本文介绍了一种从硅藻中分离岩藻黄素叶绿素a/c结合蛋白（FCP），并将其整合到具有天然脂质组成的脂质体中，以研究离子组成变化对激发能传递影响的实验方案。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
植物、藻类和硅藻的光合性能在很大程度上依赖于叶绿体类囊体膜中光能捕获与能量传递过程的快速而高效的调控。硅藻的光捕获天线，即所谓的岩藻黄质叶绿素a/c结合蛋白（FCP），在光吸收及高效将能量传递至光合反应中心方面发挥关键作用，同时也参与强光条件下的光保护。这两种功能之间的转换机制长期以来一直是研究的重点。许多相关研究使用了在去垢剂胶束中的FCP进行实验。在进行相互作用研究时，去除去垢剂会导致FCP复合物发生非特异性聚集。这种方法难以区分实验假象与具有生理意义的数据。因此，若将FCP及其他膜结合光捕获复合物置于其天然脂质环境中进行研究，则可更可靠地获得有关蛋白-蛋白相互作用、能量传递及其他光谱特性的信息。该方法的主要优势在于，脂质体具有明确的尺寸和脂质/蛋白比例，从而可精确控制FCP的聚集程度。此外，调控光捕获过程的pH值和离子组成的变化也可在该体系中进行模拟和研究。 体内 可以轻松模拟。与类囊体膜相比，脂质体更加均一且结构更简单，这使得获取和理解光谱数据更为容易。本方案描述了FCP的分离与纯化、脂质体制备，以及将FCP整合到具有天然脂质组成的脂质体中的操作步骤。文中还给出了典型应用的结果并进行了讨论。
引言
光合生物（如硅藻）必须应对不断变化的光照条件，并通过复杂的适应机制维持高光合效率，同时防止过量光照引起的光氧化损伤。在光合真核生物中，一种主要的光保护过程是高能淬灭（qE在光胁迫条件下，吸收光能的耗散是非光化学淬灭（NPQ）的主要贡献因素1,2,3. 光捕获天线复合体（LHC）参与调控激发能传递途径。作为对高光强引起的低 pH 在叶绿体腔内，天线系统从光捕获状态转变为淬灭状态。这种能量耗散状态可保护类囊体膜中的光系统（PS）及其他复合物免受光氧化损伤。在光合真核生物中，该淬灭过程（qE 通常由两个因素诱导1,2,3. 一个因素是能够响应低光环境的特化光捕获蛋白 pH. PsbS 蛋白诱导 qE 在高等植物中4. LhcSRs5，受PsbS活性调节，诱导qE 在绿藻中6. 硅藻含有与LHCSR在结构上....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
注意：光合作用复合体（如 FCPs）对光和热极为敏感。操作时务必在冰上进行，并置于极暗的光线下。
1. 从细胞中分离 FCP
- 类囊体的分离提取自 C. meneghiniana 细胞
- 培养 C. meneghiniana 在五个500 mL的烧瓶中，每个烧瓶装有300 mL ASP培养基23,25 以及5000万个细胞。用棉塞封住培养瓶，在120 rpm摇床中培养约一周，光照周期为16小时光照、8小时黑暗，使细胞生长至对数生长期。 40 µmol 光子/(m²·s) 白光，温度介于15-18 °C用细胞计数板检测，确保细胞密度在每毫升150万至200万个细胞之间。
- 以 4,000 x g 离心细胞 g 在预冷的转子中使用500 mL离心瓶（4 °C) 中高速离心 15 分钟。将细胞沉淀重悬于 12 mL 匀浆缓冲液（HB, 表1通过移液操作。
- 将悬浮液转移至一个50 mL塑料管中。将样品在-80 °C 或继续进行步骤 1.1.3。
- 预冷珠磨机及设备。将玻璃珠....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
本方案描述了从Cyclotella meneghiniana中分离总FCP组分，并将其整合到具有天然脂质组成的脂质体中的方法。类囊体的分离具有高度可重复性，但类囊体得率可能有所变化。若在步骤1.1.4中回收的色素超过总量的50%，结果即为可接受；回收率超过80%为最佳。
类囊体的溶解是一个关键步骤。若步骤1.2.2后的上清液中含有大部分色素，则表明膜已充分溶解。若能清晰区分出褐色条带（FCP）和绿色条带（PS），则说明捕光复合体（FCP）与光系统已实现良好分离。图 2A）。梯度顶部出现明显的黄绿色条带表明因过度溶解而导致的色素损失。每次制备过程中均可能发生色素损失，只要不影响能量向chl a的转移功能，一定程度的色素损失是可以接受的图 2C二维）。此外，FCP 富集步骤（1.2.4）.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
具有天然脂质成分的FCP脂质体为研究光谱特性提供了一种便捷、简单且可重复的工具 体外 FCP脂质体中的脂质环境类似于类囊体膜内的状况，因此获得的实验结果更接近于自然条件。
C. meneghiniana 作为 FCP 天线的研究模型系统具有多个优势。与其他硅藻模式物种（例如 Thalassiosira pseudonana）相比，其生长速度相对较快，且更为强健。细胞在珠磨机中易于破碎，可获得较高产量的完整类囊体复合物。C. meneghiniana 最主要的优势在于近年来已积累了丰富的生物化学与光谱学数据16,17,23,27,29,
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
感谢Rana Adeel Ahmad在FCP纯化方面的协助。感谢Claudia Büchel教授提供的有益讨论及对稿件的审阅。本工作得到了德国研究基金会对LD的资助（DI1956-1/1）以及洪堡基金会为LD提供的费奥多·林嫩奖学金的支持。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 500 ml 离心管 | |||
| 高速离心机 | Heraeus | ||
| Bead Mill VI 2 | Edmund-Bühler（edmund-buehler.de） | 新版本：Vibrogen-Zellmühle Vl 6 | |
| Silibeads S 400 µm | Sigmund-Lindner.com | 5223-7 | |
