流式细胞术分析已被证明在研究纯培养物和监测微生物群落动态方面具有重要价值。我们分别提供了从取样到数据分析的三个完整工作流程，适用于透明培养基中的纯培养物和复杂群落，以及具有挑战性的基质环境。
本文内容
摘要
摘要
研究纯培养物并监测微生物群落动态对于理解和控制由微生物驱动的自然生态系统及技术应用至关重要。新一代测序方法被广泛用于解析微生物组，但通常耗时耗力，且主要提供定性信息。流式细胞术微生物组分析则无上述缺点，可在线获取亚群落的相对丰度及细胞的绝对数量。尽管该方法不能直接提供系统发育信息，但可增强测序方法的分析深度与分辨率。与医学领域在科研和常规应用中广泛使用流式细胞术形成鲜明对比的是，该技术在微生物组分析中仍未得到普遍应用。样本制备和数据分析流程相关信息的缺乏，可能为面临微生物组分析挑战的研究人员设置了入门障碍，而这些挑战往往正是流式细胞术的经典应用场景。本文中，我们分别提供了三种全面的工作流程，适用于纯培养物、透明培养基中的复杂群落以及复杂基质中的复杂群落。我们描述了针对不同样本类型的采样与固定方法，以及优化的染色方案；详细阐述了使用复杂科研型和应用导向型台式仪器进行的流式分析，介绍了细胞分选流程，并推荐了数据分析软件包。此外，我们提出了关键的实验对照措施，并将所展示的工作流程应用于相应的样本类型。
引言
微生物在人类生活的许多方面发挥着至关重要的作用。它们是地球碳、氮、磷和硫循环的主要生物驱动因素1，并在各种工业中充当降解2，3和合成4的生物催化剂，例如在废水处理5或生物技术6领域。它们甚至构成了人类微生物组，直接影响人类健康与代谢7，8。因此，若要全面理解并调控这些系统，就必须获取微生物在响应其局部环境时的结构、功能及动态行为信息。新一代测序（NGS）是解析微生物组结构与功能的成熟技术9。然而，NGS数据的分析与评估无法提供定量信息，且仍然成本高昂、耗时较长，远未达到在性能限制范围内实现现场检测的水平。某些细菌的世代时间短于1小时，导致特定环境中的群落结构持续变化10。若采用测序方法追踪此类动态变化，将超出大多数科研实验室的财力与人力承受能力。
相比之下，流式细胞术能够提供类似于高通量测序（NGS）数据的群落指纹图谱，同时具有更高的时间、人力和成本效率。本文介绍了可在单细胞水平上在线追踪微生物群落动态变化的流式细胞术技术。与高通量测序不同，流式细胞术无法提供系统发育归属或功能基因信息，但可提供定量的细胞数量。利用流式细胞术，可将微生物群落分解为具有不同光散射和荧光特性的亚群落（前向散射（FSC）和侧向散射（SSC）分别反映细胞大小和颗粒度）。本方法主要利用与特定细胞类型及生理（生长）状态相关的细胞大小和DNA含量信息。DNA含量通过可被紫外光激发的4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染料进行定量，该染料结合DNA中富含A-T的区域，甚至可分辨不同的染色体水平。结合DAPI荧光信号与FSC参数，可区分并监测50多个亚群落随时间变化的丰度11。亚群落丰度的变化可与微环境因素（如pH值和产物滴度）12、宏观参数（如天气）13,14，或在肠道及唾液微生物组中与特定医学治疗方案相关联15。这些相关性分析可揭示在整个群落代谢网络中承担特定功能的关键亚群落。随后可通过调控周围微环境来特异性促进或抑制这些关键亚群落，或对其进行分选以用于后续测序15或蛋白质组学研究16。
然而，由于能够有效分辨微生物种群或群落的流式细胞仪设备数量相对较少，微生物群落流式细胞术尚未得到广泛应用。此外，研究人员在面对微生物组分析挑战时，可能缺乏相关经验、群落分析流程以及有效的数据评估方法，这些都构成了技术入门的障碍。我们已建立了一套全面的工作流程以解决这些问题。为说明其普遍适用性，我们将通过三个典型样本集（补充文件1-S1）进行展示：i）用于生物技术应用的纯培养物（在明确成分的透明培养基中培养的葡萄糖上的恶臭假单胞菌 Pseudomonas putida KT 2440）；ii）在透明培养基中的复杂实验室群落（合成废水中活性污泥群落（ASC））；以及 iii）存在于致密基质中的自然环境复杂群落（玉米青贮料中的沼气群落（BC））。
影响每种样本集方案选择的因素有多种。深度冷冻避免了有毒化学物质的使用，但由于需要液氮进行速冻，主要局限于实验室环境。甲醛稳定化及随后的乙醇固定可实现大量样本的采集，无需分装制备，且已被证明在长期储存中具有良好的稳定性。然而，富含蛋白质的样本（如人唾液15）可能存在困难，因为甲醛导致蛋白质变性形成絮状沉淀，可能引起不利的信噪比。在本比较的各方法中，样本干燥所需时间最长（总计约1小时），但可在现场操作，无需使用有毒化学物质。该方法可在离心管中形成稳定的沉淀物，便于运输，无需冷藏或额外的危险品防护措施。此外，已有大量替代性固定方法被提出11。在引入新的样本集时，我们强烈建议对不同方案的分辨率和固定稳定性进行测试。
