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方法文章

利用下一代测序技术对染色体构象捕获环化文库（4C-seq）进行基因调控序列的高通量鉴定

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DOI：

10.3791/58030

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2018年10月5日

 ,  , 
1Division of Dermatology, Center for Pharmacogenomics, Center for the Study of Itch, Department of Medicine, Washington University School of Medicine

本文内容

摘要

鉴定基因与调控元件之间的物理相互作用具有挑战性，但染色体构象捕获技术为此提供了便利。该4C-seq方案的改进通过减少PCR模板的过度扩增，减轻了PCR偏好性，同时通过增加限制性内切酶消化步骤，提高了测序读段的可比对性。

摘要

针对特定目的基因，鉴定其调控元件在技术上具有显著挑战性，原因在于调控元件相对于目的基因的位置和效应大小存在较大变异性。通过保守的转录因子结合位点，利用生物信息学方法预测与基因激活表达相关的近端表观遗传修饰的存在及其功能，已取得一定进展。染色质构象捕获技术极大地提升了我们发现序列间乃至全基因组范围内染色质物理相互作用的能力。特别是结合高通量测序的环状染色质构象捕获技术（4C-seq），旨在发现特定目标序列（即“视角序列”，viewpoint）的所有可能的染色质物理相互作用，例如目的基因或调控增强子。目前的4C-seq策略直接从视角序列内部进行测序，但为避免高通量测序平台在碱基识别（成像）过程中出现技术偏差，需同时对大量且多样化的视角序列进行测序。这种实验规模对许多实验室而言可能难以实现。本文报道了一种改进的4C-seq实验方案，该方法引入了额外的限制性内切酶消化步骤以及基于qPCR的扩增步骤，分别旨在提高对多样化序列读长的捕获效率，并减轻PCR扩增可能带来的偏差。我们改进的4C方法适用于常规分子生物学实验室，可用于染色质高级结构的研究。

引言

基因表达调控元件的鉴定得益于DNA元件百科全书（ENCODE）计划，该计划对人类基因组80%的区域进行了功能活性的全面注释1,2。在特定细胞类型中，体内转录因子结合位点、DNase I超敏感位点以及表观遗传学组蛋白修饰和DNA甲基化修饰位点的鉴定，为靶基因表达相关候选调控元件的功能分析奠定了基础。基于这些发现，我们面临的新挑战是确定调控元件与基因之间的功能互联性。具体而言，一个特定的靶基因与其增强子（们）之间存在怎样的关系？染色质构象捕获技术（3C）通过在固定化的染色质中捕获相互作用事件，直接回答了这一问题，识别出目标区域与候选互作序列之间的物理性且可能具有功能性的相互作用3。然而，随着对染色质相互作用理解的深入，人们认识到仅研究预先选定的候选基因座不足以全面揭示基因与增强子之间的相互作用。例如，ENCODE项目采用高通量染色体构象捕获碳拷贝（5C）方法，仅检测了人类基因组的一小部分（1%，包含44个基因座的试点集合），即发现这些基因座之间存在复杂的互连网络。具有已鉴定相互作用的基因和增强子平均拥有2–4个不同的互作伙伴，其中许多在基因组线性距离上相距达数百千碱基4。此外，Li et al. 采用配对末端标签测序法进行染色质相互作用分析（ChIA-PET），研究了全基因组范围内的启动子相互作用，发现65%的RNA聚合酶II结合位点参与了染色质相互作用。其中一些相互作用形成了跨越数百千碱基基因组距离的大型多基因复合物，每个复合物平均包含8–9个基因5。这些发现共同凸显了开发无偏倚的全基因组方法以系统研究染色质相互作用的必要性。部分此类方法已在Schmitt et al. 的综述中进行了总结6。

近期结合下一代测序技术的染色质构象捕获方法（Hi-C 和 4C-seq）能够发现与目标区域相互作用的未知序列6具体而言，染色体构象捕获结合高通量测序技术（4C-seq）被开发用于无偏倚地鉴定与目标序列发生互作的基因组位点7 通过测序在三维空间中靠近目标区域的捕获染色质中的DNA。简言之，染色质经固定以保持其天然的蛋白质-DNA相互作用，随后用限制性内切酶切割，并在稀释条件下进行连接，以捕获具有生物学意义的相互作用 "缠结" 相互作用的基因座图1通过逆转交联去除蛋白质，从而释放DNA，以便用第二种限制性内切酶进行进一步切割。最终的连接反应生成包含相互作用位点的小型环状DNA分子。随后利用目标序列的引物对环化片段中的未知序列进行扩增建库，再进行后续的高通量测序。

