分辨率120,000
选择的最强离子数量20
相对碰撞能量 (%) (HCD)27
动态排除 (s)20

表2：液相色谱-质谱（LC-MS）设置。 这是一个典型的鸟枪法磷酸化蛋白质组学实验中液相色谱-质谱（LC-MS）参数设置的示例。样品被加载至捕获柱上，随后将捕获柱与分析柱串联。这些参数设置是针对材料与试剂表中列出的液相色谱-质谱（LC-MS）系统进行优化的。若使用其他液相色谱-质谱（LC-MS）系统，则需要对这些参数进行相应调整。

MaxQuant 参数设置
设置操作
分组特异性参数
类型类型选择 Standard
多重性设为 1
消化模式酶选择 Trypsin/P
最大漏切位点数设为 2
修饰可变修饰添加 Phospho (STY)
非标记定量非标记定量选择 LFQ
LFQ 最小比值计数设为 1
快速 LFQ取消勾选
其他重新定量勾选
全局参数
序列FASTA 文件选择从 UniProt 下载的 fasta 文件
固定修饰添加 Carbamidomethyl (C)
高级鉴定运行间匹配勾选
匹配时间窗口设为 5 min
比对时间窗口设为 20 min
匹配未鉴定特征峰勾选
蛋白质定量最小比值计数设为 1
文件夹位置根据需要修改

表3：质谱分析软件设置。 在 MaxQuant 中，选择了或调整了本表中的组别特异性和全局参数。其余所有参数均保持默认。这些实验使用的是版本 1.5.3.30。参数可能因软件版本不同或软件之间存在差异。

讨论

在使用本方案富集磷酸化肽段之前，必须仔细考虑实验设计。使用生物学重复比技术重复更能有效利用质谱资源。所需重复次数部分取决于数据的变异性。最近一项研究表明，尽管将重复次数增加至三个以上仅能略微增加鉴定到的肽段数量，但组间显著差异的鉴定数量会随着重复次数的增加而上升10。

由于细胞中磷酸化蛋白的丰度较低，因此在发现模式下对前列腺癌样本进行全磷酸化蛋白质组分析时，需要足够的起始蛋白量。在这些实验中，使用了5 mg蛋白。大约五块接近汇合的15 cm培养皿的细胞可提供本方案所需的蛋白量，但具体数量可能因细胞系而异。对于肿瘤组织而言，预期蛋白得率约为组织重量的6%–8%。在 体外 在实验条件下，可考虑使用添加1 mM 钒酸盐（vanadate）处理细胞30分钟作为阳性对照样本。钒酸盐是一种竞争性蛋白酪氨酸磷酸酶抑制剂，能够维持酪氨酸磷酸化水平，从而增加磷酸化酪氨酸（pY）肽段的鉴定数量。29.

彻底的消化是最大限度鉴定磷酸化肽段的关键步骤。除了考马斯亮蓝染色检测外，数据中漏切位点的百分比也可用于评估消化效率（图2）。已有质量控制软件可用于分析漏切情况及其他指标，以评估质谱数据的质量30。尽管胰蛋白酶最为常用，但也可选用其他蛋白酶5，以弥补蛋白质组中无法产生理想胰蛋白酶肽段的覆盖空白区域31。此时，需相应调整质谱分析软件的设置，以适应所用蛋白酶的改变。

本实验方案采用免疫沉淀法（用于富集磷酸化酪氨酸肽段，pY）以及二氧化钛（TiO2）来富集磷酸化肽段。其他可用于肽段富集的方法还包括固定化金属离子亲和层析（IMAC）、用于金属氧化物亲和层析（MOAC）的其他金属氧化物（如氢氧化铝）以及聚合物基质金属离子亲和捕获技术（PolyMAC）5,12。先前的研究表明，不同的富集方法可富集到不同类群的磷酸化肽段32。例如，IMAC 更倾向于富集多磷酸化肽段，而 MOAC 则更偏好富集单磷酸化肽段33。本方案的代表性结果也反映了这一现象（图4B）。最近一项研究显示，使用杂化材料结合 IMAC 与 MOAC 方法，可能有助于更全面地覆盖磷酸化肽段的种类34。因此，本方案可进行改进，同时并行使用其他富集方法，以实现更为全面的磷酸化蛋白质组学分析。