我们使用了两种不同的流式细胞仪来分析这些样本：i）一种高度复杂且昂贵的、以研究为中心的细胞分选仪；ii）一种以应用为导向的台式分析仪，更适合现场应用5。使用台式分析仪测量了BC，而PC和ASC则使用细胞分选仪进行测量。对这三个典型样本集的分析需要采用不同的操作流程，以实现最佳的可重复性、样本稳定性和操作流程的便利性。以下方案将分别针对这三种不同系统进行具体说明。
方案
1. 取样与固定
- 纯培养：深度冷冻15,17
- 取2 mL细胞悬液，室温（RT）下以5,000 x g离心5分钟 g 弃去上清液。
注意：所采样的细胞悬液详见补充文件1-S1。 - 将细胞重悬于 1 mL 磷酸盐缓冲液（PBS；6 mM Na2HPO4，1.8 mM NaH2PO4，含双蒸馏水的145 mM NaCl2O，pH 7.2）中额外添加15%（v/v）甘油作为冷冻保护剂。
- 在冰上孵育10分钟，然后在液氮中速冻，随后于-80 °C保存。
注意：此处可暂停实验流程。样品在至少一个月内保持稳定。
- 取2 mL细胞悬液，室温（RT）下以5,000 x g离心5分钟 g 弃去上清液。
- 活性污泥群落：甲醛稳定化 + 乙醇固定5,10,18
- 取4 mL细胞悬液，于15 °C、3,200 x g条件下离心20 min g 弃去上清液。
注意：所采样的细胞悬液详见补充文件1-S1。 - 加入4 mL含2%甲醛的PBS溶液，室温孵育30分钟。
- 从多聚甲醛配制8%甲醛储备液，以避免液态甲醛中添加的防腐剂甲醇。将4 g多聚甲醛加入50 mL PBS中，于70 °C条件下溶解。加入约125 µL 10 M NaOH溶液，搅拌至多聚甲醛完全溶解，随后冷却至室温。用约100 µL 37% HCl将pH值调节至7.0。将甲醛溶液分装为每份15 mL，冷冻保存。解冻后的分装液使用时间不得超过10天。
警告：由于甲醛具有毒性和致突变性，必须小心操作和处理。操作时应始终佩戴手套。溶解多聚甲醛时需使用通风橱，以避免接触有毒烟雾。
- 从多聚甲醛配制8%甲醛储备液，以避免液态甲醛中添加的防腐剂甲醇。将4 g多聚甲醛加入50 mL PBS中，于70 °C条件下溶解。加入约125 µL 10 M NaOH溶液，搅拌至多聚甲醛完全溶解，随后冷却至室温。用约100 µL 37% HCl将pH值调节至7.0。将甲醛溶液分装为每份15 mL，冷冻保存。解冻后的分装液使用时间不得超过10天。
- 将样品在 15 °C 条件下以 3,200 x g 离心 10 分钟 g 弃去上清液。
- 用4 mL 70%乙醇重悬样品，并于-20 °C保存。
注意：此处可暂停实验流程。样品在至少 2 个月内保持稳定。根据样本特性，步骤 1.2.1 中的离心步骤也可在 4 °C 下进行 10 分钟，以节省时间。
- 取4 mL细胞悬液，于15 °C、3,200 x g条件下离心20 min g 弃去上清液。
- 沼气社区：干燥
- 使用截短的1,000 µL枪头吸取200 µL黏稠消化液至2 mL离心管中。
- 加入1,700 µL PBS缓冲液，充分混匀。
- 将试管放入超声波清洗仪中，设置频率为35 kHz，有效输出功率为80 W，处理1分钟，以分散较大的细胞聚集体并使其解离 细胞黏附在植物细胞残渣上。
- 充分混匀样品，经50 µL孔径滤膜过滤，将滤液分为四份，每份约400 µL。
注意：在此步骤制备分装样品具有两个主要优势。首先，较小体积的样品在机械脱水（离心）和热脱水（干燥）过程中更简便、更快速，但从通常较为黏稠的沼气污泥中取样小体积样品可能极具挑战性。其次，额外的样品可用于后续的细胞分选、备用测量或对照实验。 - 将等分试样在 10 °C 条件下以 4,000 x g 离心 10 分钟，重复两次 g 两次均需彻底弃去上清液，以尽可能充分地通过机械方式使样品脱水。
- 在35 °C、约-97 kPa和2,500 x条件下，使用加热真空离心机干燥样品40分钟 g 以形成稳定的沉淀物。将沉淀物置于4 °C避光保存。
注意：此处可暂停实验方案。沉淀物在至少6个月内保持稳定。
2. 染色
注意：DAPI 染色已被证实可提供高分辨率的点图，因此在分析群落时具有显著优势。染色液中的 DAPI 浓度需优化，以确保细胞门控的荧光强度明显高于噪声水平但低于微球信号。最佳浓度取决于仪器灵敏度和所用微球类型，并可能因样品中微生物的 G/C 含量不同而有所变化，因此建议对新引入的样品集进行预实验测试。针对本实验设置，推荐测试 0.24 µM DAPI 至 1 µM DAPI 之间的浓度。其他染料也可根据特定应用选择使用。当绝对细胞计数准确性优先于指纹图谱分析时，建议采用 SYBR Green I 染色方案（补充文件 1-S1）6,15。该方案涉及更少的样品处理和离心步骤，适用于固定细胞和活细胞。使用活细胞可进一步减少操作步骤，省去固定过程，仅需一次离心即可完成细胞收集，从而最大限度地减少细胞损失及由此产生的系统性测量误差。所有后续步骤中使用的 PBS、透化缓冲液和染色液均应通过 0.2 µm 注射器滤器过滤，以降低样品中额外的颗粒负荷。建议在每批样品池中同时染色一个包含大肠杆菌 Escherichia coli BL21 (DE3) 的样品作为生物学标准品。