本文所述方案侧重于样品制备，对现有的4C-seq方法进行了两项主要改进8,9,10,11,12首先，该方法采用基于qPCR的技术，通过实验确定4C-seq文库制备过程中最适扩增循环数，从而减轻因文库过度扩增所导致的PCR偏差。其次，该方法引入额外的限制性酶切步骤，旨在降低已知均一性的影响。 "诱饵" 会阻碍测序仪器准确碱基识别的序列，从而最大化每条读段中独特且具有信息量的序列。其他方案通过混合大量（12-15）个样本以规避此问题8 使用不同诱饵序列和/或限制性酶切位点的4C-seq文库，可进行大量实验，而这些实验数量可能是其他实验室难以实现的。本文介绍的改进方法允许将少量实验、样本和/或重复样本进行索引并合并至同一测序通道中。

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方案

1. 限制性内切酶的选择

  1. 确定一个感兴趣区域（例如基因启动子、单核苷酸多态性（SNP）、增强子）并从国家生物技术信息中心（NCBI）等数据库获取DNA序列。
  2. 确定用于第一次限制性酶切（RE1）的候选限制性内切酶（REs），这些酶不在目标序列内部进行切割，酶切后产生黏性末端（具有突出端的DNA末端），且其活性不受CpG甲基化的抑制。
    注意：数据的分辨率由RE1决定。识别序列为6个碱基对（bp）的酶平均产生约4千碱基（kb）长度的片段，而识别序列为4个碱基对的酶则产生约250 bp长度的片段，从而能够更精确地鉴定相互作用的序列。
  3. 从步骤1.2中确定的候选酶中选择一种RE1，该酶可产生至少500 bp长的“视角”限制性片段，该片段包含目标区域或相邻区域。
    注意：所选酶必须适用于引物设计（见步骤2）。
  4. 对于第二次消化，需选择一种具有4 bp识别序列的限制性内切酶（RE2），该酶在消化后产生黏性末端（带有突出端的DNA末端），其活性不受CpG甲基化抑制，并且能在RE1产生的限制性片段内部进行切割，以生成250–500 bp的诱饵片段（图1).
    注意：所选酶必须适用于引物设计（见步骤2）。

2. 设计并验证反向PCR和消化效率qPCR的引物

  1. 使用引物设计工具（如 Primer3（http://primer3.ut.ee））设计反向引物，使其朝向诱饵片段末端向外延伸即，5’引物为“反向”引物，与正链互补，而3’引物为“正向”引物，与负链互补），并应尽可能靠近限制性酶切位点，以最大限度减少非信息性诱饵序列的扩增，并提高PCR效率（图2A).
    注意：引物的设计应确保对基因组DNA的非特异性扩增最小化 计算机模拟 PCR预测结果应仅在其预期靶标位置与基因组对齐，而在其他位置的同源性不超过18个中有16个匹配9由于测序接头未被整合到反向PCR引物中，引物结合位点相较于其他4C建库方法具有更高的灵活性；引物最理想的情况是结合在相应限制性酶切位点末端50 bp范围内。
    1. 使用纯化的基因组DNA（gDNA）作为模板，通过扩增反应验证反向PCR引物的特异性。
    2. 最佳引物在以基因组DNA为模板时应产生较少的扩增产物（预期的4C产物描述见步骤11.2）。若在基因组DNA中出现显著扩增，则需重新设计引物。若未能筛选出合适的引物组合，请返回步骤1，通过选择新的限制性内切酶来选定新的诱饵。
  2. 设计qPCR引物以扩增长度为70–200个核苷酸（nt）的片段，用于监测限制性消化效率图2B).
    1. 设计一对引物，用于扩增跨越每个限制性酶切位点（在步骤1中选定）的片段，以界定诱饵序列。针对RE1（见步骤6.5.6）和RE2位点（见步骤9.2）均需设计引物。
    2. 设计一组引物，用于扩增一个不包含任一限制性内切酶识别位点的区域，作为RE1和RE2的归一化对照（未切割DNA）（另见步骤6.5.6）。

