Xenopus 蝌蚪为在活体条件下研究神经系统功能提供了一个独特的平台。我们描述了在正常饲养条件或损伤后，评估活体 Xenopus 幼虫嗅觉信息处理的方法学。
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摘要
摘要
Xenopus 蝌蚪为研究神经系统功能提供了独特的平台。它们具有多种实验优势，例如可采用多种成像方法、电生理技术以及行为学检测手段。Xenopus 蝌蚪的嗅觉系统特别适用于研究在正常发育过程中建立或在损伤后重新形成的突触功能。本文描述了在活体 Xenopus 幼体中评估嗅觉信息处理的方法。我们概述了结合体内检测嗅球小球中突触前钙反应与基于嗅觉引导的行为学实验的联合方法。这些方法可与嗅神经切断相结合，以研究突触连接的重新布线。实验采用野生型及在中枢神经系统细胞中表达 GFP 报告基因的遗传修饰动物。将所述方法应用于遗传修饰的蝌蚪，有助于揭示决定脊椎动物行为的分子基础。
引言
Xenopus 蝌蚪是研究神经系统正常功能的优良动物模型。其透明的身体、完全测序的基因组1,2，以及适用于手术操作、电生理和成像技术的特点，是Xenopus 幼体所独有的特性，使其能够在活体条件下研究神经元功能3。该动物模型的多种实验可能性已在蝌蚪感觉系统和运动系统的深入研究中得到充分体现4,5,6。其中，Xenopus 蝌蚪的嗅觉系统是研究突触水平信息处理多个方面的尤为合适的神经回路7。首先，其突触连接结构明确：嗅觉感受神经元（ORNs）投射至嗅球，并在嗅小球内与僧帽细胞/簇状细胞的树突形成突触连接，从而生成气味图谱。其次，ORNs 在整个生命周期中通过神经发生持续产生，以维持嗅觉通路的功能完整性8。第三，由于嗅觉系统具有很强的再生能力，Xenopus 蝌蚪在嗅球被损毁后能够完全重建其嗅球结构9。
本文介绍了将活体蝌蚪嗅觉小球成像与行为学实验相结合的方法，用于研究嗅觉通路的功能。此处详述的技术方法被用于研究嗅神经切断后嗅球内小球连接功能的恢复过程10。在非洲爪蟾（Xenopus）蝌蚪中获得的数据具有代表性，能够反映脊椎动物的普遍情况，因为嗅觉处理机制在进化上是保守的。
所述方法以X. tropicalis为例进行说明，但同样可轻松应用于X. laevis。尽管成年X. laevis体型较大，但这两个物种在蝌蚪阶段表现出显著的相似性。主要差异存在于基因组水平。X. laevis的遗传操作难度较高，主要因其异源四倍体基因组及较长的世代周期（约1年）。相比之下，X. tropicalis由于具有较短的世代周期（5–8个月）和二倍体基因组，更易于进行遗传修饰。本文图示的代表性实验包括野生型动物以及三种不同的转基因品系：Hb9:GFP（X. tropicalis）、NBT:GFP（X. tropicalis）和tubb2:GFP（X. laevis）。
当前研究所概述的方法学应与遗传学领域的进展一并予以考虑 非洲爪蟾 领域。所介绍的技术简单且易于实施，特别适用于评估已描述的突变体11以及 非洲爪蟾 由CRISPR-Cas9技术生成的细胞系12我们还描述了一种用于横断嗅神经的手术操作，该方法可在任何具备相应条件的实验室中实施 非洲爪蟾 蝌蚪。用于评估突触前钙反应和嗅觉引导行为的方法需要特定设备，尽管这些设备成本适中。本研究以简明形式呈现相关方法，以促进其在科研团队中的应用，并可通过改进或与其他技术联用，为建立更复杂的检测方法奠定基础。, 组织学或遗传学方法。
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方案
