研究核糖核苷酸的掺入：酵母基因组中核糖核苷酸的链特异性检测及核糖核苷酸诱导突变的测量

摘要

核糖核苷酸是在真核生物细胞核DNA复制过程中掺入基因组中最丰富的非经典核苷酸之一。如果未能被及时清除，核糖核苷酸可能导致DNA损伤和诱变。本文介绍了两种用于评估DNA中核糖核苷酸掺入丰度及其诱变效应的实验方法。

摘要

核DNA中核糖核苷酸的存在已被证实是基因组不稳定的来源之一。核糖核苷酸的掺入程度可通过碱性水解和凝胶电泳进行评估，因为RNA在碱性条件下极易发生水解。结合Southern印迹分析，该方法可用于确定核糖核苷酸掺入的位置及其所在的DNA链。然而，该方法仅为半定量，可能不足以检测核糖核苷酸含量的微小变化，尽管使用链特异性的Southern杂交探针可提高检测灵敏度。作为评估DNA中核糖核苷酸最显著生物学后果之一的指标，可利用正向突变检测法分析其引发的自发突变。通过选用适当的报告基因，可筛选出导致功能丧失的稀有突变，并结合波动实验数据与报告基因的DNA测序结果，测定总体突变率及特异性突变率。波动实验适用于在特定遗传背景或生长条件下研究多种类型的诱变过程。

引言

在真核生物核DNA复制过程中，三种主要的DNA聚合酶（DNA聚合酶α、ε和δ）均会将核糖核苷酸掺入基因组中^1,2。RNase H2依赖性的核糖核苷酸切除修复（RER³）可清除大部分嵌入的核糖核苷酸。

DNA 中的核糖核苷酸易发生水解，因为糖基上的 2' 羟基可攻击相邻的磷酸二酯键，产生一端为 2'-3' 环状磷酸、另一端为 5'-OH 的断裂产物⁴。碱性条件可显著加速该反应。因此，在碱性溶液中孵育时，嵌入的核糖核苷酸发生水解会导致基因组 DNA 断裂，可通过碱性琼脂糖凝胶电泳进行检测⁵。随后可将 DNA 转移至膜上，并利用链特异性探针进行 Southern 印迹杂交分析，从而分别鉴定出因核糖核苷酸掺入新生前导链或后随链 DNA 所产生的碱敏感位点。

在缺乏RNase H2活性的酵母细胞中，当拓扑异构酶I（Top1）在嵌入的核糖核苷酸处切割DNA时，可启动核糖核苷酸的切除过程^6,7。然而，当Top1在核糖核苷酸的3'侧进行切割时，会产生5'-OH和2'-3'环状磷酸化的DNA末端，这些末端难以重新连接。若未能修复这些“不洁末端”，或对其进行异常加工，可能导致基因组不稳定。此外，如果切割发生在重复DNA序列内部，修复过程可能引发缺失突变。对于串联重复序列而言，这一问题尤为突出，在缺乏RNase H2活性的细胞中常观察到短片段缺失（通常为2至5个碱基对）。在酵母RNase H2活性缺失的情况下，Top1依赖性的有害效应在DNA聚合酶ε突变体（pol2-M644G）中进一步加剧，该突变体在新生前导链合成过程中非特异性地掺入核糖核苷酸。

DNA中核糖核苷酸的加工会导致自发突变，这种诱变效应可通过使用适当的报告基因并筛选伴随的表型变化来检测。波动试验（fluctuation test）或Luria和Delbrück实验是利用可选择性报告基因测定自发突变率的最常用方法之一^8,9。在酵母中，URA3 和 CAN1 基因可作为前向突变检测中的报告基因，从而检测所有导致基因功能丧失的突变类型。自发突变率通常通过起始于单菌落（目标报告基因无突变）的多个平行培养物中所观察到的突变率的中位数进行估算。例如，酵母RNase H2缺陷型菌株（如 rnh201Δ）的整体自发突变率轻度升高，这主要是由于串联重复序列中2–5 bp缺失的发生频率增加所致。因此，为了全面表征基因组中核糖核苷酸的诱变效应，需要确定特定类型的突变率。在此情况下，可通过扩增并测序 URA3 或 CAN1 报告基因，以确定突变的类型和位置，并计算特定突变率。汇总多个独立的 URA3 或 CAN1 突变体中鉴定出的突变，可用于构建突变谱。