3. 细胞收集

  1. 采用适用于组织或细胞培养的方法，获得单细胞悬液。将细胞在200 × g 条件下离心5分钟，弃上清，每107个细胞用500 µL的1×磷酸盐缓冲液（PBS）重悬沉淀。

4. 甲醛交联细胞以保存染色质相互作用

  1. 每 107 个细胞，加入 9.5 mL 含 1% 电子显微镜级（EM级，无甲醇）甲醛的 PBS 溶液，在室温（RT，18–22 °C）下于摇床（或类似装置）上轻轻振荡孵育 10 分钟。
    注意：不同细胞类型的固定条件可能需要优化。先前在小鼠细胞中的研究报道，最佳固定条件下，假定为平均大小染色体的非端粒区域，至少有 40% 的比对读段（mapped reads）应定位至包含视角位点（viewpoint）的染色体上9。
  2. 将反应管转移至冰上，加入预冷的 1 M 甘氨酸溶液，使其终浓度为 0.125 M（1.425 mL），以终止交联反应。通过轻柔倒置混匀。
  3. 在 200 × g、4 °C 条件下离心 5 分钟，小心吸除全部上清液。细胞沉淀可于 -80 °C 保存，或立即进行细胞裂解。

5. 细胞裂解

  1. 将第4.3步获得的细胞沉淀用500 µL的5 mM乙二胺四乙酸（EDTA）重悬以进行洗涤。在室温下以200 × g 离心5分钟，弃去上清液。
  2. 将细胞沉淀重悬于125 µL含有0.5%十二烷基硫酸钠（SDS）和1×蛋白酶抑制剂的5 mM EDTA溶液中，例如含有5 mg/mL抑蛋白酶肽、10 mg/mL胃蛋白酶抑制剂、10 mg/mL亮抑蛋白酶肽和10 mg/mL胃蛋白酶A的100×混合液。
    注意：每种细胞类型的去垢剂浓度可能需要优化。去垢剂浓度过低会导致细胞裂解不完全，使染色质无法被限制性内切酶接触。如果在第6.5.6步中限制性消化效率持续偏低，且已确认酶活性正常，则可能需要增加去垢剂浓度。每次以0.1%的增量提高SDS浓度。
  3. 将细胞悬液置于冰上孵育10分钟。
    注意：对于原代人角质形成细胞，最佳裂解条件为在65 °C孵育10分钟，随后在37 °C振荡加热金属浴中过夜孵育（振荡速度900 rpm）。
  4. 确保细胞裂解完全。
    1. 取6 µL细胞悬液与6 µL台盼蓝混合于载玻片上，盖上盖玻片，在显微镜下观察。
      注意：成功裂解后，细胞内部应呈蓝色，未裂解的细胞则呈白色。
    2. 若观察到细胞裂解不充分，以200 × g 离心5分钟收集细胞沉淀，并保留上清液。重新悬浮沉淀，并重复步骤5.2–5.4，或尝试不同孵育温度（参见第5.3步的注释）。
    3. 将重新裂解的细胞沉淀与之前保留的上清液合并后继续后续操作。
      注意：显微观察不能完全保证裂解充分，消化效率应按照第6.5.6步的方法进行客观评估。

6. 第一次限制性消化

  1. 向第 5.4 步的悬液中加入 30 μL 10 倍浓度的限制性内切酶缓冲液（按制造商说明）和 27 μL 20% Triton X-100（终浓度为 1.8%）。用 H2O 将总体积补至 300 µL。
    注意：限制性内切酶缓冲液的组成取决于第 1 步中选择的限制性内切酶。
  2. 取 15 μL 等分试样作为“未消化对照”，于 4 °C 保存。
  3. 向剩余的反应混合物中加入 200 U RE1，并在适合该酶的温度下，在振荡加热金属浴中（900 rpm）过夜孵育。次日，再加入额外的 200 U RE1，继续过夜孵育。
  4. 取 15 μL 等分试样作为“已消化对照”，于 4 °C 保存。
  5. 测定消化效率：
    1. 向第 6.2 和 6.4 步的 15 µL 样品中加入 82.5 µL 10 mM Tris-HCl（pH 7.5）。加入 2.5 µL 蛋白酶 K（20 mg/mL），在 65 °C 下孵育 1 小时。
    2. 加入 100 µL 酚-氯仿，通过倒置剧烈混匀以去除残留的蛋白质污染。室温下以 16,100 × g 离心 5 分钟。
    3. 将水相转移至新管中。加入 6.66 µL 3 M 醋酸钠（pH 5.2）、1 µL 20 mg/mL 糖原和 300 µL 100% 乙醇（EtOH）。轻轻倒置混匀，置于 -80 °C 1 小时。
    4. 在 4 °C 下以 16,100 × g 离心 20 分钟。弃去上清液，加入 500 µL 70% EtOH，在室温下以 16,100 × g 离心 5 分钟。
    5. 弃去上清液，在室温下干燥沉淀 2 分钟。将沉淀重悬于 50 µL 无核酸酶的 H2O 中。
    6. 采用 ∆∆Ct 法通过 qPCR13,14 测定消化效率。使用不位于限制性酶切位点侧翼的引物组（见第 2.2.2 步）作为归一化对照。若消化效率>85%，则继续后续步骤；否则，收集细胞沉淀并重复第 5.2–6.5 步，但省略第 5.3 步中 65 °C 的孵育。

