利用下一代序列染色体构象捕获 (4 c 序列) 的高通量识别基因调控数列

Summary

基因和调控元素之间的物理相互作用的识别是具有挑战性的, 但已被染色体构象捕获方法所促进。这种对 4 c 序列协议的修改可以减少 pcr 模板的过度放大, 并通过加入限制酶消化步骤来最大限度地提高 mappability 的读数。

Abstract

由于调控元素对目标基因的定位和作用大小的变化, 确定特定目标基因的调控元素构成了重大的技术挑战。通过保守转录因子结合位点的生物信息学预测与活化基因表达相关的近表观遗传修饰的存在和功能, 取得了一些进展。染色质构象捕获研究已经改变了我们的能力, 发现在序列之间的物理染色质接触, 甚至在整个基因组。环形染色质构象捕获与下一代测序 (4 c 序列), 特别是设计, 以发现所有可能的物理染色质相互作用的特定序列的利益 (观点), 如目标基因或监管增强。目前的 4 c 序列策略直接从视点内排列, 但需要多个不同的视点同时进行排序, 以避免与下一代测序平台一致的基调用 (成像) 技术难题。这一量的实验对许多实验室来说可能并不实际。在这里, 我们报告了一个改进的方法, 4 c 序列协议, 包括了额外的限制酶文摘和基于 qPCR 的放大步骤, 旨在促进更大的捕获不同的序列读取和减少可能的PCR 偏倚, 分别。我们修改后的4C 方法适合于标准分子生物学实验室评估染色质体系结构。

Introduction

DNA 元素百科全书 (编码) 项目为人类基因组^1、280% 的功能活动提供了综合注解, 从而促进了基因表达的调控元素的识别。在体内转录因子结合, DNaseI 过敏, 和表观组蛋白和 DNA 甲基化修饰的个体细胞类型的地点的鉴定为候选调控的功能分析铺平了道路。目标基因表达的元素。有了这些发现, 我们面临着确定调控元素和基因之间功能互联的挑战。具体来说, 一个给定的目标基因和它的增强剂之间的关系是什么？染色质构象捕获 ( 3C ) 方法通过在固定染色质 3 中通过捕获的事件识别一个感兴趣区域和候选交互序列之间的物理和可能的功能互 , 直接解决这个问题 ..然而, 随着我们对染色质相互作用的理解增加, 显然, 对预选候选基因座的调查不足以提供对基因增强器相互作用的完全理解。例如, 编码使用高通量染色体构象捕获碳拷贝 (5C) 方法来检查人类基因组的一小部分 (1%, 44 个基因座的先导集), 并报告了基因座的复杂互联。基因和促进剂与确定的相互作用平均2–4不同的相互作用的伙伴, 其中许多是数以百计的 kilobases 离开在线性空间⁴。还有, 李等。采用配对端标记测序 (嘉-PET) 进行染色质相互作用分析, 分析全基因组启动子相互作用, 发现65% 的 RNA 聚合酶 II 结合部位参与了染色质的相互作用。其中一些相互作用导致大, 多基因复合体横跨数以百计的 kilobases 基因组距离和包含, 平均, 8-9 个基因每⁵。这些发现结合在一起, 强调需要无偏全基因组方法来审问染色质相互作用。其中一些方法在施密特和al中进行了评述。⁶。

最近的染色质构象捕获研究方法, 加上下一代测序 (高 c 和 4 C 序列), 使发现未知数列与感兴趣的区域⁶。具体来说, 用下一代测序 (4 c 序列) 建立环状染色体构象捕获, 以以无偏见的方式⁷通过测序 DNA 从近距离捕获的染色质到3D 空间感兴趣的区域。简要地说, 染色质是固定的, 以保持其原生蛋白-DNA 相互作用, 与限制酶, 并随后结扎在稀释条件下, 以捕获生物学相关的 "缠结" 的相互作用的基因座 (图 1)。交叉链接被逆转, 以去除蛋白质, 从而留下的 DNA 可用于额外的分裂与第二限制酶。最后的结扎会产生更小的相互作用的圆圈。然后用引物对感兴趣的序列进行生成, 从发送的片段中产生未知序列的放大库, 其次是下游下一代测序。