- 纯培养
- 解冻样本，在室温下以 5,000 x g 离心 5 分钟 g 弃去上清液。
- 将细胞沉淀用预冷的PBS重悬，通过反复吹打混匀，并调整OD700 nm 至 0.035（光程长度比色皿 = 0.5 cm
- 准备细胞以进行染色。
- 将1 mL调整后的细胞悬液在室温下以5,000 x g离心5分钟 g 弃去上清液。
- 将细胞重悬于1 mL含有0.3 M柠檬酸和4.1 mM Tween20的透化缓冲液中，并充分混匀。
- 将样品置于冰上孵育10分钟，以形成可渗透的细胞膜，便于后续染色。
- 在室温下以5,000 × g离心样品5分钟，弃去上清液。
- 加入1 mL染色液，其中含有0.68 µM DAPI和417 mM Na2HPO4/NaH2PO4 缓冲液（289 mM Na2HPO4，128 mM NaH2PO4 用双蒸水2O，pH 7），混合并在室温避光条件下孵育至少15分钟。
注意：精确调整光密度（OD）至关重要，因为如果保持 DAPI 浓度恒定，DAPI 荧光会随细胞密度变化，从而影响测量结果的可比性。由于细胞沉淀通常较为松散脆弱，去除上清液时应小心操作，以避免细胞损失。
注意：由于 DAPI 具有致突变性，操作和处置时需小心谨慎。
- 活性污泥群落
- 将固定后的样品充分混匀，取0.6 mL转移至玻璃管中。加入1.4 mL PBS，于室温下超声处理10 min，操作同步骤1.3.3所述。在4 °C、3,200 x g条件下离心10 min，弃去上清液。加入2 mL PBS，充分混匀，超声处理5 min。
- 调节OD700 nm 至 0.035（光程长度比色皿 用 PBS 冲洗（直径 = 0.5 cm）。
- 准备细胞以进行染色。
- 将样品在 4 °C 条件下以 3,200 x g 离心 10 分钟 g 并移除上清液。
- 将细胞重悬于1 mL含有0.11 M柠檬酸和4.1 mM Tween20的透化缓冲液中，并充分混匀。
- 室温孵育20分钟，以制备可渗透的细胞膜，用于后续染色。
- 再次以 4 °C、3,200 x g 离心样品 10 分钟 g 并移除上清液。
- 加入含有 0.68 µM DAPI 和 417 mM Na 的 2 mL 染色液2HPO4/NaH2PO4 缓冲液，充分混匀，室温避光孵育至少60分钟。
注意：建议使用玻璃试管，因为某些微生物容易黏附在塑料试管管壁上，可能导致在操作过程中丢失。也可选择过夜培养，这通常可简化实验操作流程。
注意：由于 DAPI 具有致突变性，必须小心操作并妥善处理。
- 沼气社区
- 将干燥的细胞沉淀重悬于PBS中。
- 加入 800 µL PBS，充分混匀，静置孵育 15 分钟。
- 用1,000 µL移液器吸去液相，并用移液器吸头将浸透的沉淀转移至管壁的圆柱部分，使其附着于该处。
- 用移液器枪头沿管壁做圆周运动，压碎沉淀。
- 用移液枪尖沿管壁加入液相，将管壁上的所得浆液冲洗下来。
- 用移液器将悬浮液吸取并重新悬浮三次，以混匀。
- 用 PBS 清洗样本两次。
- 在10 °C、4,000 x g条件下离心5分钟 g 弃去上清液。
- 加入1,500 µL PBS，充分混匀。
- 重复上述两个步骤一次。
- 将试管放入超声波清洗仪中处理1分钟，具体操作如步骤1.3.3所述；随后，将每个样品通过50 µL滤网过滤至单独的玻璃试管中。
- 将2 mL样品稀释至OD700 nm 0.035（光程）比色皿 用 PBS 冲洗（直径 = 0.5 cm）。
- 按照上述第2.2.3步所述，将细胞进行染色前处理。
- 加入含有 0.24 µM DAPI 和 417 mM Na 的 2 mL 染色液2HPO4/NaH2PO4 缓冲液，充分混匀，室温避光孵育过夜。
注意：由于 DAPI 具有致突变性，必须小心操作并妥善处理。
- 将干燥的细胞沉淀重悬于PBS中。
3. 测量