7. 第一次连接反应

  1. 通过在 65 °C 下孵育 20 分钟使限制性内切酶热失活。或者，如果该酶不能通过加热失活，则使用酚-氯仿抽提并进行乙醇沉淀处理样品。
    注意：某些限制性内切酶推荐的较高失活温度会导致染色质中的蛋白质变性，可能对样品质量产生不利影响。此外，酚:氯仿抽提并非理想方法，因其会导致样品损失。
  2. 转移至 50 mL 锥形管中，加入 6 mL 无核酸酶水（H2O）、700 µL 10× 连接酶缓冲液（660 mM Tris-HCl pH 7.5，50 mM 氯化镁（MgCl2），10 mM 二硫苏糖醇（DTT），10 mM 三磷酸腺苷（ATP））以及 50 U T4 DNA 连接酶。轻轻旋转混匀，于 16 °C 过夜孵育。
  3. 取 100 µL 样品作为“连接对照”。
  4. 测定连接效率：
    1. 加入 2.5 µL 蛋白酶 K（20 mg/mL），于 65 °C 孵育 1 小时。
    2. 加入 100 µL 酚-氯仿试剂，颠倒剧烈混匀。室温下以 16,100 × g 离心 5 分钟。
    3. 将水相转移至新管中。加入 6.66 µL 3 M 乙酸钠（pH 5.2）、1 µL 糖原和 300 µL 100% 乙醇（EtOH）。轻轻颠倒混匀，置于 -80 °C 约 1 小时。
    4. 在 4 °C 下以 16,100 × g 离心 20 分钟。弃去上清液，加入 500 µL 70% 乙醇，再于 4 °C 下以 16,100 × g 离心 5 分钟。
    5. 弃去上清液，在室温下干燥沉淀。将沉淀重悬于 20 µL 水中，并与第 6.5 步中的“消化对照”一同上样至 0.6% 琼脂糖凝胶。
      注意：连接良好的样品应呈现为一条相对紧密的高分子量条带（图 3）。
    6. 若连接充分，则继续进行第 8 步；否则，添加新鲜 ATP（终浓度 1 mM）和新的连接酶，于 16 °C 过夜孵育，并重复步骤 7.3–7.4。

8. 反向交联并分离染色质

  1. 加入15 µL蛋白酶K（20 mg/mL），于65 °C孵育过夜以逆转交联。
  2. 加入 30 µL RNase A（10 mg/mL），37 °C 下孵育 45 分钟。
  3. 加入7 mL苯酚-氯仿，颠倒混匀。3,300 x g离心15 min， g 室温下
  4. 将水相转移至新的50 mL离心管中，并加入7.5 mL无核酸酶的H2O（用于稀释连接酶缓冲液中存在的DTT，否则DTT会与DNA共沉淀），3 M乙酸钠pH 5.6 1 mL，糖原溶液（20 mg/mL）7 µL，以及100%乙醇35 mL。混匀后于-80 °C孵育1小时。
  5. 离心20分钟，3,900 x g 在 4 °C 下，移除上清液（沉淀可能不易观察），用 10 mL 冰冷的 70% EtOH 洗涤沉淀，然后以 3,300 x g 离心 15 分钟 g 在 4 °C 下。
  6. 移除上清液，并在室温下短暂干燥沉淀。将沉淀物溶于150 µL 10 mM Tris-HCl（pH 7.5）中，37 °C条件下溶解。置于-20 °C保存或继续进行第9步。