此处提出的关于样本准备的协议对现有的4种 c 序列方法^{8、9、10、11、12}进行了两项重大修改。首先, 它使用一种基于 qPCR 的方法来经验主义地确定 4 c 序列库准备步骤的最佳放大周期数, 从而减少了由于图书馆过度扩增而导致的 PCR 偏倚的可能性。其次, 它使用额外的限制摘要步骤, 努力减少已知的 "诱饵" 序列的一致性, 这会阻碍测序仪精确地进行基调用, 从而使每读中的唯一信息序列最大化。其他协议通过将许多 (12-15)⁸ 4 c 序列库与不同的诱饵顺序和/或限制站点汇集在一起来规避这个问题, 这是其他实验室可能无法实现的大量实验。此处所做的修改允许少量的实验、样本和/或复制被编入索引, 并汇集到一个单独的车道中。

Protocol

1. 限制酶的选择

1. 确定一个感兴趣的区域 (例如, 基因启动子, 单核苷酸多态性 (SNP), 增强剂), 并从资料库中获取 DNA 序列, 如国家生物技术信息中心 (NCBI)。
2. 确定第一限制酶消化 (RE1) 中的候选限制酶 (REs), 它不在感兴趣的序列内切割, 在重新消化后产生粘性端 (DNA 终点), 其活动不受中央甲基化。
   注意: 数据的分辨率由 RE1 决定。一个6基对 (bp) 识别序列的酶平均产生大约 4 kilobases (kb) 长度的片段, 而一个 4 bp 识别序列的酶产生的碎片约 250 bp 长度, 允许更精确的交互序列的标识。
3. 从步骤1.2 中确定的候选酶中选择一个 RE1, 它产生一个 "视点" 限制片段, 至少 500 bp, 包括感兴趣的区域, 或者是相邻区域。
   注: 选择的酶必须服从底漆设计 (见步骤 2)。
4. 对于第二次消化, 确定一个限制酶 (RE2) 与 4 bp 识别序列, 产生粘性末端 (DNA 总站与悬垂) 后, 重新消化, 其活动不受中央甲基化的抑制, 并在限制内削减由 RE1 生成的片段, 用于生成250–500的 bp 诱饵片段 (图 1)。
   注: 选择的酶必须服从底漆设计 (见步骤 2)。

2. 反 PCR 和消化效率 qPCR 的设计和试验引物

1. 使用底漆设计工具, 如 Primer3 (http://primer3.ut.ee) 设计反向引物, 向外定向到诱饵片段的两端 (i. e., 5 ' 底漆是一个 "反向" 底漆, 互补的加链, 而 3 ' 底漆是一个 "向前 "底漆, 互补的减去链) 和尽可能接近限制点尽可能减少非信息诱饵序列的放大, 并最大限度地提高 PCR 效率 (图 2A)。
   注:在硅PCR 预测中, 应预测引物在基因组 DNA 中的最小非特异扩增, 不应与基因组其他地方保持一致, 除非其预期目标具有16/18 个以上的标识⁹。由于顺序适配器没有纳入反 PCR 引物, 底漆结合部位比其他4C 制备方法更灵活;底漆应在相应限制点的末端50的 bp 中最佳退火。
   1. 以纯化基因组 DNA (gDNA) 为模板, 确定反 PCR 引物的特异性。
   2. 当使用 gDNA 作为模板时, 最佳底漆应产生很少的产品 (请参见步骤11.2 以描述预期的4C 产品)。如果 gDNA 大量放大, 设计新的引物。如果未识别出可接受的底漆集, 请返回步骤1并选择新的限制酶来选取新的诱饵。
2. 设计 qPCR 底漆, 以放大片段70–200核苷酸 (nt) 的长度, 以监测限制消化效率 (图 2B)。
   1. 设计一对引物, 在每个限制站点 (在步骤1中选择) 中放大, 定义诱饵序列。设计两个 RE1 (参见步骤 6.5.6) 和 RE2 站点的引物 (请参见步骤 9.2)。
   2. 设计一组引物, 将不包含任何限制酶的站点的区域放大为 RE1 和 RE2 的规范化控制 (未切割的 DNA) (请参见步骤 6.5.6)。