所有实验程序均经巴塞罗那大学动物研究伦理委员会批准。
注意： X. tropicalis 和 X. laevis 蝌蚪按照标准方法进行培育13,14蝌蚪水通过添加商用盐制备（参见 材料表) 加入反渗透水。将电导率调节至约 ∼700 µS 和 ∼1,400 µS 用于 X. tropicalis 和 X. laevis 蝌蚪。幼虫可通过自然交配或体外受精获得14胚胎用2% L-半胱氨酸（溶于0.1×Marc's改良Ringer液，MMR）脱胶。1×MMR的成分（单位：mM）为：100 NaCl，2 KCl，1 MgSO₄4，2 CaCl2，5 HEPES，0.1 EDTA，pH 7.8。孵化后2–3天（阶段25）将幼虫转移至含蝌蚪培养水的2 L水族箱中。当蝌蚪达到纽科普-法伯（Nieuwkoop-Faber，NF）分期标准的阶段40时15，它们被放置在5 L的水箱中，以每升10只动物的密度进行饲养。温度保持在23–25 °C 和18–20 °C 用于 X. tropicalis 和 X. laevis 分别处于NF标准48–52期的动物用于实验。
1. 嗅神经横断术
- 在室温下，用 50 mL 蝌蚪养殖水配制含 0.02% MS-222 的麻醉溶液。
- 准备一个小型水箱（1–2 L），装入蝌蚪养殖水，用于手术后动物的恢复。
- 裁剪长方形的定性纤维素滤纸片（4 cm × 3 cm，参见材料表）。
- 将两片定性纤维素滤纸浸入 0.02% MS-222 溶液中润湿，并置于解剖显微镜下备用。
- 从水箱中取出一只蝌蚪，浸入麻醉溶液中。动物通常在 2–4 分钟内停止游动，且对使用镊子施加于尾部的机械刺激无反应。
- 将麻醉后的蝌蚪放置在长方形滤纸片上，使其背侧朝上，以便观察脑部结构。
- 使用Vannas剪刀（参见材料表）切断一侧或双侧嗅神经（根据所进行实验的类型决定）。对于需要神经损伤内部对照的实验，仅切断单侧神经。
- 对于行为学实验，应切断双侧嗅神经，以阻断所有传入嗅球的气味信息。嗅神经切断的效果可在解剖显微镜下直接观察；然而，色素沉着或动物体位可能成为观察的限制因素。
注意：（可选）验证手术有效性的最佳方法是使用在其神经系统中表达荧光报告基因的转基因蝌蚪（参见代表性结果）。为此，需使用配备荧光模块的解剖显微镜（图1）。若仅有野生型动物可用，可采用CM-diI示踪法。参照方案2（见下文），将用0.3 M蔗糖配制的0.5 mg/mL CM-diI溶液注入鼻囊。有关CM-diI的配制与保存细节，参见文献16。必须尽量减少染料从主腔泄漏。为此，需调整注射压力和微玻璃针的开口大小。注射CM-diI后约24小时，可在嗅球的肾小球层观察到明显荧光。本研究中CM-diI标记仅用于验证神经切断操作的有效性；但该方法也可结合常规组织学技术，用于获取嗅觉肾小球的形态学信息。
- 将动物转移至恢复水箱。蝌蚪通常在约10分钟内恢复正常的游泳活动。需仔细检查是否存在出血现象，手术动物中约有1%会出现此类情况。
- 使用0.2% MS-222溶液对受伤动物实施安乐死。
2. 使用荧光钙指示剂标记嗅觉感受神经元
- 配制含有12% 钙绿-1-葡聚糖（见材料表）、0.1% Triton X-100 和 1 mM NaCl17 的溶液。若一个月内不使用，将溶液储存于 -20 °C 或 -80 °C。
- 使用微量移液器拉制仪（见材料表）制备尖端开口约为 1–2 µm 的玻璃移液管（直径类似于用于膜片钳实验的微电极），用于显微注射。
- 校准显微注射体积。使用蒸馏水调节压力和注射时间，以获得 0.15–0.3 µL 的注射体积。
