Caenorhabditis 筛选器：一种用于分选小型多细胞生物的低技术含量仪器与方法

摘要

本方案包含一种对年龄匹配的秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）群体进行分选和清洗的方法。该方法使用一种简单、廉价且高效的自制工具，以获取大量用于研究的线虫实验群体。

摘要

Caenorhabditis elegans（C. elegans）是一种广泛应用于基础研究和生物医学研究的模式生物。在线虫研究领域，人们迫切需要一种经济且有效的方法来维持大量年龄一致的 C. elegans 种群。本文介绍了一种对 C. elegans 进行机械分选和清洗的方法。我们的目标是提供一种成本低、效率高、速度快且操作简便的流程，以获得大小和发育阶段均一的线虫个体，用于后续实验。该工具名为 Caenorhabditis 筛选筛（Caenorhabditis Sieve），采用定制的螺口式盖子系统，可旋接在常见的锥形实验管上，依据线虫体型大小进行分选。我们还证明，Caenorhabditis 筛选筛能够有效地将线虫从一个培养平板转移至另一个平板，实现快速分选、同步化和清洗，且不会影响包括运动能力及应激诱导基因报告系统在内的健康指标。这一易于获取且具有创新性的工具，为维持 C. elegans 种群提供了一种快速、高效且无应激的解决方案。

引言

线虫 Caenorhabditis elegans 是一种重要的模式生物。除了在实验室中易于培养且培养条件可控外，其全基因组已测序¹，且每个细胞的发育命运均已明确²。由于这些优势，C. elegans 被广泛用作遗传学研究的模式生物。然而，这些有利特性也给研究人员带来了一些挑战。由于其世代周期短，C. elegans 种群会迅速耗尽食物，或很快演变为包含多个世代和不同发育阶段的混合种群。因此，在固体线虫培养基（NGM）上进行实验时，研究人员必须在细菌食物耗尽以及新幼虫出现之前，将线虫手动转移至新的培养皿中。这一过程较为繁琐，因为需要频繁转移线虫，以防止实验种群与子代混合。然而，某些实验既需要大量个体，又需要较长时间点（例如，成虫期的 DNA 或 RNA 提取），这进一步加大了维持同步化种群并转移大量线虫的难度。

目前将培养在NGM上的C. elegans进行转移的方法包括挑取法或冲洗法将线虫从一个培养皿转移到另一个培养皿；化学处理线虫（例如，使用DNA复制抑制剂氟脱氧尿苷，即FUDR）；或使用流式细胞术将线虫分选至多孔板中。挑取法需要使用手工工具，该工具通常由细铂金丝或睫毛制成，用于手动转移单个或多个线虫^3,4。该方法准确度高，但需要熟练的技术且耗时较长，对于涉及大量线虫的研究而言存在明显局限性。此外，挑取过程可能对线虫造成物理损伤和应激，因为个体可能受到非自然且不一致的扰动和外力作用。冲洗法是用缓冲液冲洗培养皿，再通过玻璃巴斯德移液管将含有线虫的溶液转移至新的培养皿中。该方法快速高效，但由于会批量转移多个世代和不同发育阶段的线虫，因此准确性较差。化学处理方法（如FUDR）可溶解于培养基中，通过阻断DNA复制来抑制后代的产生，从而阻止配子形成和卵子发育。尽管该方法有效，但必须在发育成熟后使用，以避免干扰正常的发育过程，这意味着在施用该药物前仍需进行线虫的转移³。此外，该方法会影响多种细胞信号通路，导致线虫在衰老过程中出现显著变化（例如，寿命延长或蛋白质稳态改变），具体效应取决于所使用的C. elegans品系^5,6,7,8,9,10。流式细胞术方法可自动将单个C. elegans从一个多孔板分选并转移至另一个多孔板¹¹。虽然该方法非常高效，但流式细胞仪设备价格昂贵，许多研究人员难以获得。另一种替代方法是使用温度敏感型突变体模型，如fer-15和fem-1，通过调节温度使其不育¹²。尽管在某些情况下使用突变体线虫具有优势，但这些特定品系的生长速度慢于野生型线虫，且其基因组已被改变，因此不能很好地代表正常衰老或健康状态下的线虫。此外，依赖温度变化诱导不育会导致实验环境无法保持恒定，而温度变化已被明确证实会影响基因表达^13,14,15。已有研究团队发表过利用筛网按大小过滤C. elegans的技术¹⁶。然而，我们未能找到先前有关此类过滤方法是否会影响线虫整体健康结局的相关研究报道。