3. 单元格的收集

1. 使用适合组织或细胞培养的方法, 获得单细胞悬浮。在 200 x g上将细胞颗粒5分钟, 丢弃上清, 并在500µL 的1x 磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 中并用重悬颗粒, 每 10⁷个细胞。

4. 甲醛交联细胞保持染色质相互作用

1. 每 10⁷个细胞, 增加9.5 毫升1% 电子显微镜 (EM) 级甲醛 (无甲醇) 在 PBS 和孵化, 而翻滚在摇杆 (或类似), 在室温下 (RT, 18–22°c) 10 分钟。
   注意: 对于每个细胞类型, 固定条件可能需要进行优化。先前发表在小鼠细胞中的工作报告说, 最佳固定结果至少有40% 的映射读数与包含视点⁹的染色体相对准, 它假设一个平均大小染色体的非端粒长度区域。
2. 将反应管转移到冰上, 加入冰冷1米甘氨酸, 最终浓度为0.125 米 (1.425 毫升), 以淬火交联反应。通过温和的倒置混合。
3. 离心机为5分钟, 在 200 x g, 4 摄氏度, 并仔细清除所有上清。储存细胞颗粒在-80 摄氏度或立即进行细胞裂解。

5. 细胞裂解

1. 并用重悬从500µL 5 毫米乙二胺乙酸 (EDTA) 中的步骤4.3 中的细胞颗粒进行洗涤。离心机在 200 x g 5 分钟的 RT. 丢弃上清。
2. 并用重悬125µL 5 毫米 EDTA 的细胞颗粒, 0.5% 的月桂酸钠 (SDS) 和1x 蛋白酶抑制剂, 如100x 鸡尾酒含有5毫克/毫升 antipain, 10 毫克/毫升 chymostatin, 10 毫克/毫升 leupeptin, 10 毫克/毫升 pepstatin a。
   注意: 每种细胞类型都可能需要对洗涤剂浓度进行优化。洗涤剂浓度不足会导致细胞裂解不完全, 使染色酶无法进入染色质。如果在步进6.5.6 的限制消化持续低, 酶活性已经确认, 可能需要额外的洗涤剂。增加0.1% 增量的 SDS 浓度。
3. 在冰上孵化细胞悬浮10分钟。
   注: 对于原发性人角质形成细胞, 最佳裂解方法是使用10分钟孵化在65°c, 其次是37°c 夜间孵化在摇晃加热块 (900 rpm)。
4. 确保细胞裂解完成。
   1. 将6µL 的细胞与6µL 的台盼蓝放在一张幻灯片上, 盖上盖玻片。在显微镜下查看。
      注: 成功裂解后, 细胞内部应呈蓝色, 而非裂解细胞将呈白色。
   2. 如果细胞裂解似乎不足, 颗粒细胞在 200 x g 5 分钟, 并保存上清。并用重悬颗粒和重复步骤5.2–5.4 和/或不同的潜伏期温度 (见步骤5.3 中的说明)。
   3. 将再裂解颗粒与保存的上清液结合, 进行。
      注意: 目视检查不是充分溶解的保证。消化效率应客观地确定为步骤6.5.6。

6. 第一限制消化

1. 添加 30 ul 10x 限制酶缓冲器 (由制造商指定) 和 27 ul 20% 海卫 X-100 (最后 1.8%) 到暂停从步骤5.4。用 H₂O 将总容积µL 300。
   注: 限制酶缓冲器的组成将取决于步骤1中选择的 RE。
2. 删除 15 ul 整除为 "未消化的控制", 并存储在4摄氏度。
3. 添加 200 U RE1 到剩余的反应混合物和孵化隔夜在温度适当对酵素在震动加热块以鼓动 (900 rpm)。第二天, 增加一个额外的 200 U RE1 和继续孵化过夜。
4. 删除 15 ul 整除为 "消化控制", 并存储在4摄氏度。
5. 确定消化效率:
   1. 从步骤6.2 和6.4 中添加82.5 µL 10 毫米三 HCl pH 7.5 到15µL 样品。添加2.5 µL 蛋白酶 K (20 毫克/毫升) 和孵化1小时在65摄氏度。
   2. 添加100µL 苯酚-氯仿, 并通过反演强力混合去除残留蛋白质污染。离心机为5分钟, 室温 16100 x g 。
   3. 将水相转移到新管上。添加6.66 µL 3 米醋酸钠 pH 5.2, 1 µL 的20毫克/毫升糖原, 300 µL 100% 乙醇 (乙醇)。通过反转和放置在-80 °c 1 小时轻轻混合。
   4. 离心机为20分钟在 16100 x g在4°c。取出上清液, 加入500µL 70% 乙醇, 离心机为5分钟, 在 RT 处 16100 x g 。
   5. 取出上清液, 在室温下将球团干燥2分钟, 并用重悬50µL 核酸酶₂O。
   6. 使用∆∆Ct 方法确定 qPCR^13、14的消化效率。使用不与限制站点侧翼的底漆集 (请参见步骤 2.2.2) 作为规范化控件。如果消化效率为 > 85%, 则继续进行。否则, 颗粒细胞和重复步骤 5.2–6.5, 省略孵化65°c 在步骤5.3。

