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利用小鼠脾细胞评估病原体相关分子模式对时钟基因表达的影响

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DOI：

10.3791/58022

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2018年7月24日

1Department of Biology, University of Hartford

本文内容

摘要

本方案描述了一种利用小鼠脾细胞发现可改变分子钟基因表达的病原体相关分子模式的技术。

摘要

从行为到基因表达，昼夜节律调控着生理功能的几乎所有方面。本文介绍一种利用病原体相关分子模式（PAMPs）脂多糖（LPS）、ODN1826 和热灭活的病原体刺激小鼠脾细胞的方法。 单核细胞增生李斯特菌 并研究它们对分子昼夜节律钟的影响。以往的研究主要集中在利用多种方法考察脂多糖（LPS）对分子钟的影响 体内 和 离体 来自多种模型的方法（例如， 小鼠、大鼠和人类。本实验方案描述了脾细胞的分离与刺激方法，以及通过定量PCR检测刺激后钟基因表达水平的技术流程。该方法不仅可用于评估微生物组分对分子钟的影响，也可用于研究其他可能改变钟基因表达的分子。该方法有助于解析病原体相关分子模式（PAMP）与Toll样受体相互作用影响钟基因表达的分子机制。

引言

哺乳动物的主时钟位于下丘脑的视交叉上核（SCN）内，它调控着生理和行为几乎所有方面的24小时节律振荡。1,2除了在机体水平上调控生物过程外，主时钟还能同步全身的外周细胞时钟。3,4,5尽管分子钟机制至少包含三个相互关联的转录-翻译反馈环路，其核心部分由 周期 (Per1-3), 隐花色素 (Cry1-2), Bmal1，以及 时钟 基因6,7. 除了维持核心分子钟的精确节律外，一些辅助性生物钟基因产物（例如，Rev-erbα 和 Dbp也调控非生物钟基因的表达， 即， 钟控基因（CCGs）6,7.

功能性分子钟已在多种免疫组织中被描述例如， 脾脏和淋巴结8 和细胞（例如， B细胞、树突状细胞、巨噬细胞8,9这些细胞通过Toll样受体（TLRs）等天然免疫识别受体，检测并响应病原体相关分子模式（PAMPs），即保守的微生物组分。10迄今为止，已发现13种具有功能的Toll样受体（TLR），可识别微生物组分，如细菌细胞壁成分、鞭毛蛋白以及微生物核酸10病原体相关分子模式（PAMP）脂多糖（LPS）是革兰氏阴性菌细胞壁的组分，可被TLR4识别，已被证明在个体和分子水平上均可改变昼夜节律。例如， 体内 通过小鼠活动测量脂多糖诱导的类似光相位延迟的挑战11 并导致下丘脑视交叉上核（SCN）和肝脏中的时钟基因表达下降，该结果由以下方法确定 原位 杂交和定量 PCR，分别在大鼠中进行12。在 体内 脂多糖刺激，人外周血白细胞分析13 和皮下脂肪组织14 通过qPCR检测发现多个钟基因的表达发生改变。最后， 离体 LPS对人巨噬细胞和小鼠腹腔巨噬细胞的刺激也导致时钟基因表达的改变，该结果通过qPCR测定。14.

本文描述了一种用于评估病原体相关分子模式（PAMPs）LPS、ODN1826（含有非甲基化CpG基序的合成寡核苷酸）以及热灭活的Listeria monocytogenes（HKLM）对小鼠脾细胞中分子钟基因表达影响的实验方案。这三种PAMPs分别被TLR4、TLR9和TLR2识别。该方案包括小鼠脾脏切除、脾细胞分离与刺激、RNA提取、cDNA合成以及通过qPCR检测多个钟基因的表达水平。本方法可在对动物和细胞进行极少操作的情况下，及时获得大量免疫细胞，并可在体外（ex vivo）用多种PAMPs进行刺激。已有研究表明，分子钟可调控免疫应答的多个方面8,15,16，因此，分子钟的紊乱极有可能损害免疫应答正常的时间依赖性变化。此外，由于昼夜节律的紊乱可导致多种严重病理状态17,18,19,20，研究人员可能有兴趣使用多种分子刺激脾细胞，并评估其对分子钟的影响。

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方案

研究期间，动物的护理和处理遵循美国国立卫生研究院的政策，符合机构指南，并获得了哈特福德大学动物保护与使用委员会的批准。

1. 动物的同步化

注意：本研究使用 20 周龄的雄性 B6129SF2/J 小鼠。

  1. 在实验开始前2周，将小鼠置于12小时光照（标准顶置白光）/12小时黑暗的循环环境中进行节律同步。
    注意：此处昼夜节律时间（ZT）0 对应光照开启，ZT12 对应光照关闭，同时保持所有其他环境因素（即， 食物、水和室温）保持恒定 21.