方案

1. 碱性水解与链特异性Southern印迹（图1）

1. 细胞生长与基因组DNA提取
   1. 使用酵母DNA纯化试剂盒，按照制造商说明书提取酵母基因组DNA。选用处于对数生长期的培养物（光密度值介于0.5至1之间）。将最终的DNA沉淀重悬于35 mL 1×TE缓冲液（10 mM Tris-HCl，pH 7.5，1 mM 乙二胺四乙酸（EDTA））中。
   2. 向DNA中加入1 mL浓度为5 mg/mL的RNase A，37 °C孵育30分钟。
   3. 使用 0.1 体积的 3 M 醋酸钠（pH 5.2）和 2.5 体积的 100% 乙醇在冰上孵育 20 分钟，沉淀 DNA。
   4. 在 4 °C 条件下以 16,000 x g 离心 20 分钟。使用移液器弃去上清液。
   5. 用500 mL 70%乙醇洗涤沉淀物两次。使用移液器移除上清液。
   6. 将沉淀在常温下干燥，并重悬于35 ml的1×TE缓冲液中。
   7. 使用荧光计对DNA进行定量材料表使用dsDNA BR检测试剂盒。
   8. 使用3 M乙酸钠（pH 5.2）0.1体积和100%乙醇2.5体积，从每个样品中沉淀5 mg DNA，总体积为200 mL（加入H₂如有必要，若需进行中性凝胶对照，则需额外加入5 mg DNA。冰上孵育20分钟。
   9. 在 4 °C 条件下以 16,000 x g 离心 20 分钟。使用移液器移除上清液。
   10. 将沉淀在实验台上干燥。用14 mL H₂O重悬DNA。₂O.
2. 碱性水解与凝胶电泳
   1. 加入6 mL 1 M KOH，55 °C孵育2 h。
   2. 将样品置于冰上孵育5分钟。
   3. 加入4 mL 6x碱性DNA上样缓冲液：300 mM KOH，6 mM EDTA，pH 8.0，18% 多聚蔗糖（polysucrose）材料表0.15% 溴甲酚绿和 0.25% 二甲苯青 FF
   4. 制备一块碱性凝胶，其中含有1%琼脂糖、50 mM NaOH、1 mM EDTA，pH 8.0。使用可每道上样24 mL DNA样品的梳子。
   5. 在室温下使用1×碱性电泳缓冲液（50 mM NaOH，1 mM EDTA，pH 8.0）进行凝胶电泳。同时加入适当大小的DNA分子量标记物。
   6. 短暂离心试管，将全部24 mL样品加入碱性琼脂糖凝胶中。先在30 V下电泳30分钟，随后在10 V下电泳18–20小时。
   7. 用中和缓冲液 I（1 M Tris-HCl，1.5 M NaCl）在室温下轻轻振荡孵育两次，每次45分钟，对凝胶进行中和。
   8. 将中和后的凝胶浸入含有1/10,000稀释SYBR Gold染料的200 mL水中，室温下轻轻振荡染色2小时。
   9. 使用紫外透射仪观察DNA。碱敏感性增加会导致出现较小的DNA片段，表明DNA中未修复的核糖核苷酸密度较高⁵.
3. Southern印迹转移
   1. 通过毛细作用将DNA从碱性凝胶转移至带正电荷的尼龙膜上¹⁰Sambrook 和 Russell 的手册中提供了该转移操作设置的一个示例¹⁰.