7. 首次结扎

1. 在65摄氏度孵化20分钟, 使限制酶失效。或者, 如果酶不能热灭活, 苯酚-氯仿萃取物和乙醇沉淀样品。
   注: 对于某些限制酶变性蛋白质在染色质中的作用, 建议的失活温度较高, 这可能对样品质量产生负面影响。另外, 苯酚: 氯仿提取不是理想的, 因为它导致样品丢失。
2. 转移到一个50毫升圆锥管和添加6毫升的核酸酶₂O, 700 µL 10x 连接酶缓冲器 (660 毫米三盐酸 pH 7.5, 50 毫米氯化镁 (氯化镁₂), 10 毫米 dithiothreitol (), 10 毫米三磷酸腺苷 (ATP)), 50 U T4 DNA 连接酶。轻轻地混合旋转和孵化过夜在16摄氏度。
3. 删除100µL 整除的样本作为 "结扎控制"。
4. 确定结扎效率:
   1. 添加2.5 µL 的蛋白酶 K (20 毫克/毫升) 和孵化1小时在65摄氏度。
   2. 加入100µL 的苯酚-氯仿, 并通过反演强力混合。离心机为5分钟, 16100 x g在 RT。
   3. 将水相转移到新管上。添加6.66 µL 3 米醋酸钠 pH 5.2, 1 µL 糖原, 300 µL 100% 乙醇。通过反转和放置在-80 °c 约1小时轻轻混合。
   4. 离心机为20分钟在 16100 x g在4°c。取出上清液, 添加500µL 70% 乙醇, 离心机为5分钟, 在 16100 x g处4摄氏度。
   5. 取出上清液, 在室温下干燥颗粒。并用重悬在20µL 水中的颗粒和负载的0.6% 琼脂糖凝胶旁边的 "消化控制" 从步骤6.5。
      注: 一个好结扎的样品应该出现作为一个相对地严密, 高分子量带 (图 3)。
   6. 如果结扎足够, 继续步骤8。否则, 加入新鲜的 ATP (1 毫米最终浓度) 和新的连接酶;一夜之间孵化16摄氏度, 重复步骤7.3–7.4。

8. 反向交联和分离染色质

1. 添加15µL 的蛋白酶 K (20 毫克/毫升) 和孵化隔夜在65°c, 以扭转交叉链。
2. 添加30µL 的 RNase A (10 毫克/毫升) 和孵化45分钟在37摄氏度。
3. 加入7毫升苯酚-氯仿, 并通过反演强力混合。离心机15分钟, 3300 x g 。
4. 将水相转移到新的50毫升管, 并加入7.5 毫升的无核酸酶 H₂O (以稀释连接酶缓冲器中存在的, 否则与 DNA 沉淀), 1 毫升3米醋酸钠 pH 5.6, 7 µL 糖原 (20 毫克/毫升), 35 毫升100% 乙醇。混合和孵化在-80 °c 1 小时。
5. 离心机20分钟, 3900 x克4 摄氏度。移除上清 (颗粒可能很难看见), 用10毫升冰冷70% 乙醇, 和离心机15分钟, 3300 x g在4°c 洗涤颗粒。
6. 移除上清液, 并在 RT 中简单地干燥颗粒. 在150µL 10 毫米的三盐酸 pH 7.5 处溶解颗粒, 37 摄氏度。存储在-20 摄氏度或继续步骤9。