本方案中使用 MaxQuant26 软件套件分析质谱数据，但也有商用应用程序35可用于磷酸化肽段的鉴定与定量。对于磷酸化肽段的鉴定，需设定定位概率阈值。该过滤步骤用于筛选出具有高置信度（即，大于 0.75）的磷酸化残基鉴定结果10,28。换言之，所有其他可能携带磷酸基团的残基的累计概率小于 0.25。该阈值可进一步提高，以增强磷酸化肽段筛选的严格性。就鉴定数量而言，预期的 pY 肽段数量在数百个，而 pST 肽段的数量则可达数千个。这些数值反映了先前观察到的磷酸化蛋白质组分布情况，其中约 2%、12% 和 86% 的磷酸化位点分别为 pY、pT 和 pS28。

如果 pY 和 pST 富集步骤并行进行，则可在六天内完成本方案中的样品制备步骤。通过与强大的质谱（MS）工具联用，此类磷酸化肽富集方案为科研人员提供了全局性方法，以获取数据并分析各自研究领域中的磷酸化蛋白质组。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

我们感谢Drake实验室的成员为本文提供的建议和意见。我们还感谢新泽西州罗格斯大学罗伯特·伍德·约翰逊医学院生物质谱中心的成员为我们的样品提供咨询并进行质谱分析。Larry C. Cheng的研究由美国国立卫生研究院下属的国家普通医学科学研究所资助，资助编号为T32 GM008339。Thomas G. Graeber的研究由美国国家癌症研究所/国立卫生研究院（前列腺癌SPORE项目P50 CA092131；P01 CA168585）以及美国癌症协会研究学者奖（RSG-12-257-01-TBE）资助。Justin M. Drake的研究由美国国防部前列腺癌研究计划W81XWH-15-1-0236、前列腺癌基金会青年研究者奖、新泽西健康基金会以及罗格斯新泽西癌症研究所精准医学计划试点奖资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
超低温冰箱PanasonicMDF-U76V
–20 °C 冰箱VWRscpmf-2020
摆动转子吊篮ThermoFisher Scientific75004377
真空 manifoldRestek26080
冻干机Labconco7420020
CentriVap 台式真空浓缩仪Labconco7810010
滚轴混合仪ThermoFisher Scientific415110Q
剃须刀片Fisher Scientific620177
Amicon Ultra-15 离心过滤单元Millipore SigmaUFC901024
玻璃培养管Fisher Scientific14-961-26
Parafilm 封口膜Fisher Scientific13-374-12
20G 针头BDB305175
Kimwipes 擦镜纸Fisher Scientific06-666A
螺口冻存管ThermoFisher Scientific379189
Nunc 15 mL 圆锥形离心管ThermoFisher Scientific12-565-268
加样枪头（凝胶上样用）Fisher Scientific02-707-181
Millipore 0.2 µm 离心滤膜Millipore SigmaUFC30GVNB
低蛋白吸附 Eppendorf 管Eppendorf22431081
抗磷酸化酪氨酸抗体，琼脂糖偶联，克隆号：4G10Millipore Sigma16101
27B10.4 抗体CytoskeletonAPY03-beads
肽含量检测试剂盒Thermo Scientific23275步骤 7
TopTipPolyLC IncTT200TIO.96步骤 5 和 9
SCX 柱（PolySULFOETHYL A）PolyLC IncSPESE1203
3 mL 注射器BD309657
三氟乙酸（TFA）Fisher ScientificPI-28904
乙腈（ACN）Fisher ScientificA21-1
乳酸 Sigma-Aldrich69785-250ML
氢氧化铵Fisher ScientificA669S-500
磷酸二氢钾Fisher ScientificBP362-500
氯化钾Fisher ScientificBP366-500
二水合氯化钙Fisher ScientificBP510-500
Tris 碱Fisher ScientificBP152-5
经 TPCK 处理的胰蛋白酶Worthington BiochemicalsLS003740
赖氨酰内肽酶Wako Pure Chemical Industries, Ltd.125-05061
MonoTipPolyLC IncTT200TIO.96步骤 10
ZipTipMilliporeSigmaZTC18S096步骤 6
nanoEase MZ 肽 BEH C18 色谱柱，130Å，1.7 μm，75 μm × 20 cmWaters186008794步骤 11：分析柱
Acclaim PepMap 100 C18 液相色谱柱ThermoFisher Scientific164535步骤 11：捕获柱
Ultimate 3000 RLSCnano 系统DionexULTIM3000RSLCNANO步骤 11
Q Exactive HFThermoFisher ScientificIQLAAEGAAPFALGMBFZ步骤 11
MilliQ 水用于配制所有溶液和缓冲液的去离子水
超声破碎仪Fisher ScientificFB-120超声波破碎仪
Polytron PT 匀浆系统Kinematica AGPT 10-35 GT匀浆器

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