注意：一种简单的校准方法是计数充满 1 µL 水的移液管完全排空所需的脉冲次数。典型参数为 30 psi 压力和 50 ms 注射时间。 - 将移液管插入显微注射仪，并加载约 2 µL 的钙绿-1-葡聚糖溶液。
- 按照步骤 1.1 至 1.6 准备一只蝌蚪。
- 将移液管尖端插入鼻囊的主要腔室中。
注意：参见图 2A，该图描述了非洲爪蟾蝌蚪嗅觉通路的位置。 - 使用步骤 2.3 中确定的参数，进行数次注射。确保染料仅存在于鼻囊内。
- 让蝌蚪静置 2–3 分钟。使用巴斯德移液管，向动物较尾部的区域滴加 0.02% MS-222 溶液，以防干燥。
- 将动物转移至恢复缸中。
注意：其应在约 10 分钟内恢复正常的游泳行为。操作动物可能造成损伤。 - 对于注射后 15 分钟仍未恢复正常游泳行为的蝌蚪，使用 0.2% MS-222 溶液实施安乐死。
- 在注射后的第二天观察嗅球小球层水平的荧光信号。
3. 准备用于突触前反应活体成像的蝌蚪
- 实验前24–48小时，用硅胶弹性体（例如Sylgard）包被4–6个直径为35 mm的培养皿。待弹性体聚合后，制作一个适合蝌蚪的矩形孔腔。
注意： 典型尺寸为 X. tropicalis 处于NF 48–52期的蝌蚪大小为10 mm × 4 mm。 - 配制100 mL的 160 µM 至1 mM氨基酸溶液，用作蝌蚪的气味刺激物。该溶液可包含多种氨基酸的混合物：甲硫氨酸、亮氨酸、组氨酸、精氨酸和赖氨酸。将氨基酸稀释于 非洲爪蟾 林格氏液，成分（单位：mM）：100 NaCl，2 KCl，1 CaCl2，2 MgCl2，10 葡萄糖，10 HEPES，240 mOsm/kg，pH 7.8。确保 pH 维持在 7.8。
- 将20 mL氨基酸溶液加入一个较高的储液槽中。用聚乙烯管将储液槽连接至一支28 G毛细管（参见 材料表位于鼻囊上方。
注意： 毛细管安装在显微操作器上（参见 材料表)。灌流系统中不得存在气泡。 - 使用电磁阀夹管阀的晶体管-晶体管逻辑（TTL）控制，实现氨基酸溶液施加的时间精确性（参见 材料表）。使用刺激器产生TTL脉冲（参见 材料表）。通过改变TTL脉冲的持续时间来检查递送气味溶液的时间精度，即., 0.1 到 1 秒。
- 用100 mL的溶液填充另一个高置储液槽 非洲爪蟾 林格氏液
- 麻醉一只蝌蚪，并将其置于解剖显微镜下（步骤 1.1 至 1.6）。
- 准备蝌蚪用于成像。如果有白化蝌蚪，可直接进行步骤3.9；否则，需去除嗅球上方的皮肤，因为该处皮肤含有影响成像的黑色素细胞（步骤3.8）。
注意： 根据动物的色素沉着情况，实验有两种操作方法。建议使用白化动物。白化品系可从以下获得： X. laevis 和白化 X. tropicalis 近期已通过 CRISPR-Cas9 技术构建出相关细胞系 12 或 TALENs18. - 使用Vannas剪刀在蝌蚪中枢神经系统边缘的皮肤上做一侧向切口。切口位置应在嗅球水平，且绝不可达到视顶盖的位置，后者可通过视神经的位置轻松识别。
- 用镊子夹住切开的皮肤并将其拉过神经系统。通过观察嗅球上方无黑色素细胞来确认去除成功。使用巴斯德移液管滴加0.02% MS-222溶液以保持动物湿润。
- 将蝌蚪放入包被培养皿的孔中（参见 材料表). 在动物上方放置一片涂有高真空润滑脂的玻璃盖玻片。将盖玻片定位，使其覆盖从视顶盖顶部至尾部末端的区域。
- 确保嗅球和嗅板持续暴露于细胞外培养基中。成像过程中保持蝌蚪静止不动。用培养基填充培养皿 非洲爪蟾 含林格氏液 100 µM 筒箭毒碱（参见 材料表以防止肌肉收缩。