9. 第二限制消化: 修剪圈子

注意: 这一步创建较小的圆圈, 以最小化的过多, 由于 PCR 偏倚在下游放大步骤。

1. 对步骤8.6 中的样本, 添加50µL 10x 限制酶缓冲器 (由制造商指定), 300 µL 核酸酶₂O 和 50 U 限制酶 RE2。在适宜于所选酶的温度下过夜孵化。
2. 去除样品的15µL 整除作为 "消化控制"。确定消化效率, 如步骤6.5 所述。

10. 第二结扎和 DNA 纯化

1. 按照制造商的建议, 禁用限制酶。如果酶不能热灭活, 使用基于柱的纯化试剂盒去除酶。
   注: 由于这导致样品丢失, 柱纯化不理想。
2. 将样品转移到50毫升管, 并加入12.1 毫升的核酸酶₂O, 1.4 毫升10x 结扎缓冲 (660 毫米三 HCl, pH 7.5; 50 毫米氯化镁₂; 10 毫米的电磁场; 10 毫米 ATP), 100 U T4 DNA 连接酶。孵化过夜在16摄氏度。
3. 添加467µL 3 米醋酸钠 pH 5.6, 233 µL 核酸酶无 H₂O, 7 µL 糖原 (20 毫克/毫升), 35 毫升100% 乙醇。混合良好, 孵育-80 °c 1 小时。
4. 离心机45分钟, 3900 x克4 摄氏度。取出上清液, 加入10毫升冷70% 乙醇, 离心机15分钟, 3300 x g 4 摄氏度。
5. 去除上清液, 并在室温下简单干燥颗粒。添加150µL 10 毫米三盐酸 pH 7.5 和孵化在37°c, 以溶解颗粒。
6. 按照制造商的说明, 用硅胶柱式 PCR 纯化试剂盒净化样品。根据单元格的初始数目, 每 3 x 10⁶个单元格使用1列。洗脱柱与50µL 10 毫米三 HCl, pH 7.5 和池的样品。
7. 使用 260 nm 的吸光度测量荧光或分光光度法的浓度。4C 模板现在已经准备好进行反 PCR。存储在-20 摄氏度或直接进入步骤11。

11. pcr 放大未知交互序列的反 pcr

1. 通过使用模板稀释12.5、25、50和 100 ng 4C 模板进行 PCR, 确定放大的线性范围。如果需要, 从 gDNA 放大, 直接比较产品, 以确定非特定放大。用94摄氏度的初始变性进行 PCR 反应2分钟;30个周期由变性步骤组成, 在94°c 为十年代, 退火步骤在55°c 为1分钟, 并且延长步骤在68°c 为3分钟;和最后的延伸在68°c 为5分钟。
2. 在1.5% 琼脂糖凝胶上分别分离15µL 的 PCR 产物, 以确认线性放大和评估模板质量 (图 4)。4C 模板的放大应在低 DNA 浓度下产生离散带, 并在较高浓度下进行涂片。涂片的存在表明放大后的4C 结扎的复杂性增加。
3. 当对所生成的反相 PCR 产品的质量和数量满意时, 设置一个 qPCR 来确定用于放大的最佳周期数:
   1. 用表 2中的反应混合物建立含有 SYBR 和火箭染料的反应。除非在步骤11.2 中高浓度的放大不是线性的, 否则每个反应使用模板的 100 ng。
      注: 火箭的加入促进了从井到井的荧光信号的规范化和循环周期。
   2. 使用94°c 的初始变性进行 PCR 反应2分钟;40个周期由变性步骤组成, 在94°c 为十年代, 退火步骤在55°c 为1分钟, 并且延长步骤在68°c 为3分钟;和最后的延伸在68°c 为5分钟。
   3. 使用放大图确定反应的峰值 (端点) 荧光。确定反应达到峰值荧光25% 的周期 (图 5)。
      注意: 这是将用于放大4C 库的周期数 (请参见步骤 11.4)。
4. 在表 3中设置反 PCR, 以放大从4C 模板中结扎到诱饵的未知序列。在跑步前分为16反应50µL。使用94摄氏度的初始变性进行 PCR 反应2分钟, 并由94摄氏度的变性步骤组成的周期为十年代, 退火步骤在55摄氏度为1分钟, 而延伸步骤为68摄氏度, 3 分钟. 使用步骤11.3.3 中确定的周期数。
5. 收集并汇集反应。用硅胶柱基 PCR 纯化试剂盒进行提纯。每16反应至少使用2列。池中的纯化 PCR 产品。
6. 用分光光度法测定样品的数量和纯度。典型的产量在10和20微克之间与 A260/A280 ~ 1.85。如果吸收比是次优, 重新净化, 以防止在排序过程中的问题。
7. 通过在1.5% 琼脂糖凝胶上分离纯化的 PCR 产物 300, 评估图书馆的复杂性。
   注: 放大后的产品应类似于步骤11.2。