9. 第二次限制性消化：修剪环状DNA

注意：此步骤可生成更小的环状结构，以尽量减少下游扩增步骤中因PCR偏好性导致的小片段捕获产物被过度代表的问题。

  1. 向第8.6步的样品中加入50 µL 10x限制性内切酶缓冲液（按制造商说明）、300 µL无核酸酶水2O，并加入50 U限制性内切酶RE2。在所选酶的适宜温度下过夜孵育。
  2. 取出15 µL样品作为“消化对照”。按照步骤6.5所述方法测定消化效率。

10. 第二轮连接反应与DNA纯化

  1. 按照制造商建议使限制性内切酶失活。如果酶不能通过加热失活，则使用基于柱的纯化试剂盒去除酶。
    注意：由于此步骤会导致样品损失，柱纯化并非理想方法。
  2. 将样品转移至50 mL离心管中，加入12.1 mL无核酸酶水 H2O、1.4 mL 10×连接缓冲液（660 mM Tris-HCl，pH 7.5；50 mM MgCl2；10 mM DTT；10 mM ATP）和100 U T4 DNA连接酶。在16 °C下孵育过夜。
  3. 加入467 µL 3 M乙酸钠（pH 5.6）、233 µL无核酸酶水 H2O、7 µL甘油原（20 mg/mL）和35 mL 100%乙醇（EtOH）。充分混匀，并在-80 °C下孵育1小时。
  4. 在4 °C下以3,900 × g离心45分钟。弃去上清液，加入10 mL预冷的70%乙醇（EtOH），在4 °C下以3,300 × g离心15分钟。
  5. 弃去上清液，在室温下短暂干燥沉淀。加入150 µL 10 mM Tris-HCl（pH 7.5），在37 °C下孵育以溶解沉淀。
  6. 使用基于硅胶柱的PCR纯化试剂盒，按照制造商说明书纯化样品。根据初始细胞数量，每3× 106个细胞使用一个纯化柱。用50 µL 10 mM Tris-HCl（pH 7.5）洗脱各柱，并合并洗脱液。
  7. 通过荧光测定法或分光光度法在260 nm处检测吸光度以测定浓度。此时4C模板已可用于反向PCR。可保存于-20 °C，或直接进入第11步。

11. 通过反向PCR扩增未知相互作用序列

  1. 通过使用 12.5、25、50 和 100 ng 的 4C 模板进行 PCR 扩增，确定扩增的线性范围。如有需要，可同时以基因组 DNA（gDNA）作为模板进行平行扩增，以便直接比较产物，识别非特异性扩增。PCR 反应程序为：94 °C 预变性 2 分钟；进行 30 个循环，每个循环包括 94 °C 变性 10 秒、55 °C 退火 1 分钟、68 °C 延伸 3 分钟；最后在 68 °C 延伸 5 分钟。
  2. 取每种 PCR 产物 15 µL 在 1.5% 琼脂糖凝胶上电泳，以确认线性扩增并评估模板质量（图 4）。从 4C 模板扩增的产物应在低 DNA 浓度下呈现清晰条带，而在高浓度下出现弥散条带。弥散条带的出现表明扩增的 4C 连接产物复杂性增加。
  3. 当对反向 PCR 扩增产物的质量和产量满意后，设置定量 PCR（qPCR）以确定用于扩增的最佳循环数：
    1. 使用 表 2 中的反应体系配制含 SYBR 和 ROX 荧光染料的反应液。除非在第 11.2 步中高浓度下的扩增非线性，否则每反应使用 100 ng 模板。
      注：添加 ROX 有助于实现孔间和循环间的荧光信号归一化。
    2. PCR 反应程序为：94 °C 预变性 2 分钟；进行 40 个循环，每个循环包括 94 °C 变性 10 秒、55 °C 退火 1 分钟、68 °C 延伸 3 分钟；最后在 68 °C 延伸 5 分钟。
    3. 根据扩增曲线确定各反应的峰值（终点）荧光强度，并确定反应达到峰值荧光强度 25% 时所处的循环数（图 5）。
      注：该循环数将用于 4C 文库的扩增（见第 11.4 步）。
  4. 按照 表 3 设置反向 PCR 反应，用于扩增与 4C 模板中诱饵序列连接的未知序列。将总体积均分为 16 个 50 µL 的反应后进行扩增。PCR 反应程序为：94 °C 预变性 2 分钟，随后进行若干循环（每个循环包括 94 °C 变性 10 秒、55 °C 退火 1 分钟、68 °C 延伸 3 分钟），循环数依据第 11.3.3 步确定。
  5. 收集并合并所有反应产物。使用基于硅胶柱的 PCR 产物纯化试剂盒进行纯化，每 16 个反应至少使用 2 个纯化柱。将纯化后的 PCR 产物合并。
  6. 通过分光光度法测定样品的浓度和纯度。典型产量为 10 至 20 μg，A260/A280 比值约为 1.85。若吸光度比值不理想，应重新纯化，以避免测序过程中出现问题。
  7. 取 300 ng 纯化后的 PCR 产物在 1.5% 琼脂糖凝胶上电泳，以评估文库的复杂性。
    注：扩增产物应与第 11.2 步的结果相似。