注意：示例样本集使用了两台不同的流式细胞仪进行分析。质控样本（PC）和活性污泥样本（ASC）采用一台结构更复杂、高度可调且易于定制、以研究为中心的细胞分选仪进行分析。在分析PC时，该仪器配置的激光系统如先前发表文献16所述，简而言之包括蓝色（488 nm，400 mW）和紫外（334–364 nm，100 mW）氩离子激光器。在分析ASC时，则安装了较新的蓝色（488 nm，400 mW）和紫外（355 nm，150 mW）半导体激光器。在这两种情况下，蓝色激光用于激发前向散射光信号FSC（带通滤光片488 nm ± 5 nm，中性密度滤光片1.9）和侧向散射光信号SSC（带通滤光片488 nm ± 5 nm，中性密度滤光片1.9，触发信号）。这些光学特性分别与细胞大小和细胞密度相关。紫外激光用于激发DAPI荧光（带通滤光片450 nm ± 32.5 nm），以定量细胞DNA含量。流体系统运行压力为56 psi（3.86 bar），样品过压最大为0.3 psi，使用70 μm喷嘴。所有参数均记录为峰高而非峰面积，以提高测量分辨率。沼气微生物群落的长期监测则采用结构较简单、基于流动比色皿的台式分析仪进行。该仪器使用紫外半导体激光器（355 nm，50 mW）激发FSC信号（带通滤光片355 nm ± 5 nm）和SSC信号（带通滤光片355 nm ± 5 nm，触发信号），并激发DAPI荧光（带通滤光片455 nm C）。两台仪器所用鞘液的水均为双蒸水并经0.1 µm过滤。用于样品稀释的PBS应通过0.2 µm注射器滤膜过滤，以尽可能降低测量中的颗粒噪声。
- 纯培养与活性污泥群落
- 启动仪器、激光器、计算机和软件，准备进行样品分析。
- 打开激光器并运行15分钟，以达到工作温度并确保光束稳定。
- 用10倍稀释的鞘液缓冲液（19 mM KH₂PO₄）填充鞘液箱2PO4，38 mM KCl，166 mM Na2HPO4，含双蒸水的1.39 M NaCl2O) 用双蒸水稀释的 H2稀释至0.2倍工作浓度（用于细胞分选时：0.5倍工作浓度）。
- 以56 psi的正压对流体系统进行预加压，同时对废液罐施加约6 psi的负压。
- 以反冲模式运行仪器至少15分钟，以冲洗样品口、管路和喷嘴。
- 使用标准微球进行校准。
- 在线性范围（1 μm 蓝色 + 2 μm 黄绿色荧光）和对数范围（0.5 μm 和 1 μm 蓝色荧光）内配制用于校准的微球混合液。将微球悬液从原始储备液中稀释，以获得相等的浓度。
- 持续测量线性微珠混合物，并通过调节喷嘴和激光光学元件的位置，将微珠峰拟合至预设的校准模板，以在线性范围内对仪器进行预校准。
- 切换至对数范围，持续测量对数微球混合液。将微球峰拟合至预设的校准模板，以微调仪器硬件。通过光电倍增管（PMTs）的增益设置对微球位置进行最终调整。
- 检查仪器噪声的位置，并根据需要调整以匹配校准模板。
注意：在开始测量项目之前，必须预先制备用于珠子位置的固定校准模板，且在项目进行中不可更改（参见补充文件1-S4）！仪器噪声可能由样本中的颗粒或光电倍增管（PMTs）的电子噪声引起，并会在一定程度上始终被记录。不建议通过增益调节或图谱偏移完全掩盖噪声。噪声事件的数量和分布位置可能提供有价值的信息，因此应保留在原始数据中。对于颗粒密度极高的样本，可能出于绘图和数据分析的需要，在后续步骤中去除噪声。在测量当天应定期检查校准情况，以确保仪器稳定性，从而保证样本间的可比性。
- 测量含有生物标准品的样本，具体步骤如2.1.4所述（DAPI染色 大肠杆菌 BL21 (DE3)，根据1.2节所述ASC方案在稳定期（16 h）取样并固定。将峰位置与预设的校准模板进行比对（见补充文件1-S5）。
注意：每次样本批次中对生物标准品进行常规染色和测量，也可作为染色程序的内部对照。如果使用微球校准设备，而生物标准品不符合其预设的校准模板，则可能需要重复染色步骤。 - 样本采集
- 运行染色液10分钟，以冲洗样品口和管路，并确保后续样品中DAPI荧光的稳定性。
- 使用50 μm滤网过滤染色后的样品，以防止堵塞流式细胞仪喷嘴或流动毛细管。
- 加入对数微球混合物以监测仪器稳定性，并为回顾性校准检查提供可能。每个样本应在两个微球门中各包含 1,000 至 2,500 个事件。
- 在新样本集的首次试验测量期间，在仪器软件中创建细胞门控。该门控应包含染色的细胞，并排除噪声和微珠。
- 混合样品，并以每秒3,000个事件的最大速度进行检测-1 直到在细胞门控内检测到250,000个细胞（群落）或50,000个细胞（纯培养物）为止。
注意：这些细胞计数是根据样本集的实验经验确定的。可根据需要调整细胞数量，以在检测低丰度亚群的灵敏度和测量效率之间进行权衡。
故障排除：测量过程中微珠和细胞位置的突然偏移可能是由于喷嘴中滞留气泡所致。此时需卸下喷嘴进行清洁，并用鞘液缓冲液冲洗流体系统。重新安装喷嘴后，仪器需重新校准（从步骤3.1.2开始）。 - 关机并更换样本前，务必用鞘液缓冲液彻底反向冲洗仪器。
- 启动仪器、激光器、计算机和软件，准备进行样品分析。
- 沼气社区
- 启动仪器、激光器、计算机和软件，以准备样品分析。
- 反向冲洗至少6 mL鞘液缓冲液（双蒸H2O）通过管路和样品口注入一个松散连接的管子，使用仪器软件的“鞘液启动”功能。
- 测量双蒸水2O₂，5 µL/s-1 冲洗流体系统，直至每秒事件数少于200个-1 以常规流速 0.5 µL/s 检测-1.