12. 第三限制消化: 修剪诱饵序列

注意: 此步骤从反 PCR 产品中删除非信息性诱饵序列, 以最大限度地提高下游排序步骤中的信息捕获序列。为了监测消化效率, 一个 "摘要监测"¹⁵是平行消化, 使用等效 DNA 和酶浓度。如果 RE1 和 RE2 是不相容的同时消化, 例如, 由于不同的最佳孵化温度或反应缓冲器, 这必须做的顺序文摘 (这是不理想的)。

1. 获得一个重新消化监测和测试消化在50µL 反应。
   注: 这是一个 dsDNA 分子 (例如, 一种质粒, PCR 扩增子, 或合成 DNA), 其中包含 RE 站点 (s)。唯一的要求是, 它应该是很容易区分切割从未切割的显示器上琼脂糖凝胶。如果需要, 优化重新监测质量和酶浓度。
2. 从步骤11.6 中消化纯化的反 PCR 产物的1µg, 同时, 从步骤12.1 中重新监测。
   注: DNA 和酶浓度, 以及潜伏期, 应该是相同的测试文摘在步骤12.1 中的反 PCR 产品和监测文摘。根据需要调整反应量。
3. 在适合于预期片段的琼脂糖凝胶上运行消化后的再监测。当 < 10% 的 DNA 保持未切割时, 消化被认为是足够的 (图 6)。
4. 在硅胶柱基 DNA 纯化试剂盒上纯化所消化的反相 PCR 产物。如果需要顺序摘要, 重复步骤12.1–12.4 第二种酶。

13. 编制测序库

1. 结扎与各自的下一代测序平台兼容的适配器。
   1. 设计每个 RE1 和 RE2 的适配器, 以便在退火寡核苷酸后, 每个重新适配器都有各自的1侧悬置。
      注: 例如, 如果使用 HindIII, 退火的适配器应包含 5 ' 磷酸化 "AGCT" 的悬置。或者, 如果使用标准的 T 型悬置适配器, 则在适配器结扎之前, 最终修复和跟踪库。
   2. 退火各自的适配器重新寡核苷酸。并用重悬寡核苷酸在退火缓冲 (10 毫米三, pH 7.5, 50 毫米氯化钠 (氯化钠), 1 毫米 EDTA), 混合摩尔数量到50µM, 热量到95°c, 并且允许慢慢地冷却到25°c。
   3. 执行结扎反应。混合重新消化4C 库与总5到10倍摩尔超过退火的适配器 (步骤 13.1.2; 50:50 比为每个重新适配器使用) 在1x 连接酶缓冲区和添加 6U DNA 连接酶。根据制造商的指示孵化。
   4. 通过使用低洗脱量的硅基柱套件进行净化, 去除多余的适配器。
2. 大小-选择。
   注意: 尺寸选择也可以使用基于珠子的清理套件来执行, 即使在柱纯化之后也建议这样做。
   1. 用高分辨率琼脂糖浇铸2% 琼脂糖凝胶, 在浇注前加入非紫外线染色。确保在加热过程中由于蒸发而损失的任何水, 在加热前和之后称量瓶子或烧瓶, 并添加水以恢复损失的质量。
   2. 在凝胶上运行适配器-结扎库, 在样本之间留下空车道。
   3. 使用干净的手术刀或剃刀刀片, 将相应于大小范围 150 bp 的凝胶切片放到 1 kb。
   4. 使用凝胶萃取试剂盒从凝胶中纯化库。为了最大限度地减少 GC 在 DNA 回收中的偏倚, 在室温下用旋转来溶解凝胶切片。
3. 用表 4中的反应混合物确定 qPCR 的 PCR 扩增周期数。使用98°c 的初始变性进行 PCR 反应, 2 分钟和40个周期组成的变性步骤在98°c 为十年代, 退火步骤在60摄氏度为1分钟, 和延伸步骤在72°c 为3分钟。
   注意: 荧光达到最大值的25% 的周期是将用于放大库的周期数, 如步骤11.3 所说。
4. 使用表 5中的反应混合物放大库。使用98°c 的初始变性进行 PCR 反应2分钟, 并由98摄氏度的变性步骤组成的周期为十年代, 退火步骤在60摄氏度为1分钟, 而延伸步骤为72摄氏度, 3 分钟。在步骤13.3 中确定了每个库使用的放大周期数。
5. 使用低洗脱量的硅基柱套件净化放大的库。

