一种新的 离体 评估内镜下黏膜下注射材料性能的模型

摘要

我们开发了一种新的 离体 一种对猪胃标本施加恒定张力的模型。该进展使得能够准确评估不同黏膜下注射液（SIMs）的性能（即黏膜下隆起的高度和持续时间）。  该新模型的详细设置方法已作说明。

摘要

提高黏膜下注射材料（SIMs）的性能对于早期胃肠道肿瘤的内镜治疗至关重要。为了研发高性能的SIMs，建立一种能够准确评估SIM性能的ex vivo模型十分必要。在我们之前的研究中，开发了一种新型的ex vivo模型，通过在标本两端施加恒定张力，可对多种SIMs的性能进行详细评估。我们还证实，该新型ex vivo模型能够在统一条件下准确测量黏膜下隆起高度（SEH），并实现不同类型SIMs性能的细致比较。本文将介绍这一新型ex vivo模型，并详细说明该模型的构建方法。由于新模型的各个部件均易于获取，模型的搭建可快速完成。利用该新模型可更准确地测量多种SIMs的SEH。此外，该模型可用于识别决定SIM性能的关键因素，一旦该因素被明确，SIM的研发速度将显著提升。

引言

目前，内镜黏膜下剥离术（ESD）和内镜黏膜切除术（EMR）均为早期胃肠道癌症的常用治疗方法^1,2。将黏膜下注射材料（SIM）注入黏膜下层，是EMR和ESD操作中最关键的步骤之一^2,3。实现充分的黏膜下抬举并维持其抬举状态，是安全实施EMR/ESD的重要标准。

尽管生理盐水（NS）自内镜治疗发明以来一直被用作黏膜下注射液（SIM）^4,5，近年来透明质酸钠（HA）被引入作为治疗用药^6,7。由于其优异的性能，HA 已在内镜治疗中被广泛用作更优的黏膜下注射液（SIM）^8,9,10,11。目前，已有研究对现有的多种黏膜下注射液（SIM）进行了性能比较，并致力于开发高性能的黏膜下注射液以寻找另一种更优的选择^{5,12,13,14,15,16,17,18}。

使用猪胃标本的ex vivo模型已被用于评估SIM性能，因为在人体胃肠道中准确评估SIM性能非常困难^19,20,21,22。然而，这种传统的ex vivo模型极为简单，仍有改进空间。构建更接近人体胃肠道黏膜的环境，将有助于对SIM性能进行更准确的评估。

在我们之前的研究中，我们开发了一种新的离体（ex vivo）模型，可通过在样本两端施加恒定张力，详细评估各种脊髓电刺激电极（SIM）的性能。我们还证实，所提出的新型离体（ex vivo）模型能够在均匀条件下精确测量SHE，并对多种类型的SIM性能进行详细比较²³。

在本研究中，我们展示了新方法的完整外观 离体 模型，以及新系统的详细设置方法 离体 模型通过视频和图示进行了详细说明。 新 离体 模型由多个部分组成 易于获取且可快速建立。详细的方法学描述将有助于推广这一新模型。

方案

以下方案遵循京都府立医科大学的动物护理指南。

1. 使用猪胃制备标本

注意：第一步是准备用于离体（ex vivo）模型的标本（图1）。猪胃壁的厚度因胃部不同区域而异。应使用猪胃的上三分之一部分，该部分与人胃相对相似。若因纤维化导致黏膜下层隆起不明显，则应排除此类不合适的标本。

1. 切割 将胃组织标本切成约6 × 6平方毫米的方块 厘米
2. 立即将胃部标本储存在 -30 °C 温度下。
3. 在测量前立即解冻冷冻的胃部标本，以确保测量条件的一致性。

2. 一种新型详细设置方法 离体 模型

注意：将解冻后的样本拉直 以两种不同的方式固定在板上。在传统的 离体 模型，用大头针固定标本（图1A)^19,20,21,22另一方面，在新的 离体 模型，用夹子固定或拉伸试件两端以产生恒定张力（图1B，C）。新模型的各个部件均易于获取，且新模型的组装可快速完成（图2）。新模型的步骤如下（图3):

1. 连接不锈钢夹子和 关键导丝和S形钩（图3A).
2. 连接导线并 S形钩和重物（图3A).
3. 将钩子连接到导线的另一端。上述步骤即完成了一个牵引装置的制作。图3B).
4. 固定滑轮（图2b）在基座的两端图3C).
5. 将橡胶板（6 × 6 cm）置于底座中央（图3C).
6. 将胃部标本置于橡胶板上，并用牵引装置的夹子夹住标本两端。
7. 通过滑轮悬挂重物（两侧）。由此可对试样施加恒定张力。图4).
8. 开始测量SEH，因为 在新模型的设置完全完成后（见下文步骤3）。