- 校准系统。
- 制备微球混合液（0.5 μm 和 1 μm 蓝色荧光微球）。将微球悬液从原始储备液稀释，以获得相等的浓度。
- 持续测量珠混悬液的对数值4 调整流动池和激光光学位置，使微球峰位于检测范围内，并拟合到预设的校准模板。通过调节PMT的增益设置，对微球位置进行最终优化。
- 按照步骤3.1.3中所述，使用生物标准品进行校准控制。
- 样本采集
- 将400 µL染色样本用1,600 µL PBS稀释，混匀后上机检测，监测事件数以进行浓度测定。
注意：对于其他样本来源，可能需要调整稀释倍数。事件计数不应超过每秒 1,200 个事件-1 在颗粒丰富的样本中，为防止前向散射分辨率下降（补充文件1-S2中的反面示例），纯培养物的检测可达到每秒2,000个事件-1. - 在首次试测期间，在仪器软件中创建细胞门控。该门控应包含染色的细胞，并排除噪声和微珠。
- 根据浓度测试结果稀释样品，以运行最多 1,200 个总事件/s-1 加入珠混合物以监测仪器稳定性，并为回顾性校准检查提供可能。每个样本应在两个珠门中各包含 1,000 至 2,500 个事件。
- 混合并计数样品，直至在细胞门内检测到250,000个细胞（群落）或50,000个细胞（纯培养物）。
- 用双蒸水彻底冲洗仪器2关闭前及更换样品前的 O。
- 将400 µL染色样本用1,600 µL PBS稀释，混匀后上机检测，监测事件数以进行浓度测定。
- 启动仪器、激光器、计算机和软件，以准备样品分析。
4. 细胞分选
注意：细胞分选步骤需要额外的仪器设置，并依据已发表的方案进行12。
- 按照步骤 3.1.1-3.1.3 所述启动并校准仪器，但使用 0.5x 工作浓度的鞘液缓冲液。
- 设置 DD 频率和 DD 振幅以找到液滴断裂点。
- 安装偏转板，对其进行充电，并选择 2 路或 4 路分选模式。
- 使用 2 μm 黄绿色微球进行内部液滴延迟校准，以确定颗粒或细胞从检测点（激光照射细胞处）到达与液流相连的最后一个液滴所需的时间。
- 在载玻片上分选 6 次，每次 20 个微球，然后用显微镜计数以验证液滴延迟校准的准确性。
- 设置分选门模板。
- 采用“单细胞单液滴模式：最高纯度 99%”，总事件速率不超过 2,500 个事件每秒（s-1），每次最多在 4 个分选门内分选 500,000 个细胞（4 路分选模式）。
- 通过离心收集细胞（20,000 x g，6 °C，25 分钟），将沉淀在 -20 °C 冻存，用于后续 DNA 提取和测序。
注意：避免对相对丰度低于 5% 的分选门中的细胞进行分选，因为分选时间与相对丰度成反比。各个具体操作步骤详见细胞分选仪使用手册。所需细胞数量高度依赖于具体应用和提取方案。已有多种方法被应用：数字液滴 PCR（ddPCR，1,000 个细胞17,19）、16S rDNA 或 mcrA 扩增子测序（500,000 个细胞6,10,15）以及蛋白质组学（最多 1.1 x 107 个细胞16,17）。当与宏基因组学方法结合时，细胞分选尤其具有优势，因为分选出的亚群落多样性较低。
警告：由于存在高电压，在分选过程中切勿触碰偏转板。
5. 数据分析
注意：细胞计量测量产生具有通用统一数据结构的“流式细胞术标准” .fcs 数据文件。然而，不同流式细胞仪制造商使用略有差异的版本，且较早的仪器可能早于2010年发布的最新FCS 3.1标准。这可能导致散点图缩放问题，从而无法直接比较不同仪器获得的结果。但各个数据点始终存储于矩阵的行中，相应的散射光和荧光强度值位于不同的列中。所介绍的微生物组分析流程利用独特的细胞大小和DNA含量来描述微生物亚群落。这些参数与FSC以及DAPI荧光通道强度（细胞分选仪：FL-4，分析仪：FL-1）相关联，在二维FSC与DAPI荧光图中可视化时形成亚群落聚类。这些散点图可用于解释和分析流式细胞术数据，通常采用对数刻度。可通过专用流式细胞仪软件或第三方工具从 .fcs 文件中显示这些图，它们是自动化（细胞计量直方图图像比较，CHIC）和半自动化（细胞计量条形码，CyBar）群落分析的基础。
- 流式细胞术直方图图像比较
注：该软件包的代码、详细文档和使用手册可在 http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/flowCHIC.html 获取。相关资料也已发表20。- 安装并加载 R 软件包，设置包含 .fcs 文件的工作目录，并通过执行以下命令建立文件列表：
> source("https://bioconductor.org/biocLite.R")
> biocLite("flowCHIC")
> library(flowCHIC)
> # 将工作目录设置为 FCS 文件所在路径
> # 在引号中输入路径
> setwd("")
> # 获取工作目录中 FCS 文件的文件名列表
> files <- list.files(getwd(),full=TRUE,pattern="*.fcs")
> # 获取包含在软件包中的 FCS 文件的文件名列表
> files <- list.files(system.file("extdata",package="flowCHIC"),
+ full=TRUE,pattern="*.fcs")
> # 将第一个 FCS 文件读取为 flowFrame
> frame <- read.FCS(files[1],alter.names=TRUE,transformation=FALSE)