   2. 将碱性凝胶在碱性转移缓冲液（0.4 M NaOH，1 M NaCl）中于室温浸泡15分钟。
   3. 将尼龙膜（裁剪至与凝胶相同大小）先用清水短暂润湿，然后在碱性转移缓冲液中浸泡5分钟。
   4. 将3个玻璃烧杯（100 mL）倒置在玻璃烤盘中，搭建转移平台。该烤盘应略大于琼脂糖凝胶的尺寸。将一块玻璃板置于其上方。
   5. 将两张较大的3 MM CHR色谱纸（裁剪至与凝胶宽度相同，两侧留出足够长度以便垂挂在玻璃板边缘并浸入缓冲液槽中）铺盖在玻璃板上。
   6. 将碱性转移缓冲液倒入层析滤纸上方，并使玻璃皿液面达到一半高度。使用5 mL玻璃移液管排除气泡。
   7. 将琼脂糖凝胶放在上方，再次轻轻压平气泡。用帕拉膜（parafilm）封住凝胶的所有边缘。向凝胶上倒入少量碱性转移缓冲液。
   8. 将预先浸泡的尼龙膜置于凝胶上方，展平并去除气泡。
   9. 将两张裁剪至琼脂糖凝胶大小的滤纸浸湿，置于膜上，并赶尽气泡。
   10. 在转移夹心结构上方放置一大叠纸巾（裁剪至略大于琼脂糖凝胶的尺寸）。小心地将一块玻璃板放在纸巾上方。在顶部添加一个有重量的物体（如一本质量为 400 g 效果良好。
   11. 在室温下过夜进行转移。
   12. 小心拆开转移叠层，将膜浸入中和缓冲液 II（0.5 M Tris-HCl，pH 7.2，1 M NaCl）中，室温下孵育 15 分钟。
   13. 使用紫外交联仪将DNA交联至带电尼龙膜上。将膜放入交联仪中，采用自动交联程序。
4. Southern探针制备
   注意：本文所述用于检测DNA新生前导链与后随链中碱性敏感位点的方法基于先前发表的实验方案¹¹在我们的实验中，探针在以下位置进行探测 URA3 报告基因，该基因以两种方向之一（OR1 或 OR2）插入到邻近位置 ARS306 染色体III上的复制起点（图3A）。酵母基因组 DNA 中碱性敏感位点的存在是核糖核苷酸掺入的指标，因此可将核糖核苷酸用作 DNA 聚合酶活性的生物标志物。^12,13,14。该方法利用高效靶向位点附近的DNA序列 ARS306 复制起点也应适用于其他基因组位置和靶基因。
   1. PCR扩增一段520个碱基对的片段 URA3 报告基因使用以下引物对：URA3-F1 (5´-GCTACATATAAGGAACGTGCTGC) 和 URA3-R1 (5´-CTTTGTCGCTCTTCGCAATGTC)。
   2. 使用10 - 20 ng酵母基因组DNA作为模板，每种引物（10 μM储备液）各4 μL，10 μL 10x Ex Taq Buffer（Mg²⁺ 加)，8 μL dNTP 混合物（各 2.5 mM），0.5 μL Ex Taq DNA 聚合酶（5 U/μL），用 H₂O 定容至终体积 100 μL₂O.
   3. 运行以下PCR程序：95 °C 预变性5 min；30个循环：95 °C 变性1 min，55 °C 退火1 min，72 °C 延伸2 min；72 °C 终延伸10 min，然后置于4 °C 保存。
   4. 使用PCR纯化试剂盒纯化PCR产物，并用50 mL H₂O洗脱DNA₂O. 现在可将此作为放射性标记反应的模板。