12. 第三次限制性消化：切除诱饵序列

注意：此步骤旨在从反向 PCR 产物中去除无信息量的诱饵序列，以最大化下游测序步骤中有信息量的捕获序列。为监测消化效率，需平行消化一个“消化监测对照”15，使用与样品相同浓度的 DNA 和酶。如果限制性内切酶 RE1 和 RE2 由于最适孵育温度或反应缓冲液不同而无法兼容同时消化，则必须进行依次消化（此方式并非理想方案）。

  1. 获取一种限制性内切酶消化监测对照，并在50 µL反应体系中测试其消化效果。
    注意：该对照为一段含有限制性内切酶识别位点的双链DNA分子（例如质粒、PCR扩增产物或合成DNA）。唯一要求是在琼脂糖凝胶电泳中能够清晰区分已切割与未切割的对照条带。如有需要，可优化对照DNA的用量和酶浓度。
  2. 对第11.6步获得的1 µg纯化反向PCR产物进行限制性内切酶消化，同时平行消化第12.1步中的限制性内切酶监测对照。
    注意：反向PCR产物和监测对照的DNA浓度、酶浓度以及孵育时间均应与第12.1步中的测试消化条件一致。根据需要调整反应体系体积。
  3. 将消化后的限制性内切酶监测对照在适合预期片段大小的琼脂糖凝胶上进行电泳分析。当未切割的DNA比例低于<10%时，视为消化充分（图6）。
  4. 使用基于硅胶柱的DNA纯化试剂盒纯化已消化的反向PCR产物。若需进行连续消化，则更换第二种酶后重复第12.1–12.4步操作。

13. 测序文库的制备

  1. 连接与相应下一代测序平台兼容的接头。
    1. 针对每种RE1和RE2设计接头，使得在退火寡核苷酸后，每种RE接头具有相应的单侧突出末端。
      注意：例如，若使用HindIII，则退火后的接头应包含5’端磷酸化的“AGCT”突出末端。或者，若使用标准T突出末端接头，则在连接接头前需对文库进行末端修复和A尾添加。
    2. 将相应的RE接头寡核苷酸进行退火。将寡核苷酸溶解于退火缓冲液（10 mM Tris，pH 7.5，50 mM 氯化钠（NaCl），1 mM EDTA）中，等摩尔混合至终浓度50 µM，加热至95 °C，然后缓慢冷却至25 °C。
    3. 进行连接反应。将经RE消化的4C文库与总量为5至10倍摩尔过量的退火接头（步骤13.1.2；每种RE接头按50:50比例混合）加入1×连接酶缓冲液中，再加入6 U DNA连接酶。按照制造商说明书进行孵育。
    4. 使用低洗脱体积的硅基柱试剂盒纯化，以去除过量的接头。
  2. 片段大小选择。
    注意：也可使用基于磁珠的纯化试剂盒进行片段大小选择，即使在柱纯化后也建议进行此步骤。
    1. 使用高分辨率琼脂糖制备2%琼脂糖凝胶，并在倒胶前加入非紫外染料。确保加热过程中因蒸发损失的水分得到补充，可通过称量加热前后瓶子或烧瓶的重量，并加水补足损失的质量来实现。
    2. 将连接接头后的文库上样至凝胶电泳，样品之间保留空泳道。
    3. 使用洁净的手术刀或剃刀切下对应于150 bp至1 kb大小范围的凝胶条带。
    4. 使用凝胶回收试剂盒从凝胶中纯化文库。为最大限度减少DNA回收过程中的GC偏好性，应在室温下旋转溶解凝胶条带。
  3. 使用表4中的反应体系通过qPCR确定PCR扩增所需的循环数。PCR反应程序为：98 °C预变性2分钟，随后进行40个循环，每个循环包括98 °C变性10秒、60 °C退火1分钟、72 °C延伸3分钟。
    注意：荧光信号达到最大值25%时所对应的循环数即为用于文库扩增的循环数，如步骤11.3所述。
  4. 使用表5中的反应体系对文库进行扩增。PCR反应程序为：98 °C预变性2分钟，随后进行若干循环（循环数由步骤13.3确定），每个循环包括98 °C变性10秒、60 °C退火1分钟、72 °C延伸3分钟。
  5. 使用低洗脱体积的硅基柱试剂盒纯化扩增后的文库。