因此，有必要 秀丽隐杆线虫 科研界亟需一种经济、高效、快速且准确的方法，用于在培养皿之间转移大量动物。我们开发了一种改进的、易于获取的设备（命名为 秀丽隐杆线虫 筛网）及其制造与操作的配套方案，以满足相关需求 秀丽隐杆线虫 科研界。在此，我们分享了该设计 秀丽隐杆线虫 筛子及其使用方法，我们证明了与标准人工挑选以及常用生育抑制化学物质FUDR处理相比，使用该筛子不会影响线虫的常见健康指标或任何应激标志物。

方案

1. 秀丽隐杆线虫 筛选装置的构建与使用

1. 构建方案
   1. 从50 mL离心管中取下两个管盖（图1A).
   2. 移除盖子内唇内部中央区域（从底部观察时） 图1B使用本生灯和热金属探针、电烙铁或阶梯钻头进行操作。
      注意：使用加热方式切割塑料盖比使用刀片更安全，因为受伤风险更小。
   3. 清洁并打磨切割边缘，然后使用弧形锉刀或旋转研磨工具对表面进行修整例如，Dremel）。参见 图1C.
   4. 将单丝网片裁剪成合适的直径（图1D）。为此，将盖子的轮廓描在单丝尼龙网片上，并沿所画线条内侧剪下。
   5. 在瓶盖的顶面切割沟槽或切口，以增强涂抹胶水后两个瓶盖在塑料表面的粘附性图1E).
   6. 用乙醇清洁盖子，然后晾干。
   7. 在两个盖子的顶面外边缘涂抹氰基丙烯酸酯胶水。
      注意：少量胶水即可，用量宜少。
   8. 根据说明放置单丝网片 表1，置于一个已粘合的盖子上（图1F）。将第二个盖子倒置在筛网上方，确保两个盖子的顶部相对。用力压紧（图1G确保网膜绷紧。
      注意：出于安全考虑，使用镊子将滤网放置在盖子上。
   9. 待初始胶层干燥后，在盖子外侧缝隙周围涂抹一圈氰基丙烯酸酯胶。用量宜充足，以增强结构完整性，防止开裂或泄漏。
   10. 用单丝网的网孔尺寸标记滤膜。
       注意：此处我们使用两种孔径的滤网——20 µm 和 50 µm。
2. 使用方案
   1. 预润筛网。
      1. 移液一种盐溶液，例如 M9 [5 g NaCl，6 g Na₂HPO₄，3 g KH₂PO₄，1 L超纯水₂O 和 1 mL MgSO₄₄ (1 M)¹⁷，穿过筛网中心，直至液滴在滤膜底部中央形成、凝聚并滴落（图2A）。可选步骤：使用无绒布（例如，Kimwipe）到底部以塑形或铺展网状结构上的液滴。
      2. 将筛子置于一个50 mL锥形管上方。将该管标记为“废液管”图2B).
   2. 洗涤一个群体的 秀丽隐杆线虫 从琼脂平板上分离。
      1. 用M9缓冲液洗涤平板，并将含有线虫的培养基每次1 mL置于单丝网的上表面图2C）。确保在筛网中央操作。将所有蠕虫从培养皿中冲洗下来。
         注意：通常情况下，60 mm 培养皿使用 3 mL M9 培养基即可。
      2. 为尽量减少移液过程中线虫的损失，使用玻璃巴斯德移液管将线虫从培养板转移至筛网中央（根据需要重复操作）。
      3. 用M9缓冲液从上方冲洗滤膜。再次确保操作位于筛网中央，并冲洗该区域内的所有线虫。根据需要重复冲洗多次，以确保所有细菌和较小的线虫均通过筛网。
   3. 从筛子中收集大小一致的动物样本。
      1. 将一个新的50 mL离心管连接到筛子顶部，使步骤1.2.2.3中获得的成虫朝向新收集管内部（图 2D).
      2. 移除第一个管子（废液管），并迅速翻转筛网和新管子，以防止液滴迁移（图 2E).
         注意：如果无需无菌操作，可使用无绒布（例如，Kimwipe）在翻转前从网底部吸除液体。
      3. 用M9缓冲液从新的上层部分冲洗筛网至新的50 mL离心管中图2F）。再次在网格中心操作，并在网格底部保持一个液滴。
      4. 让线虫自然沉降或轻轻离心沉淀（例如, <16 x g）约 1 分钟（图 2G).
      5. 吸出虫体沉淀中的缓冲液，理想情况下尽量吸至沉淀表面 >0.5 mL，或尽可能移除液体，切勿扰动沉淀。
      6. 使用玻璃巴斯德移液管将线虫转移至NGM平板上，并使其干燥。将多个液滴分散放置于新的平板上，以加快干燥速度（图 2H).
   4. 清洗筛子。
      1. 用乙醇和反渗透水轻轻且彻底地冲洗筛子，然后使其干燥。
      2. 将其储存于洁净容器中，以供长期无限期使用。
      3. 当筛网出现破损时，将其丢弃 "矢状面" 外观