   5. 使用以下引物进行链特异性放射性标记：使用 URA3-A（5´-CTCATCCTAGTCCTGTTGCTGCC）检测与探针 A 杂交的 DNA。该引物对应于新生前导链 DNA URA3 位于OR2，以及新生的滞后链DNA URA3 位于OR1中。使用URA3-B（5´-CAGTACCCTTAGTATATTCTCCAG）探针检测与探针B退火的新合成DNA。这对应于新合成的前导链DNA URA3 位于OR1且为新生的滞后链DNA时 URA3 位于 OR2图3).
      1. 使用10 - 20 ng扩增产物进行放射性标记反应 URA3 片段作为模板DNA，2 μL引物（10 μM储备液），5 μL 10x Ex Taq缓冲液（含Mg）²⁺ 加），4 μL 2.5 mM dNTPs（不含dCTP），5 μL（50 μCi）α-³²P-dCTP，0.5 μL ExTaq DNA聚合酶（5 U/μL），用H₂O调整终体积至50 μL₂O. 运行以下放射性标记程序：94 °C 预变性 5 min；25 个循环（94 °C 变性 1 min，55 °C 退火 30 s，72 °C 延伸 1 min）；72 °C 延伸 5 min；4 °C 保存。
   6. 使用G-25离心柱去除未掺入的放射性标记物。在加入放射性标记样品前，将离心柱在720 × g下离心1分钟，并用移液器吸除缓冲液。加入放射性标记的反应产物后，在720 × g下离心2分钟，以洗脱标记的探针。
   7. 95 °C孵育5分钟，以在杂交前立即变性探针。短暂冰浴冷却。
5. Southern 杂交
   1. 将润湿的膜卷成杂交管，加入25 mL新配制的杂交缓冲液：0.5 M 磷酸钠缓冲液（pH 7.2）、7% 十二烷基硫酸钠（SDS）、1% 牛血清白蛋白（BSA）。在65 °C杂交炉中旋转孵育1–2小时。
   2. 小心倒出溶液，加入25 mL杂交缓冲液和放射性标记的探针。在65 °C下旋转孵育16–18小时。
   3. 将溶液倒入放射性废物容器中。用磷酸盐-SDS洗涤液I：40 mM磷酸钠缓冲液，pH 7.2，5% SDS，0.5% BSA，1 mM EDTA，pH 8.0，在室温下进行5次洗涤，每次5分钟。
   4. 用磷酸盐-SDS洗涤液II：40 mM磷酸钠缓冲液（pH 7.2）、1% SDS、1 mM EDTA（pH 8.0），在65 °C下每次洗涤15分钟，共洗涤2次。
   5. 用镊子将膜从杂交管中取出，置于打开的塑料保护套中。覆盖后放入成像板进行曝光。尝试多种不同的曝光时间，范围从4小时到4天。
   6. 如有需要，可使用不同的探针将印迹剥离并重新杂交，重复约 3 - 4 次。剥离步骤：将膜置于 25 mL 含 50% 甲酰胺和 2x SSPE 的溶液中，65 °C 孵育 2 h。
      注意：20x SSPE 储存液：3 M NaCl，0.2 M NaH₂PO₄，0.02 M EDTA，pH 7.4。
   7. 将溶液倒入放射性废物容器中。在65 °C下，用磷酸盐-SDS洗涤液II洗涤2次，每次15分钟。
   8. 用盖革计数器检测膜，若信号仍存在，则重复脱色步骤。
   9. 按照上述方法进行预杂交和杂交。

