Xenopus 蝌蚪为在活体条件下研究神经系统功能提供了一个独特的平台。我们描述了在正常饲养条件或损伤后，评估活体 Xenopus 幼虫嗅觉信息处理的方法学。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
Xenopus 蝌蚪为研究神经系统功能提供了独特的平台。它们具有多种实验优势，例如可采用多种成像方法、电生理技术以及行为学检测手段。Xenopus 蝌蚪的嗅觉系统特别适用于研究在正常发育过程中建立或在损伤后重新形成的突触功能。本文描述了在活体 Xenopus 幼体中评估嗅觉信息处理的方法。我们概述了结合体内检测嗅球小球中突触前钙反应与基于嗅觉引导的行为学实验的联合方法。这些方法可与嗅神经切断相结合，以研究突触连接的重新布线。实验采用野生型及在中枢神经系统细胞中表达 GFP 报告基因的遗传修饰动物。将所述方法应用于遗传修饰的蝌蚪，有助于揭示决定脊椎动物行为的分子基础。
引言
Xenopus 蝌蚪是研究神经系统正常功能的优良动物模型。其透明的身体、完全测序的基因组1,2，以及适用于手术操作、电生理和成像技术的特点，是Xenopus 幼体所独有的特性，使其能够在活体条件下研究神经元功能3。该动物模型的多种实验可能性已在蝌蚪感觉系统和运动系统的深入研究中得到充分体现4,5,6。其中，Xenopus 蝌蚪的嗅觉系统是研究突触水平信息处理多个方面的尤为合适的神经回路7。首先，其突触连接结构明确：嗅觉感受神经元（ORNs）投射至嗅球，并在嗅小球内与僧帽细胞/簇状细胞的树突形成突触连接，从而生成气味图谱。其次，ORNs 在整个生命周期中通过神经发生持续产生，以维持嗅觉通路的功能完整性8。第三，由于嗅觉系统具有很强的再生能力，Xenopus 蝌蚪在嗅球被损毁后能够完全重建其嗅球结构9。
本文介绍了将活体....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
所有实验程序均经巴塞罗那大学动物研究伦理委员会批准。
注意： X. tropicalis 和 X. laevis 蝌蚪按照标准方法进行培育13,14蝌蚪水通过添加商用盐制备（参见 材料表) 加入反渗透水。将电导率调节至约 ∼700 µS 和 ∼1,400 µS 用于 X. tropicalis 和 X. laevis 蝌蚪。幼虫可通过自然交配或体外受精获得14胚胎用2% L-半胱氨酸（溶于0.1×Marc's改良Ringer液，MMR）脱胶。1×MMR的成分（单位：mM）为：100 NaCl，2 KCl，1 MgSO₄4，2 CaCl2，5 HEPES，0.1 EDTA，pH 7.8。孵化后2–3天（阶段25）将幼虫转移至含蝌蚪培养水的2 L水族箱中。当蝌蚪达到纽科普-法伯（Nieuwkoop-Faber，NF）分期标准的阶段40时15，它们被放置在5 L的水箱中，以每升10只动物的密度进行饲养。温度保持在23–25 °C 和18–20 °C 用于 X. tropicalis<....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
在本文中，我们提出了一种结合两种互补方法的方案，用于执行 体内 功能研究 非洲爪蟾 蝌蚪嗅觉系统：i) 一种成像突触前Ca2+ 使用荧光钙指示剂观察活体蝌蚪肾小球中的变化，以及(ii)一种基于气味引导的行为检测方法，可用于研究对特定水溶性气味物质的反应。由于这些方法已被用于评估损伤后嗅觉处理功能的恢复情况10还描述了一种横断嗅神经的简单方法。
切断嗅觉通路在 非洲爪蟾 蝌蚪
验证该程序有效性的方法有两种，均依赖于使用荧光报告分子对嗅觉神经进行可视化观察。其中一种方法基于在其神经系统中表达荧光蛋白的转基因蝌蚪。推荐使用两种在神经元β-微管蛋白启动子驱动下表达GFP的品系 X. laevis tubb2b-G.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
本文介绍了一些可用于研究活体Xenopus蝌蚪嗅觉通路功能的技术。当前的实验方案特别适用于从事或能够获取Xenopus的研究实验室；然而，对于研究神经元再生与修复的细胞和分子基础的研究人员而言，该方法同样具有重要意义。在Xenopus中获得的研究结果可与其他脊椎动物模型中收集的数据相结合，以鉴定保守的机制。所描述的方法将受益于基因编辑Xenopus18,22,23的发展，并可应用于蝌蚪神经系统疾病实验模型的研究24,25。