2. Caenorhabditis 筛选分选方法的验证

1. 常规维护
   1. 所有实验均需在标准线虫生长培养基上培养线虫¹⁷ （1 L NGM 包含 2.5 g 胰蛋白胨、17 g 琼脂、3 g NaCl、975 mL 双蒸水、1 mL 5 mg/mL 胆固醇、1 mL 1 M CaCl₂）₂，1 mL 1 M MgSO₄₄，25 mL 1 M KHPO₄，以及0.5 mL 100 mg/mL链霉素）在25 °C下。
2. 实验处理给药
   1. 比较三种处理组：挑取、氟脱氧尿苷（FUDR）和 秀丽隐杆线虫 筛子
      1. 对于FUDR处理组，将100 mg/mL的FUDR加入NGM培养基中，使其终浓度为100 μM，以防止后代产生，并每隔一天将线虫转移至新的NGM平板，避免食物耗尽。
      2. 对于挑取组，使用铂金环手动挑选并转移线虫。
      3. 对于 秀丽隐杆线虫 筛分处理组，按照步骤1.2操作，用移液器将线虫转移至NGM平板上。
3. 秀丽隐杆线虫 筛分百分产率
   1. 量化筛子在分选方面的有效性 秀丽隐杆线虫，将同步化年龄的N2动物在25 °C培养至成虫第1天（即在产卵后48小时，用挑取法将它们转移到新鲜的NGM平板上（每个处理组共计N = 50或N = 100只动物）。
   2. 恢复培养24小时后，将种群转移至新的NGM平板 秀丽隐杆线虫 按照上述方案进行筛选（见步骤1.2），并统计成功转移的动物数量。
   3. 以转移开始时的动物起始数量为基准，计算被转移动物数量所占的百分比，公式为（被转移的动物数量 / 起始动物数量）× 100（%）。
4. 健康寿命检测方法
   注意：在25 °C条件下培养的同步化成年N2动物，于成年后的第2、4、6和8天，分别评分其运动能力等级、咽部泵动频率，以及前部和后部轻触反应等健康寿命参数。
   1. 运动性追踪
      1. 根据 Herndon 的方法，采用基于类别的系统（A、B 和 C 类）对运动性进行评分 等¹⁸使用统计分析软件中的有序逻辑回归统计模型比较三个实验组的效果。
         注意：A类个体可自发地以正常正弦波模式移动。B类个体的运动明显偏离正弦波模式，可能需要刺激以诱发运动。C类个体在受到刺激时可移动头部和/或尾部，但无法在琼脂表面移动。
   2. 咽泵频率
      1. 在体视显微镜下以600倍终末放大倍率，目视计数动物咽部末端磨胃的运动次数，持续1分钟。
      2. 使用单因素方差分析（one-way ANOVA）进行统计分析，显著性水平 α = 0.05，并采用 Bonferroni 法进行事后检验，显著性水平 α = 0.05。
   3. 触觉反应
      1. 记录轻触反应，并比较三个处理组之间的差异。根据 Calixto 描述的方法进行实验。 等¹⁹.
      2. 用眼睫毛探针轻轻垂直划过动物的尾部或头部（头部和尾部交替进行，各5次），记录其前部和后部的触碰反应。
      3. 在0到5的评分标准中，对于前部和后部反应，将与刺激方向相反的任何运动记为1分。
      4. 采用单因素方差分析（one-way ANOVA）进行统计分析，显著性水平 α = 0.05，并进行 Bonferroni 事后检验，显著性水平 α = 0.05。
5. 繁殖力测定
   1. 为了确定……的使用 秀丽隐杆线虫 筛网对繁殖的影响：在25 °C下将N2动物培养至成虫第2天以获得年龄同步的个体。
   2. 在产卵后60小时，使用铂金丝接种针或移液器将动物转移至新的NGM平板中 秀丽隐杆线虫 过筛，并静置恢复4小时（将过筛后的培养皿干燥20–30分钟）。
   3. 恢复后，使用睫毛挑针将动物单独转移至NGM平板，给予24小时产卵时间，随后移除亲代动物。将每块平板上的子代在25 °C正常条件下继续培养24小时。
      注意：睫毛挑取针是将一根人体睫毛用指甲油固定在巴斯德移液管末端，并用乙醇灭菌制成的。
   4. 统计F1代可存活个体的数量。使用T检验进行统计分析，显著性水平α = 0.05。
      注：可存活的子代是指成功孵化并进入正常幼虫发育周期的卵。
6. 荧光报告基因应激反应检测
   1. 使用三种常用的荧光报告基因检测方法来检测潜在的应激标志物：在品系 [TJ356- zIs356 (pDAF-16::DAF-16-GFP;rol-6)] 中检测 DAF-16::GFP 向细胞核的转位²⁰；hsp-16.2 表达 [TJ375- gpIs1 (hsp-16.2p::GFP)]²¹；以及 sod-3 表达 [CF1553-muIs84([pAD76]sod-3p::GFP+rol-6[su1006])]²².
   2. 每次实验均从三个处理组中培养年龄同步的动物，在20 °C条件下培养，并于成虫第3天进行观察：设置阴性对照组（每天使用铂金丝挑取工具手动转移一组动物）、阳性对照组（每天使用铂金丝挑取工具手动转移一组动物，并施加一种已确立的应激因素）以及待测处理组 秀丽隐杆线虫 筛子（将动物通过筛子筛选，并在成像前将其置于NGM培养基上恢复30分钟）。
   3. 在 DAF-16::GFP 检测中，成像前将阳性对照动物在 37 °C 下热激 30 分钟²⁰对于 hsp-16.2 检测，在成像前 20 小时将阳性对照动物进行 90 分钟的热激处理²¹对于 sod-3 检测，在成像前用 100 mM 甲基紫精处理阳性对照动物 4 小时²².
   4. 立即用睫毛挑取虫体，并将其转移至盖玻片上，加入1 μL 36%泊洛沙姆407表面活性剂溶液以固定虫体。
   5. 将已封片的线虫用另一盖玻片夹在中间。将两个盖玻片固定于标准玻璃显微载片上，使用倒置荧光显微镜配合FITC滤光片，在8倍物镜（总放大倍数为80倍）和固定曝光条件下对线虫进行成像。
   6. 为检测三组间在DAF-16::GFP检测中的差异，根据DAF-16::GFP报告蛋白的定位对动物进行分类（若报告蛋白转位至细胞核则为核内型，若位于细胞质则为胞质型，若同时存在于细胞核和细胞质则为中间型）。
   7. 使用统计分析软件中的有序逻辑回归统计模型比较结果。对于 hsp-16.2 和 sod-3 表达检测，采用单因素方差分析（ANOVA），显著性水平 α = 0.05，并进行 Tukey 检验。 事后检验 使用 α = 0.05 的检验来比较头部区域的总荧光强度。