14. 测序数据的排序和分析

1. 用荧光法测定扩增库的浓度。将库稀释到适当的集中度以进行排序 (检查顺序服务或核心以供其推荐)。
2. 使用微流控核酸分析平台确定库的质量。
   注意: 库的大小配置文件应在步骤13.2 中的尺寸选择凝胶上看到, 并且在该步骤中确定的样本浓度将用于排序。
3. 池索引库获得至少300万读取 (至少50个 bp 读取; 单个 [1X50] 或配对端 [2X50]) 每个样本。高质量的库需要至少100万个映射读取⁹, 但在映射过程中会有一些损耗。例如, 一个测序平台每条车道产生大约1.5亿个读数, 可以在一个车道上容纳多达50个样本。

15. 序列数据分析

1. 使用索引序列解数据, 将读取分配给相应的示例。
   注意: 根据他们的熟悉程度, 用户可以使用基本命令行界面执行原始 FASTA/FASTQ 序列文件的下游计算分析, 或者, 用户友好的基于 web 的 Galaxy 图形用户界面 (GUI)¹⁶.
2. 修剪适配器序列和任何诱饵序列产生的不完全的再消化在步骤 12, 例如, 使用快速 X 工具箱 (http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/)。
3. 地图 demultiplexed 阅读到相应的感兴趣的基因组 (e., UCSC mm10, hg19) 使用布伦斯-惠勒光刻 (BWA)¹⁷或其他对齐软件, 导致 SAM 输出文件。如果需要, 可通过 samtools¹⁸将 SAM 文件转换为 BAM (请参见步骤 15.4)。
4. 使用 4 c 序列分析管道, 如 Basic4Cseq¹⁹, 4 c-FourCSeq²⁰,²¹, 或 fourSig²² , 以分析数据和确定相互作用。
   注: 数据分析和质量评估应根据所选软件包的参考手册进行。包生成床输出文件, 除非注明。简而言之, Basic4CSeq¹⁹使用输入 SAM 文件 (步骤 15.3) 来可视化交互 (txt、tiff、床和假发输出文件), 并根据 Werken 和al中规定的标准评估数据的质量。⁹ 4-c²⁰ (输入修剪 FASTQ, 步骤 15.2) 和 FourCSeq²¹ (输入 BAM, 步骤 15.3), 以确定条件之间的差异交互作用。fourSig²² (输入 SAM) 还确定了重要的交互作用, 并将可能重现的优先级排定为排序。工具, 如基因组调节丰富的注解工具 (大)²³, 或与编码数据集集成, 也可以用来预测的生物学功能的互动发现了 4 c

Results

从2–3丢弃的新生儿包皮、池中和培养的 KSFM 中分离出主要的人角质形成细胞, 辅以30µg/毫升牛垂体提取物、0.26 毫升重组人表皮生长因子和0.09 毫米氯化钙 (CaCl₂) 摄氏37摄氏度, 5% 二氧化碳。这些细胞被分成两个烧瓶, 一个烧瓶由添加 CaCl₂到最终浓度为1.2 毫米的72小时 10⁷细胞分别被固定在1%室温下甲醛为10分钟。另外, K562 细胞生长在 RPMI 补充10% 胎牛血清在37摄氏度, 5% 二氧化碳。10⁷细胞在室温下固定1% 甲醛, 10 分钟。

细胞裂解, 固定染色质被消化 HindIII 和结扎如上文所述。交叉链接被逆转, DNA 被纯化和 CviQI 消化。DNA 被结扎并用作反 PCR 扩增的模板。底漆使用的是: 5 '-GATCAGGAGGGACTGGAACTTG/5 '-CCTCCCTTCACATCTTAGA...