2. 测量酿酒酵母（S. cerevisiae）菌株的突变率和特异性

1. 准备细胞培养
   1. 接种单个菌落（健康的酵母细胞在30 °C下培养2 - 3天可形成适当大小的菌落），该菌落应生长于添加了100 mg/mL腺嘌呤的YPD琼脂培养基上。将菌落接种至5 mL添加了250 mg/mL腺嘌呤的YPDA液体培养基中（仅当所用菌株为腺嘌呤营养缺陷型时，才需添加腺嘌呤）。在30 °C条件下，于摇床培养箱或旋转仪中培养，直至菌液达到饱和状态（对于无严重生长缺陷的菌株，通常需要36 - 48 h）。
   2. 在约 2000 × g 离心力下离心 5 分钟以沉淀细胞。
   3. 弃去上清液，用5 mL无菌水洗涤细胞。
   4. 将细胞重悬于500 mL无菌水中。
2. 细胞培养物的稀释与接种
   1. 对于非筛选对照，将细胞在96孔板中稀释1,600,000倍，然后将每种培养物各取100 μL接种至完全培养基（COM）平板上。
   2. 用于筛选 ura3 突变体，将100 mL未稀释的细胞涂布于5-FOA平板，适用于野生型（WT）菌株。若目标菌株的突变率预计高于野生型菌株，则应相应稀释细胞后涂板。
   3. 用于筛选 can1 突变体，将细胞稀释5倍后，取100 mL涂布于含刀豆氨酸的平板（CAN）上，适用于野生型菌株。稀释倍数为0.5。
   4. 在30 °C条件下孵育平板，直至酵母菌落形成。对于无生长缺陷的菌株，COM和CAN平板通常需要2 - 3天，5-FOA平板需要3 - 5天。为比较不同菌株之间的突变率，应选择相同的生长时间点进行菌落计数。待计数的平板应存放于冷室（约4 °C）中。
3. 自发突变率的计算
   1. 统计每块平板上可见的菌落数量，并记录菌落数
   2. 使用 Drake 公式计算突变率： μ = f ÷ ln (μNt). f 突变频率通过最终培养物中的突变体数量除以细胞总数计算得出。Nt 是指最终培养物中的细胞数量， μ 是突变率。该方程可通过迭代法（如牛顿-拉夫逊法）求解。此外，还有其他估算方法，包括Lea和Coulson检验，可用于计算突变率。¹⁵.
   3. 假设各分离株突变率呈对数正态分布，计算其置信区间。最常用的是95%置信区间。
4. 突变谱分析
   1. 从每个5-FOA或CAN平板上挑取单个菌落，转接到YPDA平板上进行复苏培养。
   2. 进行菌落PCR以扩增目标片段 URA3 或 CAN1 基因和序列，以便使用以下引物检测突变：URA3-F（5’-CGCATATGTGGTGTTGAAGAA-3’）和 URA3-R（5’-TGTGAGTTTAGTATACATGCA-3’），用于 800 bp 片段的 PCR 扩增和测序 URA3 基因；用于扩增的 CAN1-F（5’-CTTCTACTCCGTCTGCTTTC-3’）和 CAN1-R（5’-CAGAGTTCTTCAGACTTC-3’），以及用于1800 bp片段测序的 CAN1-AR（5’-TGAAATGTGAAGGCAGCGTT-3’）、CAN1-9R（5’-CCTGCAACACCAGTGATA-3’）、CAN1-10R（5’-GAGGATGTAACAGGGATGAAT-3’）和 CAN1-BR（5’-CGGTGTATGACTTATGAGGG-3’） CAN1 报告基因
   3. 进行菌落PCR时，将单个菌落重悬于5 μL H₂O中₂O，并取1 μL作为模板。加入各1 μL的引物（5 μM母液）、2 μL的5x KAPA2G缓冲液（Mg²⁺ 加)，0.5 μL dNTP（2.5 mM），0.5 μL KAPA2G Fast DNA聚合酶，12 μL H₂O₂O.
   4. 用于扩增 URA3 基因，运行以下PCR程序：95 °C 预变性5 min；5个循环：95 °C 变性10 s，61 °C 退火15 s，72 °C 延伸30 s；35个循环：95 °C 变性10 s，61 °C 退火15 s，72 °C 延伸30 s；72 °C 延伸2 min，然后置于4 °C 保存。用于扩增 CAN1 基因，运行以下PCR程序：95 °C 预变性5 min；5个循环：95 °C 变性10 s，61 °C 退火15 s，72 °C 延伸45 s；35个循环：95 °C 变性10 s，61 °C 退火15 s，72 °C 延伸45 s；72 °C 延伸2 min，然后置于4 °C 保存。
   5. 使用 DNASTAR Seqman Pro 或 Sequencher 等软件将测序结果比对至参考序列，以鉴定突变。
   6. 按突变类型汇编突变数据（图4）或突变位点（图5）。通过突变频率（观察到的事件数除以测序的突变体数）乘以总体突变率，计算特异性突变率。

结果

基因组DNA经碱处理后进行碱性凝胶电泳，可实现对因稳定掺入核糖核苷酸所导致的DNA片段化的半定量检测。 图2 显示经或未经KOH处理的酵母基因组DNA的凝胶图像⁵Pol2是Polε的催化亚基，其M644L突变体掺入核糖核苷酸的能力降低，而M644G突变体掺入核糖核苷酸的能力则高于野生型聚合酶。如实验方案中所述，碱性凝胶可进一步通过链特异性Southern印迹分析进行检测。通过了解被检测基因组位点相对于其邻近复制起始点的位置，可选择性地检测新生前导链或后随链中掺入的核糖核苷酸。 图3 显示用Southern印迹杂交检测的结果 URA3 报告基因以两种相反的方向插入到一个早期启动复制起点附近， ARS306¹⁶通过使用前导链特异性探针，我们观察了在野生型菌株以及表达对核糖核苷酸掺入具有宽松特异性的DNA聚合酶α、δ和ε变体的菌株...