2. 仪器、培养基和攻毒培养基的准备

  1. 将镊子和解剖剪进行高压灭菌。用铝箔包裹成对的磨砂载玻片，并进行高压灭菌。
  2. 通过向 RPMI 1640 培养基中加入胎牛血清（FBS），配制终浓度为 10% 的培养基。在 50 mL 离心管中，向 10 mL 培养基（含 10% FBS 的 RPMI）中加入以下病原体相关分子模式（PAMPs），配制 10 mL 刺激培养基：脂多糖（LPS，5 µg/mL）、ODN1826（5 µg/mL）、热灭活单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes，108 HKLM/mL），或其它推荐浓度的 PAMP。
  3. 将培养基和刺激培养基在水浴中预热至 37 °C，并在室温下准备约 70 mL 无菌磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.2）。
  4. 使用 10 mL 移液器和移液辅助器，向 50 mL 离心管中加入 10 mL 培养基，并置于冰上。
  5. 向 100 mL 烧杯中加入约 30 mL 70% 乙醇，并将解剖剪和镊子的末端浸入其中，以防止微生物污染。
  6. 在通风橱中，向每 1 mL Buffer RLT（RNA 提取试剂盒组分）中加入 10 µL β-巯基乙醇，配制用于 RNA 提取的裂解缓冲液。仅配制所需量（每样本约 600 µL，对应约 1 × 106 个细胞）。
    注：Buffer RLT 是 RNA 提取试剂盒的组分，可促进 RNA 与硅胶膜的结合。

3. 脾细胞分离与刺激

  1. 在特定的授时因子时间，将小鼠保留在原始笼具中，通过吸入二氧化碳使其麻醉，实施安乐死2 以 3 L/min 的流速向笼中通入 CO2 呼吸停止后持续1分钟。
  2. 通过颈椎脱位确认死亡，将拇指和食指置于颅底颈部两侧。或者，在颅底处按压一根金属棒，同时用另一只手快速牵拉尾根部或后肢，使颈椎与颅骨分离22.
  3. 用70%乙醇喷洒小鼠躯干，并用纸巾擦拭。将小鼠仰卧放置，略微向右侧倾斜。使用解剖剪沿小鼠左侧、前后肢之间约中点处剪除毛发。
  4. 用镊子夹住腹膜，小心切开，避免损伤脾脏。用镊子取出脾脏，放入含有约10 mL培养基的无菌50 mL离心管中，置于冰上。对剩余动物重复此操作。
    ​注意：脾脏呈肾形，较肾脏更长且更扁平。
  5. 将一个脾脏与2 mL培养基转移至小型无菌培养皿中。
    1. 通过将脾脏在两片无菌磨砂载玻片的磨砂面上相互研磨来实现匀浆。若可能，在匀浆过程中保持组织和细胞处于培养基中。
    2. 充分混匀后，将含有脾细胞的2 mL培养基通过40 µm尼龙细胞滤网移入50 mL离心管中。
    3. 对剩余的脾脏重复上述步骤，每次使用新的磨砂载玻片、装有培养基的50 mL离心管以及新的细胞筛。
  6. 向每个含有脾细胞的50 mL离心管中加入8 mL冷培养基，使每管总体积达到10 mL。使用血细胞计数板测定每毫升的细胞数量。
  7. 加入约 1 x 106 将细胞以每孔一定数量接种至6孔培养板中。根据实验所用不同PAMP的数量，向相应数量的孔中加入细胞，并设置一个对照孔。向各孔中分别加入3 mL培养基或3 mL刺激培养基。
  8. 在37 °C、5% CO₂条件下孵育培养板2 3小时。
  9. 使用连接P1000移液器的1,000 µL吸头刮取孔底细胞。用同一支1,000 µL吸头将含有细胞的培养基转移至15 mL离心管中。
  10. 通过离心（167 x g）收集细胞沉淀 g 室温下孵育5分钟。移除上清液，并用5 mL PBS洗涤细胞沉淀。
  11. 再次以167 x g离心收集细胞 g 5分钟，弃上清，向细胞沉淀中加入600 µL裂解缓冲液以裂解细胞，随后进行RNA提取。

4. RNA 提取与 cDNA 合成

  1. 根据试剂盒说明书，使用RNA提取试剂盒从脾细胞中分离RNA，并进行“可选”的柱上DNA消化步骤。
  2. 在进行cDNA合成之前，使用微量分光光度计测定RNA浓度，确认其处于cDNA合成试剂盒推荐的最佳RNA浓度范围内（最高达2 µg）。
  3. 根据反转录试剂盒说明书，对每个样品进行cDNA合成。每个样品使用10 µL RNA，总体积为20 µL。反转录程序完成后（热循环仪运行结束），向每管反应体系中加入20 μL H2O。
  4. 使用P10或P20移液器，将少量对照样品的mRNA混合（例如，从2个样品中各取5 µL，共10 µL），加入0.5 mL离心管中，用于制备标准曲线用cDNA。
    1. 加入10 µL 2×反转录酶预混液。
    2. 反转录反应完成后，向反应管中加入10 µL H2O，作为标准曲线稀释系列的起始浓度（"1"）。
    3. 使用P100或P200移液器，向四个标记为10-1、10-2、10-3和10-4的0.5 mL离心管中各加入45 µL水，进行10倍梯度稀释（1至10-4）。
      1. 使用P20移液器将5 µL起始浓度"1"加入第一管（10-1），通过反复吹打混匀，然后从10-1管中转移5 µL至标记为10-2的管中并混匀。
      2. 使用P20移液器从10-2管中转移5 µL至标记为10-3的管中并混匀；再使用P20移液器从10-3管中转移5 µL至标记为10-4的管中并混匀。