Discussion

4C 结果有可能揭示染色质相互作用, 可以识别以前未知的调控元素和/或目标基因是重要的在特定的生物环境^24,25,26。然而, 技术障碍可能会限制从这些实验获得的数据。在4C 协议中, 模板过度放大引起的 PCR 偏倚很可能。该协议通过利用 qPCR 来确定最佳的放大周期数以客观的方式来解决这个问题。此外, 通过限制文摘从扩增的反相 PCR 产品中去除诱饵序列可以促进染色质相互作用的鉴定, 原因有二。首先, 它将非信息 (诱饵) 基对的长度从要测序的材料中减少。其次, 它增加了从不同序列生成更多读取的可能性 (精确的基调用所需的属性), 从而可以映射更多的信息交互序列。其他协议要求使用不同的诱饵序列和/或限制酶汇集许多图书馆, 或者要求增加序列样品的 phiX 集中, 以规避顺序均匀性问题为准确基地调用。这种方法允许将同一诱饵序列的多个样本汇集到一个单一的测序车道, 而不占用有价值的测序能力和过量的 phiX。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
HindIII	NEB	R0104S
CviQI	NEB	R0639S
DNA 寡核苷酸引物	IDT		由读者设计
50 mL 锥形离心管	Fisher Scientific	06-443-19
1.7 mL 微量离心管	MidSci	AVSS1700
磷酸盐缓冲盐水	Thermo Fisher	14190-136
无甲醛、无甲醇	电子显微镜科学	15710
章动器	VWR	15172-203
甘氨酸	JT Baker	4059-00
台式离心机
冷冻微量离心机
乙二胺四乙酸酸 （EDTA）	Sigma-Aldrich	ED2SS 20
% SDS 溶液	Sigma-Aldrich	05030
台盼蓝	Thermo Fisher	15250061
载玻片	Fisher Scientific	12-550-143
盖玻片	VWR	16004-094
光学显微镜
Triton X-100	Alfa	Aesar A16046
摇动热块
2 M Tris-HCl	质量生物	351-048-101
蛋白酶 K	NEB	P8107S
苯酚：氯仿：异戊醇 （25：24：1）	Sigma-Aldrich	P2069
醋酸钠	Sigma-Aldrich	M5661
20 毫克/mL 糖原	Thermo Fisher	R0561
乙醇	Fisher Scientific	04-355-223
无核酸酶水	Fisher Scientific	MT-46-000-CM
qPCR 循环仪	Thermo Fisher	4453536
qPCR 板	Thermo Fisher	4309849
Thermo	Fisher	4375786
PCR 试管	MidSci	AVSST-FL
1 M 氯化镁	质量 生物	351-033-721
二硫苏糖醇	Sigma-Aldrich	43815
三磷酸腺苷	Sigma-Aldrich	A2383
T4 DNA 连接酶	NEB	M0202S
琼脂糖	Sigma-Aldrich	A6013
RNase A	Thermo Fisher	EN0531
Qiaquick PCR 纯化试剂盒	Qiagen	28104
MinElute PCR 纯化试剂盒	Qiagen	28004
分光光度计
扩展长模板 PCR 系统	Sigma-Aldrich	11681834001
dNTP 混合物	ThermoFisher	R0191
SYBR Green I	Sigma-Aldrich	S9430
ROX	BioRad	172-5858
氯化钠	Sigma-Aldrich	S5886
末端 DNA 末端修复试剂盒	Lucigen	ER0720
LigaFast 快速 DNA 连接系统	Promega	M8221
SYBR 安全	热Fisher	S33102
Taq 聚合酶	NEB	M0267S
UltraSieve 琼脂糖	IBI Scientific	IB70054
Qiaquick 凝胶提取试剂盒	Qiagen	28704