讨论

本文描述了两组实验方案，这些实验常用于对DNA复制过程中掺入的核糖核苷酸及其未修复时的致突变效应进行半定量分析。尽管这些方法涉及模式真核生物S. cerevisiae，但这些技术可轻松适用于其他微生物甚至更高等的真核生物。

利用碱性琼脂糖凝胶电泳结合Southern印迹法检测DNA中未修复的核糖核苷酸，可提供有关核糖核苷酸数量及其掺入链的重要信息。但需要注意的是，碱敏感性也可能由其他DNA损伤引起，例如无碱基位点。另一种检测DNA中核糖核苷酸的方法是使用纯化的RNase H2酶进行处理，该方法已在哺乳动物细胞中应用²¹。尽管我们的方法涉及在突变分析实验所用的URA3报告基因处探测新生前导链与后随链中的碱敏感位点，但也可设计结合基因组其他位置的探针，以获取有关其他基因组位点核糖核苷酸密度的重要信息。该实验流程中的Southern印迹部分也可作为其他常规DNA杂交实验的参考。

利用波动试验（Fluctuation test）测量突变率已被广泛用于分...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
YPD 培养基			20 g 葡萄糖，20 g 胰蛋白胨，10 g 酵母提取物，溶于去离子 H2O 并定容至 1 L，若制备固体培养基则加入 20 g Bacto 琼脂，高压灭菌。
COM 平板			1.3 g SC 缺陷型混合粉，1.7 g 不含氨基酸或 (NH4)2SO4 的酵母氮源基础培养基，5 g (NH4)2SO4，20 g 葡萄糖，20 g Bacto 琼脂，去离子 H2O 定容至 1 L。调节 pH 至 5.8。高压灭菌后每板倒入 30 – 35 ml。
CAN 平板			1.3 g SC-Ura 缺陷型粉末，1.7 g 不含氨基酸或 (NH4)2SO4 的酵母氮源基础培养基，5 g (NH4)2SO4，20 g 葡萄糖，20 g Bacto 琼脂，25 mg 尿嘧啶，H2O 定容至 1 L。121 °C 高压灭菌 15 分钟，冷却至 56 °C。加入 6 mL 过滤除菌的 1% 硫酸刀豆氨酸溶液。
5-FOA 平板			1.3 g SC-Ura 缺陷型粉末，1.7 g 不含氨基酸或 (NH4)2SO4 的酵母氮源基础培养基，5 g (NH4)2SO4，20 g 葡萄糖，20 g Bacto 琼脂，25 mg 尿嘧啶，H2O 定容至 800 mL。121 °C 高压灭菌 15 分钟，冷却至 60 °C。加入 200 mL 过滤除菌的 0.5% 5-FOA 溶液。
L-硫酸刀豆氨酸	US Biological	C1050
5-FOA	US Biological	F5050
20 mL 玻璃培养管			任意品牌
30 °C 培养箱中的培养旋转仪			可使用摇床培养箱替代
96 孔圆底板			无菌，任意品牌
3 mm 玻璃珠	Fisher Scientific	11-312A	使用前高压灭菌
12 通道移液器			任意品牌
Ex Taq DNA 聚合酶	TaKaRa	RR001
Epicentre MasterPure 酵母 DNA 纯化试剂盒	Epicenter	MPY80200
3 M 醋酸钠	Sigma-Aldrich	S7899
100% 乙醇
Qubit 2.0 荧光计	Invitrogen	Q32866	已有更新型号
dsDNA BR 检测试剂盒	Invitrogen	Q32850
KOH	Sigma-Aldrich	221473
EDTA	Sigma-Aldrich	E7889
Ficoll 400	Dot Scientific Inc.	DSF10400
溴甲酚绿	Eastman	6356
二甲苯青 FF	International Technologies Inc.	72120
NaOH	Sigma-Aldrich	S8045
1 M Tris-HCl (pH 8.0)	Teknova	T5080
SYBR Gold 核酸凝胶染料	Invitrogen	S11494
紫外透射仪
Amersham Nylon 膜 Hybond-N+	GE Healthcare	RPN303B
3 MM CHR 层析纸	Whatman	3030-392
NaCl	Caledon	7560-1
Stratalinker 1800	Stratagene
QIAquick PCR 纯化试剂盒	Qiagen	28106
G-25 离心柱	GE Healthcare	27-5325-01
1 M 磷酸钠缓冲液 (pH 7.2)	Sigma-Aldrich	NaH2PO4 (S9638); Na2HPO4 (S9390)
SDS	Sigma-Aldrich	L4522
BSA	Sigma-Aldrich	A3059
甲酰胺	Sigma-Aldrich	47671
盖革计数器