14. 测序及测序数据分析

  1. 使用荧光定量法测定扩增文库的浓度。将文库稀释至适合测序的浓度（请咨询测序服务或核心实验室以获取其推荐浓度）。
  2. 使用微流控核酸分析平台评估文库质量。
    注意：文库的片段大小分布应与第13.2步中大小选择凝胶上观察到的结果一致，本步骤测定的样品浓度将用于后续测序。
  3. 混合带有索引的文库，确保每个样本获得至少300万条读长（每条读长至少50 bp；单端[1X50]或双端[2X50]）。高质量文库要求至少有100万条比对上的读长9，但在比对过程中会存在一定损耗。例如，一个每通道可产生约1.5亿条读长的测序平台，单通道最多可容纳50个样本。

15. 序列数据分析

  1. 使用索引序列对数据进行解复用，将测序读段分配到相应的样本中。
    注意：根据用户的熟悉程度，可使用基本的命令行界面或用户友好的基于网络的 Galaxy 图形用户界面（GUI）对原始 FASTA/FASTQ 序列文件进行下游计算分析16。
  2. 去除接头序列以及第 12 步中因限制性内切酶消化不完全而残留的诱饵序列，例如使用 FAST-X Toolkit（http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/）。
  3. 使用 Burrows-Wheeler Aligner（BWA）17 或其他比对软件将解复用后的读段比对至相应的目标基因组（例如，UCSC mm10、hg19），生成 SAM 输出文件。如有需要，可通过 samtools18 将 SAM 文件转换为 BAM 格式（见第 15.4 步）。
  4. 使用 4C-seq 分析流程（如 Basic4Cseq19、4C-ker20、FourCSeq21 或 fourSig22）分析数据并识别相互作用。
    注意：数据分析及其质量评估应依据所选软件包的参考手册进行。各软件包生成 BED 输出文件，除非另有说明。简而言之，Basic4CSeq19 使用输入的 SAM 文件（第 15.3 步）可视化相互作用（输出 txt、tiff、BED 和 wig 文件），并根据 van de Werken 等9 提出的标准评估数据质量；4C-ker20（输入为经修剪的 FASTQ 文件，第 15.2 步）和 FourCSeq21（输入为 BAM 文件，第 15.3 步）用于识别不同实验条件间的差异性相互作用；fourSig22（输入为 SAM 文件）也可识别具有显著性的相互作用，并优先筛选可能可重复的结果。还可结合使用基因组调控注释富集分析工具（Genomic Regulatory Enrichment of Annotations Tool, GREAT）23 或整合 ENCODE 数据集，以预测 4C-seq 发现的相互作用的生物学功能。

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结果

从2–3份废弃的新生儿包皮组织中分离原代人角质形成细胞，混合后在KSFM培养基中培养，培养基中添加30 µg/mL牛垂体提取物、0.26 ng/mL重组人表皮生长因子和0.09 mM氯化钙（CaCl2），培养条件为37 °C、5%二氧化碳。将细胞分至两个培养瓶中，其中一瓶通过加入CaCl2至终浓度1.2 mM诱导分化，持续72小时。分别取107个增殖期和分化期的角质形成细胞，在室温下用1%甲醛固定10分钟。另取K562细胞，在添加10%胎牛血清的RPMI培养基中于37 °C、5%二氧化碳条件下培养，并取107个细胞在室温下用1%甲醛固定10分钟。

细胞被裂解，固定后的染色质按照上述方法用 HindIII 消化并进行连接。逆转交联后，DNA 被纯化并用 CviQI 消化。将 DNA 连接后作为反向 PCR 扩增的模板。所用引物为：5'-GATCAGGAGGGACTGG...