> # 获取参数/通道名称列表
> unname(frame@parameters@data$name) - 通过执行 "fcs_to_img" 软件包函数，为流式细胞术原始数据创建图像：
> # 使用默认参数创建直方图图像
> fcs_to_img(files) - 通过执行 "img_sub" 软件包函数，定义直方图图像的子集：
> # 使用默认参数创建直方图图像子集
> img_sub(files,ch1="FS.Log",ch2="FL.4.Log") - 通过执行 "calculate_overlaps_xor" 软件包函数，计算重叠度和异或（XOR）值以进行图像分析：
> # 将所有子集图像的名称保存为列表
> subsets <- list.files(path=paste(getwd(),"chic_subset",sep="/"),full=TRUE,pattern="*.png")
> # 计算重叠度和异或图像，并将数值写入两个新文件
> results<-calculate_overlaps_xor(subsets) - 通过执行 "plot_nmds" 软件包函数，创建非度量多维尺度分析（NMDS）图以进行相似性分析：
> # 显示样本的 NMDS 图
> plot_nmds(results$overlap,results$xor)
- 安装并加载 R 软件包，设置包含 .fcs 文件的工作目录，并通过执行以下命令建立文件列表：
- 流式细胞术条形码分析
注：该软件包的代码、详细文档和使用手册可在 http://www.bioconductor.org/packages/devel/bioc/html/flowCyBar.html 获取。相关资料也已发表11,12。- 为所有样本建立主门控模板。
- 使用拖放功能将 .fcs 文件加载到分析软件中。
- 双击某项测量，并从下拉列表中选择 x 轴和 y 轴参数，以打开 FSC 与 DAPI 荧光图。
- 使用多边形绘制工具重现此前在步骤 3.1.4.5 和 3.2.4.4 中用于控制分析细胞数量的细胞门，并相应命名。将样本列表中的细胞门条目拖动至所有样本组以进行合并。
- 双击细胞门，校正坐标轴分配，以可视化门内细胞事件。
- 根据已发表的指南12，使用椭圆门工具定义样本集中存在的亚群，并通过扫描 SSC 或其他第三个参数21 来确保门控模板的完整性。在其他样本上合并、控制并调整亚群分配。
- 将相对亚群丰度导出为 .txt 文件，供 R 脚本使用。
- 通过编辑选项卡打开表格编辑器。
- 为步骤 5.2.1.5 中定义的每个亚群添加列，将输出统计量设置为“父群频率”并命名。
- 在选择保存格式和目标位置后，在“表格编辑器”中创建表格。
注：分析软件可直接提供相对亚群丰度。也可通过将各亚群门内的事件数除以细胞门内的事件总数获得。这些数值必须保存为制表符分隔的矩阵，并存入 .txt 文件中，文件中不得包含任何 n.a. 字段，且需满足 R 代码读取的其他附加要求（具体说明请参见手册和常见问题解答）。
- 安装并加载 R 软件包，并通过执行以下命令加载数据：
> source("https://bioconductor.org/biocLite.R")
> biocLite("flowCyBar")
> # 在引号中输入路径
> setwd("")
> # 加载数据集
> data(Cell_number_sample)
> # 显示数据
> Cell_number_sample[,-1] - 通过执行 "normalize" 软件包函数，对相对丰度进行归一化：
# 归一化数据，输出保留两位小数
normalize(Cell_number_sample[,-1],digits=2) - 通过执行 "cybar_plot" 软件包函数，创建归一化相对丰度的条形码图及原始相对丰度的箱线图：
Normalized_mean<-normalize(Cell_number_sample[,-1],digits=2)
Normalized_mean<-data.frame(data.matrix(Normalized_mean))
# 使用默认参数绘图
cybar_plot(Normalized_mean,Cell_number_sample[,-1]) - 创建原始相对丰度的 NMDS 图。
> Normalized_mean<-normalize(Cell_number_sample[,-1],digits=2)
> Normalized_mean<-data.frame(data.matrix(Normalized_mean))
> # 归一化细胞数的 NMDS 图
> nmds(Normalized_mean) - 通过执行 "correlation" 软件包函数，对归一化相对丰度与其他参数进行相关性分析：
> # 加载数据集
> data(Corr_data_sample)
> # 显示相关性数值
> Corr_data_sample[,-1]
> # 执行相关性分析
> correlation(Corr_data_sample[,-1])
注：CHIC 和 CyBar 依赖于相对丰度。然而，流式细胞术也可测定绝对细胞数，这在生物技术应用中可能具有重要意义。为确定绝对细胞数，需将目标门内的细胞数除以所分析的样本体积。所分析的样本体积可通过向样本中加入已知浓度的微球悬浮液来确定（公式见补充文件 1-S7）。台式分析仪还配备了真正的体积计数功能，可在测量期间直接量化样本管中的体积。建议使用 SYBR Green I 染色方案进行细胞计数。