注意： 筒箭毒碱以等分试样储存于 -80 °C 不超过6个月。 - 将盛有蝌蚪的培养皿置于直立显微镜下。连接含有储液器的 非洲爪蟾 使用聚乙烯管将任氏液与培养皿连接（参见 材料表用于持续灌注 非洲爪蟾 林格氏液，用于维持动物生命 >1 h。
注意： 微型磁力夹具（参见 材料表) 对于将管路稳定连接到培养皿非常有用。灌流和吸液管必须位于约 ~180° 角度。 - 开始灌注 非洲爪蟾 林格氏液。实验过程中始终保持培养皿中液面高度恒定。通过观察血管中的血流情况，持续评估蝌蚪的存活状态。
4. 嗅觉小球中突触前Ca2+ 变化的活体成像
注意：成像步骤以宽场显微镜为例进行描述，但通过调整采集参数，可轻松适用于共聚焦显微镜。成像应在安装于防震台上的正置显微镜上进行。
- 使用低倍物镜（例如 5x）观察蝌蚪。
- 移动显微操作仪的轴，将输送气味溶液的毛细管置于其中一个鼻囊的顶部，形成 90° 与嗅神经成一定角度。应避免嗅球上方有气味溶液流动，因为这可能引起湍流，从而干扰成像。
- 使用高倍率、长工作距离、水浸式物镜（60X，0.9 数值孔径），在鼻囊同侧（受刺激侧）定位嗅球。
- 通过肉眼观察荧光发射情况。肾小球结构应清晰可见（图2B).
- 使用适用于钙成像的相机进行活体图像采集。定义一个包含整个嗅球的区域，通常为 256 × 256 或 512 × 512 像素。将采集帧率设置为 20–40 Hz。调节增益，使基础荧光强度约为饱和值的 20%。采集一段持续 5 秒的视频。
- 观察视频，检查图像的聚焦情况、是否存在运动伪影以及是否有像素饱和的区域。若使用16位相机，肾小球区域的典型荧光值应在5,000–20,000 a.u.范围内。若成像条件理想，则进入下一步。如需改善图像质量或调整增益设置，可重复步骤4.6。
- 启动延时成像以记录嗅觉刺激诱发的反应。
注意： 通过TTL刺激精确控制气味溶液的施加。典型的实验包含4秒的基线期，随后是0.1至0.5秒的刺激时间，以及6–10秒的恢复期。 - 重复施加气味物质刺激的时间间隔 >2 分钟。将流速设置为 1–1.5 mL·min⁻¹。-1由于在整个实验过程中全局灌注持续进行，局部施加的氨基酸会被冲洗掉。
注意： 培养皿中溶液的体积约为 3 mL。 - 图像分析
- 反应检测
- 将视频导出至 ImageJ。
注意： 目标是检测对刺激产生反应的肾小球区域的存在。 - 将荧光图像的原始序列转换为 ΔF/F0 视频。根据以下关系式测量基础荧光的相对变化：(F-F₀)/F₀0)/F0，其中 F0 表示基础荧光水平。
- 在刺激期间显示假定荧光增强的区域周围绘制感兴趣区域（ROI），并在ROI管理器中记录其位置图2E). 绘制一个ROI，用于检测无肾小球结构区域的背景荧光水平。
- 将视频导出至 ImageJ。
- 反应的定量分析。
- 将定义的感兴趣区域（ROIs）放置在荧光图像的原始序列中。获取每帧图像中所选感兴趣区域的平均灰度值。将获得的数值序列导入分析软件（例如., Igor Pro
- 扣除背景荧光，然后计算 ΔF/F0 每个ROI的变化（图 2F）。绘制 ΔF/F 的增加曲线0 针对每个选定的 ROI，计算基础 ΔF/F 的标准差0 （刺激前）
注意： 若ΔF/F升高，则视为阳性反应0 在刺激期间获得的数值大于基础值的2个标准差。
- 反应检测
5. 嗅觉引导行为实验
注意： 执行该检测的装置示意图见图3。
- 在6孔板每个孔的上部制作小孔，以适配外径1.57 mm、内径1.14 mm的导管。插入导管后使用环氧树脂胶粘剂密封（参见 材料表).