为了获得可重复的体内实验数据，正确饲养Xenopus蝌蚪至关重要。特别是X. tropicalis对不良饲养条件极为敏感。例如，它们不能耐受低于20 °C.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作获得了西班牙经济与竞争力部（MINECO；项目编号：SAF2015-63568-R）的资助，该资助由欧洲区域发展基金（ERDF）共同资助。同时获得来自 M. G. F. Fuortes 纪念奖学金、Stephen W. Kuffler 奖学金基金、Laura 和 Arthur Colwin 资助暑期研究奖学金基金、Fischbach 奖学金以及海洋生物学实验室和国家 Xenopus 资源中心 RRID:SCR_013731（马萨诸塞州伍兹霍尔）的大时代基金的支持，部分研究工作在上述机构完成。我们还感谢 CERCA 项目/加泰罗尼亚自治区政府提供的机构支持。A.L. 是 Serra Húnter 项目研究员。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 水族箱用盐（Instant Ocean Salt） | Tecniplast | XPSIO25R | |
| 三卡因（Tricaine，Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate） | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| #5 镊子（尖端尺寸 0.025 × 0.005 mm） | World Precision Instruments | 501985 | |
| Vannas 剪刀（尖端尺寸 0.015 × 0.015 mm） | World Precision Instruments | 501778 | |
| Whatman 定性滤纸 | Fisher Scientific | WH3030917 | |
| X. laevis tubb2-GFP | 国家爪蟾资源中心（National Xenopus Resource, NXR），RRID:SCR_013731 | NXR_0.0035 | |
| X. tropicalis NBT-GFP | 欧洲爪蟾资源中心（European Xenopus Resource Center, EXRC），RRID:SCR_007164 | ||
| CellTracker CM-DiI | ThermoFisher Scientific | C-7001 | |
| 钙绿荧光素葡聚糖钾盐，分子量 10,000，阴离子型 | ThermoFisher Scientific | C-3713 | |
| 显微注射用硼硅酸盐毛细管 | Sutter Instrument | B100-75-10 | 外径=1.0 mm，内径=0.75 mm |
| 拉针仪 | Sutter Instrument | P-97 | |
| 显微注射仪 | Parker Instruments | Picospritzer III | |
| Sylgard-184 | Sigma-Aldrich | 761028-5EA | |
| Microfil 微量移液管 | World Precision Instruments | MF28G-5 | |
| 正置显微镜 | Zeiss | AxioImager-A1 | |
| Master-8 刺激器 | A.M.P.I. | ||
| CCD 相机 | Hamamatsu | Image EM | |
| 电磁阀 | Warner Instruments | VC-6 六通道系统 | |
| 道康宁高真空润滑脂 | VWR Scientific | 636082B | |
| 氯化筒箭毒碱（Tubocurarine hydrochloride） | Sigma-Aldrich | T2379 | |
| CCD 相机 | Zeiss | MRC-5 相机 | 由 Zen 软件控制 |
| 相机镜头 | Thorlabs | MVL8ML3 | 有多种可选型号，应根据所用相机型号进行适配 |
| 环氧树脂 | RS Components | ||
| 灌流多通管 | Warner Instruments | MP-6 灌流多通管 | |
| 用于局部递送溶液的显微操作器 | Narishige | MN-153 | |
| 微型磁性夹具 | Warner Instruments | MAG-7, MAG-6 | |
| 聚乙烯管 | Warner Instruments | 64-0755 | 外径=1.57 mm，内径=1.14 mm |
参考文献
- Hellsten, U., et al. The genome of the Western clawed frog Xenopus tropicalis. Science. 328 (5978), 633-636 (2010).
- Session, A. M., et al. Genome evolution in the allotetraploid frog Xenopus laevis. Nature. 538 (7625), 336-343 (2016).
- Zhang, L. I., Tao, H. ....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