- 为所有样本建立主门控模板。
结果
以下代表性结果强调了设置重复的必要性，并展示了针对三组样本中每一组所适用的不同数据可视化与分析技术。这些结果展示了可用于回答各组样本相关标准科研问题的数据评估流程。然而，所呈现的技术并不仅限于与其一同展示的样本组。流式细胞术原始数据已通过 FlowRepository 编号 FR-FCM-ZY46 公开提供。此前上传的 ASC 数据可在编号 FR-FCM-ZYD7 下获取。
根据已发表的方案采集、制备并分析生物学重复和技术重复样本11。PC 和 ASC 的生物学重复样本取自三个平行的培养瓶。BC 的生物学重复样本是在中试规模装置的同一位置进行三次连续采样获得。每个样本取三个等分试样进行固定、染色和分析，以确保技术上的可重复性。方法的可重复性评估依据先前发表的流程进行11。使用针对同一样本组所有样本的门控模板（补充文件 1-S6）计算每个门控的标准偏差（%）。
对于PC，相对丰度的最大标准偏差为3.44%，平均标准偏差为2.13%（图1）。对于ASC和BC，相对丰度的最大标准偏差分别为1.27%和0.88%，标准偏差的平均值分别为2.13%和0.21%（补充文件1-S8）。
在研究纯菌株培养物时，一个标准操作是绘制生长曲线，以分析在特定条件下菌体的延滞期、世代时间及细胞密度。我们将该操作与流式细胞术分析流程相结合，以更深入地理解该系统（图2）。FSC 与 DAPI 荧光图谱揭示了分批培养过程中不同时间点菌群的细胞周期状态。我们建立了一个主门控模板（补充文件1-S6），用于量化含有一条（c1n）、两条（c2n）或多条染色体（cXn，图2B）的细胞比例。接种时绝大多数细胞仅含一条染色体（0小时时占93.7%）。在指数生长期，这一比例发生显著变化：几乎所有细胞均含有超过一条染色体（4小时时占99.6%），且超过半数细胞群体（53.1%）甚至含有超过两条染色体。这表明P. putida能够以快于其世代时间的速度复制其染色体。
流式细胞术分析已被证明在监测微生物群落演变方面非常有用，其对群落动态的追踪能力远超资源消耗更大的分子方法5,10。我们通过一段视频直观展示了这些动态，并获得了随时间变化的活性污泥群落演替概览。每一秒的帧显示了一个样本点的前向散射光（FSC）与DAPI荧光图（补充文件2）。从第0天到第4天出现了非常显著的群落变化，随后在第7天之后形成了一个核心群落。到第21天时，又出现了额外的亚群落。我们建立了一个主门控模板（补充文件1-S6），实现了在亚群落水平上对微生物动态的评估。利用CyBar工具可清晰识别实验不同阶段中的优势亚群落（图3）。结合相对亚群落丰度的频率分布，有助于筛选出具有研究意义（在关键时间点触发丰度显著变化）且可行（相对丰度超过5%）的门控区域，用于分选及后续分析22。
工业规模生物反应器的应用可能因搅拌受限而面临潜在的空间异质性问题，同时还经常受到操作参数变化的影响，例如非合成底物质量的波动。该生物膜群落（BC）代表了此类系统，并从动态驱动的推流式反应器中不同位置进行了取样。代表性取样点的FSC与DAPI荧光图谱（图4）显示，空间异质性较小，但时间异质性显著。进一步采用快速自动化的CHIC方法以及基于主门控模板的深度分析方法CyBar对BC进行了研究。
其自动化、快速且无偏倚的特性，使得CHIC在工业环境中对生物工艺的现场控制尤为适用。它可比较所有可用样本的原始.fcs数据。其中两项比较显示在 图5. 结果所得的相异性值证实了先前关于空间和时间异质性的观察结果。由 CHIC 工具生成的相异性矩阵所绘制的 NMDS 图图6进一步证实了这一结果，并对此进行了相应的可视化。
此外，我们使用主门控模板（补充文件1-S6）计算了BC中23个子群落的相对丰度。对为期一年的48个样本进行了相关性分析，以了解微生物群落中的功能关系，这有助于确定值得进一步研究的关注门控（4 细胞分选）。与产物滴度等非生物参数之间的强正相关或负相关性，有助于理解并优化生态系统和生物技术过程。相关性分析中还包括了有机负荷率图7）是此类非生物参数的一个例证。G5、G4 和 G10 表现出强烈的正相关性，可能含有发酵型物种，而 G8 中的负相关性可能提示存在产甲烷古菌。
图 1：纯培养物流式细胞分析的可重复性。 FSC 与 DAPI 荧光散点图（含对照微球）（A, B），以及三个亚群相对丰度 [%] 的柱状图，误差线表示 ± 一个标准差（C, D）。相对丰度通过补充文件 1-S6 所示的设门模板确定。在生长曲线 4 h 时间点采集了三个生物重复 A、B 和 C；从样本 A 制备了三个技术重复 P1、P2、P3，并分别测量三次：M1、M2、M3，各数据均附其对应的标准差。细胞门内共记录 50,000 个事件。 请点击此处查看该图的高清版本。
图2：在12小时生长曲线实验过程中采集的纯培养物的细胞周期分析。（A） 每两小时取样的前向散射光（FSC）与DAPI荧光散点图，显示在对数生长期DNA含量发生偏移。该测量系列未包含微球（参见补充文件1-S3）。（B） 基于光密度的生长曲线，误差线表示±一个标准差，以及随时间变化的亚群相对丰度。请点击此处查看该图的放大版本。