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讨论

4C 结果有可能揭示染色质相互作用，从而鉴定出在特定生物学背景下具有重要功能的先前未知的调控元件和/或靶基因24,25,26。然而，技术障碍可能会限制这些实验所获得的数据。在 4C 实验流程中，由于模板过度扩增而引起的 PCR 偏倚是可能发生的。本实验方案通过使用 qPCR 客观地确定最佳扩增循环次数，以解决这一问题。此外，通过限制性酶切去除扩增后的反向 PCR 产物中的诱饵序列，可以从两个方面促进染色质相互作用的鉴定：第一，它减少了待测序材料中无信息量的（诱饵）碱基对长度；第二，因此提高了从多样化序列中获得测序读长的可能性（这是准确碱基识别所必需的特性），从而能够比对到更多具有信息量的相互作用序列。其他实验方案需要合并使用不同诱饵序列和/或不同限制性内切酶构建的多个文库，或者需要提高测序样本中 phiX 的浓度，以克服因序列均一性不足而导致的碱基识别困难。本方法允许将多个具有相同诱饵序列的样本合并至单个测序通道中，而无需使用过多的 phiX 占用宝贵...

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披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

本工作由美国国家关节炎与肌肉骨骼和皮肤病研究所（NIAMS）资助（项目编号：R01AR065523）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
HindIIINEBR0104S
CviQINEBR0639S
DNA寡核苷酸引物IDT由读者自行设计
50 mL圆锥形离心管Fisher Scientific06-443-19
1.7 mL微量离心管MidSciAVSS1700
磷酸盐缓冲液Thermo Fisher14190-136
甲醛，无甲醇Electron Microscopy Sciences15710
旋转混合仪VWR15172-203
甘氨酸JT Baker4059-00
台式离心机
制冷微量离心机
乙二胺四乙酸（EDTA）Sigma-AldrichED2SS
20% SDS溶液Sigma-Aldrich05030
台盼蓝Thermo Fisher15250061
载玻片Fisher Scientific12-550-143
盖玻片VWR16004-094
光学显微镜
吐温X-100Alfa AesarA16046
振荡加热金属浴
2 M Tris-HClQuality Biological351-048-101
蛋白酶KNEBP8107S
苯酚:氯仿:异戊醇（25:24:1）Sigma-AldrichP2069
乙酸钠Sigma-AldrichM5661
20 mg/mL糖原Thermo FisherR0561
乙醇Fisher Scientific04-355-223
无核酸酶水Fisher ScientificMT-46-000-CM
qPCR仪Thermo Fisher4453536
qPCR板Thermo Fisher4309849
PCR仪Thermo Fisher4375786
PCR排管MidSciAVSST-FL
1 M氯化镁Quality Biological351-033-721
二硫苏糖醇Sigma-Aldrich43815
三磷酸腺苷Sigma-AldrichA2383
T4 DNA连接酶NEBM0202S
琼脂糖Sigma-AldrichA6013
RNase AThermo FisherEN0531
Qiaquick PCR纯化试剂盒Qiagen28104
MinElute PCR纯化试剂盒Qiagen28004
分光光度计
Expand Long Template PCR体系Sigma-Aldrich11681834001
dNTP混合液Thermo FisherR0191
SYBR Green ISigma-AldrichS9430
ROXBioRad172-5858
氯化钠Sigma-AldrichS5886
End-It DNA末端修复试剂盒LucigenER0720
LigaFast快速DNA连接系统PromegaM8221
SYBR SafeThermo FisherS33102
Taq聚合酶NEBM0267S
UltraSieve琼脂糖IBI ScientificIB70054
Qiaquick凝胶回收试剂盒Qiagen28704

参考文献

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4C-seq 实验方案染色质相互作用分析限制性内切酶消化反向PCR扩增基于qPCR的扩增染色质结构评估转录调控领域
利用下一代测序技术对染色体构象捕获环化文库（4C-seq）进行基因调控序列的高通量鉴定
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