5. 定量聚合酶链式反应（qPCR）

  1. 通过qPCR测定mRNA水平的相对定量。在实验设计中选择 "定量分析 - 相对标准曲线" 和 "TaqMan" 化学。将反应体积更改为 10 µL。将相关信息输入到孔板布局中（例如，目的基因，标准曲线，报告基因， 等等。).
  2. 配制反应体系，使其包含 0.5 µL 引物/探针试剂、5 µL 基因表达预混液、2 µL H2O 和 2.5 µL cDNA（10–100 ng）。
    1. 通过将前述每种试剂（cDNA除外）乘以反应总数来配制主混合液，反应总数需包括标准曲线、阴性对照的反应数，每个反应设两个复孔，并额外增加2个反应以弥补移液误差。
    2. 将7.5 µL配制好的主混合液用单通道或多人道移液器加入96孔反应板中预先确定的各孔中。向对应孔中加入2.5 µL cDNA用于未知样本和标准品，另加入2.5 µL H2O 加入阴性对照孔中。
    3. 包括多种分子钟基因的引物/探针检测，以及内源性对照的检测例如，β-actin).
  3. 为了确定相对表达量，先计算每个重复样本的平均相对数量，然后对于每个样本，将目的基因的平均相对数量除以参照基因的平均相对数量 β-actin.

6. 统计分析

  1. 使用统计分析软件，在程序的“列统计”选项下输入数据。选择单因素方差分析（one-way ANOVA）并采用Dunnett's事后检验，以评估PAMP刺激后钟基因表达均值与对照组之间的差异。

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结果

小鼠在ZT13时点被处死，分离脾细胞并进行刺激处理 离体 使用PAMPs LPS、ODN1826或HKLM处理。3小时后提取RNA，并通过qPCR检测分子钟基因的相对表达水平 时钟, Per2, Dbp, 和 Rev-erbα 与未受刺激的对照细胞相比。在PAMP刺激后， 时钟 表达水平与对照细胞中的表达水平相比无显著差异（图1A). Per2 与未受刺激的对照组相比，经LPS和ODN1826刺激后，细胞中的表达水平显著升高（图1B）。LPS 是唯一能够改变 Rev-erbα 表达，因为mRNA水平显著低于未受刺激的对照组（图1C最后...

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讨论

在本实验方案中，可使用微量分光光度计对用于基因表达分析的RNA进行定量并评估其纯度。核酸在260 nm处吸收紫外光，蛋白质通常在280 nm处吸收光，而在RNA提取过程中可能残留的其他污染物（例如苯酚）则可在230 nm处被检测到。因此，通过测定260/280 nm（RNA与蛋白质之比）和260/230 nm（RNA与非蛋白质污染物之比）的吸光度（A）比值，可评估RNA的质量。高质量的RNA其A260/280比值应在1.8–2.1之间，较低的比值提示存在蛋白质污染。纯的RNA样品其A260/230比值应为2.0。

在确定目的基因的相对表达水平时（即 Per2、Clock、Rev-erbα， 和 Dbp），还必须选择一个内参基因（即在不同样本间表达水平无显著差异的基因）。随后，目标基因的相对表达量将根据内参基因的表达水平进行标准化。起始材料的差异（如脾细胞数量不同）、逆转录酶效率的差异以及RNA降解速率的不同， 等等。，将通过内源性对照基因进行校正（β-actin 在此方案中）。然而，应验证所研...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作获得了哈特福德大学文理学院院长办公室教员研究资助的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
磨砂载玻片Fisher12-550-343
细胞筛Fisher22363547
Lipopolysaccharide InvivoGenltrl-eklps
ODN1826InvivoGenTlrl-1826-1
HKLMInvivoGenTlrl-hklm
RPMI 1640Gibco11875-093
PBSGibco20012-043
RNeasy Mini KitQiagen74104 或 74106
无RNase的DNase试剂盒Qiagen79254
6孔细胞培养板DenvilleT1006
50 mL 离心管Corning352070
15 mL 离心管Corning352097
高容量cDNA反转录试剂盒ThermoFisher4368814
TaqMan基因表达检测 b-actinThermoFisherMm00607939_s1
TaqMan基因表达检测 Per2ThermoFisherMm00478113_m1
TaqMan基因表达检测 Rev-erbaThermoFisherMm00520708_m1
TaqMan基因表达检测 Bmal1ThermoFisherMm00500226_m1
TaqMan基因表达检测 DbpThermoFisherMm00497539_m1
qPCR仪 StepOnePlusThermoFisher
TaqMan基因表达主混合液ThermoFisher4369016
MicroAmp快速96孔反应板（0.1 mL）ThermoFisher4346907
统计分析软件Prism 7.0a

参考文献

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PAMP PCR RNA LPS ODN1826

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