注意： 经蒸馏水彻底清洗后，该改良培养皿可多次重复使用。 - 配制50 mL含有甲硫氨酸、亮氨酸、组氨酸、精氨酸和赖氨酸的氨基酸溶液（详见步骤3.2）。浓度范围可为 160 µM 至1 mM。将20 mL该溶液置于高位储液罐中。
- 在检测前至少12小时内不要喂食蝌蚪。从饲养箱中取出6只蝌蚪，放入2 L清洁的蝌蚪养殖水中，以尽量减少其对气味物质的暴露。
- 将改造后的6孔板置于白色LED透射仪上（图3).
- 使用歧管将灌注入口连接至含有氨基酸溶液的储液器（参见 材料表）。检查灌流系统并排除气泡。同时灌注6个孔。调节储液槽高度，使在约30秒内输送≥5 mL的气味溶液。
注意： 每次暴露于气味溶液后，用双蒸水洗涤每个孔4次。 - 每孔加入 10 mL 蝌蚪培养水，每孔放入 1 只蝌蚪。静置培养 >3 分钟
- 设置图像采集。使用能够以 ≥5 Hz 采集图像的传统 CCD 相机。将相机连接至计算机。此处使用由 Zen 软件控制的 Zeiss MRC5 相机，但也可采用其他等效配置。若需提高帧率，可应用像素合并（pixel binning）。图像应包含整个 6 孔板。
- 开始图像采集，使录像包含基础期（30 s）、刺激期（25–35 s）和恢复期（30–60 s）。
- 成像后将六孔板中的动物放回养殖缸中。
- 使用 ImageJ 中的插件（如 wrMTrck）分析视频19,20 提供与运动性相关的多个参数。
- 为进行图像分析，首先通过绘制一个 35 mm × 35 mm 的矩形 ROI 来选择一个孔图4A). 通过计算整个序列的最大投影获得背景图像，该图像应显示不含蝌蚪的孔位。
- 从原始视频中减去最大投影。对生成的32位视频进行阈值处理，并应用wrMTrck插件。调整WrMTrck参数以可靠追踪动物运动。将获得的X、Y坐标导入分析程序。
- 使用 X-Y 坐标，通过应用以下公式计算到气味源（孔板中的灌注入口）的欧几里得距离：
其中 os 表示气味源的位置，tad 表示蝌蚪在某一时刻的位置。参见 图4A 详情请见。
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结果
在本文中，我们提出了一种结合两种互补方法的方案，用于执行 体内 功能研究 非洲爪蟾 蝌蚪嗅觉系统：i) 一种成像突触前Ca2+ 使用荧光钙指示剂观察活体蝌蚪肾小球中的变化，以及(ii)一种基于气味引导的行为检测方法，可用于研究对特定水溶性气味物质的反应。由于这些方法已被用于评估损伤后嗅觉处理功能的恢复情况10还描述了一种横断嗅神经的简单方法。
切断嗅觉通路在 非洲爪蟾 蝌蚪
验证该程序有效性的方法有两种，均依赖于使用荧光报告分子对嗅觉神经进行可视化观察。其中一种方法基于在其神经系统中表达荧光蛋白的转基因蝌蚪。推荐使用两种在神经元β-微管蛋白启动子驱动下表达GFP的品系 X. laevis tubb2b-G...