3. SIM 性能评估

注意：本研究中采用生理盐水（NS）和0.4%透明质酸钠（HA）作为待测的模拟眼内液（SIM），并测量这两种SIM的表面蒸发率（SEH）。每种样品进行三次独立测量，所得数据以均值和标准差（S.D.）表示。统计分析使用统计分析软件（GraphPad Prism 7）进行。连续变量（SEH）采用学生t检验分析，P < 0.05 被认为具有统计学意义。SEH 的测量方法如下（图5）。

1. 根据黏膜下隆起术前黏膜的高度，对高度规进行零点校准。具体操作为：将划针固定在黏膜表面高度后，按下PRESET按钮完成零点校准。
2. 使用2.5 mL注射器和23号 针头，将每种溶液2.0 mL水平注射至标本边缘的黏膜下层，以实施黏膜下隆起术（图5A-C）。
3. 注射后0、2.5、5、7.5、10、12.5、15、17.5、20、30、45和60分钟，立即使用数显高度规测量 SEH（图5D）。具体操作为：将划针固定于黏膜下隆起的最高点，记录高度规上显示的高度值。
4. 进行三次独立测量，结果以均值和标准差表示。
5. 使用适当的统计学软件分析所得数据，并评估SIMs的性能（可对不同SIMs之间的性能进行比较）。

结果

SEH 随时间在新条件下进行测量 离体 模型或常规 离体 模型。使用传统模型测得的SEH（NS）值[将NS注射至以大头针固定的标本黏膜下层（0.0 N）]分别为5.7 mm（0 min）、3.6 mm（5 min）、3.0 mm（10 min）和2.2 mm（30 min）。由此可见，随着注射后时间的延长，SEH值逐渐降低。采用0.4% HA替代NS进行了类似的分析。SEH（0.4% HA）的值分别为6.5 mm（0 min）、5.2 mm（5 min）、4.8 mm（10 min）和4.1 mm（30 min）。在各个注射后时间点，0.4% HA所产生的SEH值均高于NS。使用传统模型（无外加张力）测得的SEH（NS和0.4% HA）表现出相对较大的变异（即其标准差较高）图6A).

接下来，使用传统模型测得的SEH（NS）值[将NS注射至以恒定张力（1.5...

讨论

用于新模型的猪胃应立即存放在冷冻箱中 切除，并在冷冻后数月内使用，因为猪胃的新鲜度对于SEH测量至关重要。（我们测量了 使用冷冻和未冷冻的胃部标本进行SEH检测，并证实SEH测量结果无差异。

胃部标本的质量受猪胃个体差异的显著影响。因此，建议在实验前剔除明显过厚或褶皱过多的标本 测量。此外，由于纤维化，某些标本可能不适合进行SEH测量。建议排除因纤维化导致未见黏膜下层隆起的不适宜标本。

由于消化道在内镜治疗过程中被扩张，胃肠道黏膜会受到一定程度的张力。研究发现，随着施加于样本的张力增加，SIM 的性能（通过测量 SEH 值来评估）有所下降。因此，张力是影响 SIM 性能的重要因素。即，SEH 的值）²³的应用 1.5–3.0 N的张力 可模拟出更接近人体胃肠道黏膜的环境。然而，该方法的一个局限性在于，最佳张力可能取决于所用分析样本的差异。

在传统模型中，由于...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
重量（153.1 g）
固定式滑轮	H.H.H. MANUFACTURING	VS25
直径为 0.45 mm 的不锈钢丝	Nissa Chain	Cut wire Y-5
宽度为 147 mm 的不锈钢夹子	KOKUYO	无
长度为 12 cm 的不锈钢钥匙形金属丝	Nissa Chain	P-702
不锈钢 S 形钩	TRUSCO NAKAYAMA	TCS1.2
可锁定的不锈钢 S 形钩	Mizumoto Machine Mfg	B2054
矩形木质底座（45 × 60 cm）	无	无
橡胶板（5 × 5 cm）	无	无
数显高度规	Mitutoyo	HDS-20C
2.5 mL 注射器	Terumo	SS-02SZ
23 号针头	Terumo	NN-2332R
MucoUp	Boston Scientific	无	0.4% 透明质酸钠（HA）
生理盐水（20 mL）	Otsuka Pharmaceutical	无	正常生理盐水（NS）
GraphPad Prism 7 软件	GraphPad Inc	无