| Silibeads S 1,-1,3 mm | Sigmund-Lindner.com | 4504 | |
| VitraPOR 滤器漏斗 - por1 | ROBU GmbH | 21121 | |
| 聚碳酸酯超速离心管（30 mL），用于 T-865 | 贝兰实验室äte (Laborgeraete-beranek.de) | 314348 | |
| Ultracentrifuge Discovery 90SE | Sorvall | n.a. | |
| 转子 T 865 | ThermoFisher Scientific (thermofisher.com) | 51411 | |
| 改进型纽鲍尔细胞计数板 | 卡尔罗思实验室用品（Carlroth.com） | T729.1 | |
| 蔡司显微镜 Primostar (7) | Optik-Pro (optik-pro.de) | 51428 | |
| 光学玻璃比色皿（6040-OG） | Hellma Analytics (hellma-analytics.com) | "6040-10-10" | |
| V-630 紫外-可见分光光度计（含软件） | Jasco (jasco.de) | V-630 | |
| 正十二烷基-β正辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷 | ANATRACE (anatrace.com) | D310LA | |
| 超清晰管 17 ml，用于 AH629 | 贝兰实验室äte (Laborgeraete-beranek.de) | 344061 | |
| 转子 AH629-17-mL | 赛默飞世尔科技（thermofisher.com） | 54285 | |
| 膜浓缩器_Centriprep 30 kDa 截留分子量 | 默克密理博（merckmillipore.com） | 4307 | |
| Biometra Minigel-Twin | Analytik Jena AG（analytik-jena.de） | 846-010-100 | |
| Silver Stain Plus试剂盒 | Bio-Rad（bio-rad游戏副本） | 1610449 | |
| LibreOffice 电子表格 | 文档基础 | https://de.libreoffice.org/download/libreoffice-still/ | |
| 用于荧光的特殊玻璃比色皿（101-0S） | Hellma Analytics (hellma-analytics.com) | 101-10-20 | |
| 光谱荧光仪 FP-6500（含软件） | Jasco (jasco.de) | FP-6500 | |
| SDS上样缓冲液 Roti-Load | ROTH (carlroth.com) | K929.1 | |
| n-辛基 β-D-葡萄糖吡喃糖苷 | ANATRACE (anatrace.com) | O311 | |
| 单半乳糖基二酰基甘油（MGDG） | Larodan AB (larodan.com) | 59-1300 | 用氯仿配制储备液 |
| 二半乳糖基二酰基甘油（DGDG） | Larodan AB (larodan.com) | 59-1310 | 用氯仿配制储备液 |
| 磺基醌甘油二酯（SQDG） | Larodan AB (larodan.com) | 59-1230 | 用氯仿配制储备液 |
| L-α-磷脂酰甘油（PG） | Larodan AB (larodan.com) | 37-0150 | 用氯仿配制储备液 |
| L-α磷脂酰胆碱 | Sigma-Aldrich（sigmaaldrich.com） | P3782 SIGMA | 用氯仿配制储备液 |
| 超声波清洗仪 S-50TH | Sonicor (getmedonline.com) | SONICOR-S-50TH | |
| mini-Extruder | 艾万迪极性脂质公司（Avanti.com） | 610000 | |
| 核孔聚碳酸酯膜 | Avanti Polar Lipids (Avanti.com) | 610005 | |
| 透析膜 Visking 14 kDa 截留分子量 | ROTH (carlroth.com) | 0653.1 | 使用前在蒸馏水中煮沸 |
| Biobeads SM2 吸附剂 | 伯乐（Bio-rad.com） | 152-3920 | |
| 蔗糖环氧氯丙烷共聚物 - Ficoll 400 | Sigma-Aldrich（sigmaaldrich.com） | F4375 | |
| 用于 TFT 80.4 的聚碳酸酯超速离心管（2.7 mL） | 贝拉诺克实验室äte（Laborgeraete-beranek.de） | 252150 | |
| 转子 TFT 80.4 | 默克密理博（merckmillipore.com） | 54356 | |
| 按出现顺序列出的材料 | 有关具体的安全说明，请参阅材料安全数据表及相关手册。 标准实验耗材和试剂未列出。 |
参考文献
- Eberhard, S., Finazzi, G., Wollman, F. A. The Dynamics of Photosynthesis. Annual Review of Genetics. 42, 463-515 (2008).
- Li, Z. R., Wakao, S., Fischer, B. B., Niyogi, K. K. Sensing and Responding to Excess Light. Annual Review of Plant Biology. 60, 239-260 (2009).
- Niyogi, K. K., Truong, T. B.
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
标签