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讨论
本文介绍了一些可用于研究活体Xenopus蝌蚪嗅觉通路功能的技术。当前的实验方案特别适用于从事或能够获取Xenopus的研究实验室；然而，对于研究神经元再生与修复的细胞和分子基础的研究人员而言，该方法同样具有重要意义。在Xenopus中获得的研究结果可与其他脊椎动物模型中收集的数据相结合，以鉴定保守的机制。所描述的方法将受益于基因编辑Xenopus18,22,23的发展，并可应用于蝌蚪神经系统疾病实验模型的研究24,25。
为了获得可重复的体内实验数据，正确饲养Xenopus蝌蚪至关重要。特别是X. tropicalis对不良饲养条件极为敏感。例如，它们不能耐受低于20 °C...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作获得了西班牙经济与竞争力部（MINECO；项目编号：SAF2015-63568-R）的资助，该资助由欧洲区域发展基金（ERDF）共同资助。同时获得来自 M. G. F. Fuortes 纪念奖学金、Stephen W. Kuffler 奖学金基金、Laura 和 Arthur Colwin 资助暑期研究奖学金基金、Fischbach 奖学金以及海洋生物学实验室和国家 Xenopus 资源中心 RRID:SCR_013731（马萨诸塞州伍兹霍尔）的大时代基金的支持，部分研究工作在上述机构完成。我们还感谢 CERCA 项目/加泰罗尼亚自治区政府提供的机构支持。A.L. 是 Serra Húnter 项目研究员。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 水族箱用盐（Instant Ocean Salt） | Tecniplast | XPSIO25R | |
| 三卡因（Tricaine，Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate） | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| #5 镊子（尖端尺寸 0.025 × 0.005 mm） | World Precision Instruments | 501985 | |
| Vannas 剪刀（尖端尺寸 0.015 × 0.015 mm） | World Precision Instruments | 501778 | |
| Whatman 定性滤纸 | Fisher Scientific | WH3030917 | |
| X. laevis tubb2-GFP | 国家爪蟾资源中心（National Xenopus Resource, NXR），RRID:SCR_013731 | NXR_0.0035 | |
| X. tropicalis NBT-GFP | 欧洲爪蟾资源中心（European Xenopus Resource Center, EXRC），RRID:SCR_007164 | ||
| CellTracker CM-DiI | ThermoFisher Scientific | C-7001 | |
| 钙绿荧光素葡聚糖钾盐，分子量 10,000，阴离子型 | ThermoFisher Scientific | C-3713 | |
| 显微注射用硼硅酸盐毛细管 | Sutter Instrument | B100-75-10 | 外径=1.0 mm，内径=0.75 mm |
| 拉针仪 | Sutter Instrument | P-97 | |
| 显微注射仪 | Parker Instruments | Picospritzer III | |
| Sylgard-184 | Sigma-Aldrich | 761028-5EA | |
| Microfil 微量移液管 | World Precision Instruments | MF28G-5 | |
| 正置显微镜 | Zeiss | AxioImager-A1 | |
| Master-8 刺激器 | A.M.P.I. | ||
| CCD 相机 | Hamamatsu | Image EM | |
| 电磁阀 | Warner Instruments | VC-6 六通道系统 | |
| 道康宁高真空润滑脂 | VWR Scientific | 636082B | |
| 氯化筒箭毒碱（Tubocurarine hydrochloride） | Sigma-Aldrich | T2379 | |
| CCD 相机 | Zeiss | MRC-5 相机 | 由 Zen 软件控制 |
| 相机镜头 | Thorlabs | MVL8ML3 | 有多种可选型号，应根据所用相机型号进行适配 |
| 环氧树脂 | RS Components | ||
| 灌流多通管 | Warner Instruments | MP-6 灌流多通管 | |
| 用于局部递送溶液的显微操作器 | Narishige | MN-153 | |
| 微型磁性夹具 | Warner Instruments | MAG-7, MAG-6 | |
| 聚乙烯管 | Warner Instruments | 64-0755 | 外径=1.57 mm，内径=1.14 mm |
参考文献
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