结果

的 秀丽隐杆线虫 筛网由两个螺帽组成，用于固定一片网孔小于目标发育阶段生物体直径的编织尼龙单丝网，通过简单的冲洗技术提取生物体的活体种群。该装置可连接标准锥形管，利用网筛通过体径对生物体进行机械分选，使目标生物保留在管内，便于后续培养与实验。例如，转移或基因收获）。用温和的手动方式用 秀丽隐杆线虫 筛分法快速，每个60–100 mm培养皿约需5分钟，且生物体易于从筛网中回收。

动物后续的百分比产率 秀丽隐杆线虫 筛网使用
计算反应的产率百分比 秀丽隐杆线虫 筛网，使用20 μm和50 μm孔径的网筛在成年动物上进行了测试。平均收获量为a >两种测试网孔尺寸的动物转移成功率均达到90%（表1).

讨论

本文介绍了可及且高效的Caenorhabditis筛具的设计与使用方法，该工具可用于C. elegans的分选与维持。相较于手动挑选个体、清洗种群、化学处理（例如，FUDR）以及更昂贵的动物分离方法，该工具具有多项优势。首先，Caenorhabditis筛具能够高效、快速地（少于20分钟）从大量混合种群中分离子代（表2）。此外，该工具的使用对动物的健康寿命无明显毒性影响（图3、图4、图5、图6），不会诱导已知的遗传应激报告系统（图7、图8、图9），并减少了可能影响培养板处理或后续任何分子检测的外源化学物质的引入。其操作简...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
护目镜	Uline	S-21076
防护耐热手套	Grainger	货号 # 3AT17 制造商型号 # 3AT17 目录页码 # 1703
50 mL 圆底离心管	Falcon	14-432-22
合成尼龙网	Dynamic Aqua-Supply Ltd	NTX20 和 NTX50
氰基丙烯酸酯胶水	Scotch Super Glue Liquid	SAD114
钳子	Vampliers	VMPVT-001-8
带圆形锉刀的Dremel工具	Lowe's	货号 # 525945 型号 # 100-LG
FUDR	Sigma	F0503
M9 化学品（NaCl、Na2HPO4、KH2PO4、MgSO4）	Sigma	S7653、RES20908-A7、1551139、M7506
NGM 平板化学品（细菌蛋白胨、琼脂、KH2PO4、K2HPO4、CaCl2、胆固醇、链霉素）	BD Biosciences（细菌蛋白胨）、Lab express（琼脂）、Sigma（其余）	BD bioscience 211677、Lab Express 1001、 Sigma 1551139、1551128、C1016、C8667、S6501
Pluronic F-127	Sigma	P2443
百草枯二氯化物水合物	Sigma	36541
倒置荧光显微镜	Olympus	FSX100