图3：活性污泥群落结构在24天内的演变。（A）flowCyBar图，其中叠加了箱形图显示各个门控的频率分布，门控按趋势相似性排列；相应的颜色图例（B）；以及NMDS图中的相似性分析，R <0.001（C）。基础图表见补充文件2中的视频序列。相对丰度是使用补充文件1-S6中的门控模板确定的。请点击此处查看该图的放大版本。
图4：工业规模推流式沼气反应器中微生物群落结构的空间和时间异质性。（A）第223天四个采样口I-IV的微生物群落结构比较。（B）第II号采样口从第0天到第384天随时间变化的群落结构比较。为增强可视化效果，后期已去除噪声。细胞门控中检测了250,000个事件（补充文件1-S6）。请点击此处查看该图的放大版本。
图 5：细胞计量直方图图像比较 — CHIC。 CHIC算法的原理通过比较两个分别代表空间异质性和时间异质性的样本进行说明。(i) 在选择两个参数显示（FSC 与 DAPI 荧光）后，从.fcs文件生成CHIC图像。灰度值（0–255）编码每个像素中的事件数量。(ii) 在指定包含细胞的区域后（此处为：200 < x < 4000，200 < y < 2200），生成CHIC子集。(iii) 通过比较子集之间的像素生成异或（XOR）组合图像。无差异对应值为0，以黑色显示；最大差异对应值为200，以白色显示。相应的XOR值通过累加XOR图像中所有像素的灰度值计算得出。(iv) 叠加组合图像通过将子集像素的灰度值相加生成。相应的叠加值通过统计叠加图像中不等于零、即含有信息的像素数量计算得出。(v) 差异性值通过将XOR值除以叠加值得到。这些值是图 6中NMDS图的基础。差异性值和NMDS图均显示空间群落异质性可忽略，而时间群落异质性显著。请点击此处查看该图的放大版本。
图 6：基于 CHIC 的沼气微生物群落样本相似性分析。 由于0天样本的群落结构差异极大，影响分析结果，因此未包含在本图中（见补充文件1-S11）。非度量多维尺度分析（NMDS）图证实了使用CHIC工具得出的假设，即空间异质性较低而时间异质性较高，该假设在图 5中已有说明。请点击此处查看该图的放大版本。
图7：沼气微生物群落的相关性分析。 该矩阵基于补充文件1-S6中主门控模板确定的23个亚群落的相对丰度，采用Spearman秩相关系数计算得出。分析涵盖了来自一年周期内的48个样品，并与有机负荷率（OLR）进行了相关性分析。请点击此处查看该图的高清版本。
图8：废水处理中浮游（P）与污泥（S）群落的相似性分析。 样品取自某实际规模废水处理厂的初沉池（PCL）、活性污泥池（AS）和消化池（DT）（参见补充文件1-S10中的点图）。相对丰度通过补充文件1-S6所示的门控模板确定。这些亚群落丰度还通过flowCyBar工具进行分析，生成CyBar图（补充文件1-S10）和NMDS图（R <0.01）。请点击此处查看该图的高清版本。
图9：纯培养物的固定稳定性。 来自生长曲线实验的 0 h 样品经 15% 甘油固定后，在 -80 °C 下保存 28 天。图中显示了 FSC 与 DAPI 荧光的散点图及对照微球。测量系列中不包含微球（补充文件 1-S3）。在细胞门控中记录了 50,000 个事件（补充文件 1-S6）。请点击此处查看该图的放大版本。
补充文件 1：请点击此处下载该文件。
补充文件 2：请点击此处下载该文件。
讨论
对微生物种群和群落的成功分析需要精确调校的流式细胞仪、合适的细胞参数选择，以及从采样、固定到测量和数据分析的可靠工作流程。所选的细胞参数必须与可用的激发波长相匹配。我们使用并推荐DAPI，它在低浓度下非常敏感，但需要紫外激光激发，而标准流式细胞仪配置通常不包含紫外激光器。其他染料（如SYBR Green I）也可对整个种群或群落进行染色，但通常分辨率较差。我们不建议在微生物群落分析中使用FISH（荧光原位杂交）程序或活性检测方法。这些方法难以量化、验证和控制，因为它们对群落中各个物种的作用尚不明确。只要典型的微生物群落中仍有相当一部分无法获得纯培养，这些方法就无法得到可靠验证。
实验方案中的关键步骤包括取样、固定以及细胞分选。由于某些纯培养物和微生物群落容易聚集成絮状物或附着在样品基质颗粒上，取样过程可能变得复杂。在将样品用于流式细胞分析之前，必须充分分散这些聚集体并分离样品中的细胞，以确保结果的可靠性。本文所展示的样品制备方案经过优化，可实现单细胞分析。在上机检测前需进行最终的50 µm过滤，以去除任何残留的聚集体，防止细胞分选仪的70 µm喷嘴和分析仪的流动池发生堵塞。来自污水处理厂的细胞絮状物尤其丰富、坚固，并对系统功能至关重要。我们研究了一座全规模污水处理厂不同反应池中的浮游态和污泥相关的微生物群落，以验证所建立的实验方案。结果表明，形成污泥的细胞聚集体被明显分散，且群落组成保持稳定。此外，在所采集的三个反应池中，浮游态与污泥相关的微生物群落均表现出显著的相似性（图8，补充文件1-S10）。这些结果通过对比新鲜样品、甲醛处理样品、甲醛与乙醇固定样品以及分选后样品的16S rDNA扩增子测序得到了验证10。然而，某些极端复杂的环境样品，例如致密的生物膜或以紧密链状生长的细菌，可能无法有效分散。土壤样品尤其具有挑战性，因为其中普遍存在的颗粒会在直方图中出现，并因其数量庞大而掩盖目标细胞信号。在此类情况下，需采用传统的测序方法进行分析。
在设计实验之前，应测试每组新样品的固定稳定性，以确保结果的有效性。良好的固定稳定性还允许在同一天对多个时间点的样品进行混合染色和检测。此外，在实验结束并完成最终评估后，仍可对关键时间点进行重复测量和回溯性细胞分选。纯培养物的固定稳定性已验证可持续28天（图9）。对于涉及样品运输的现场实验，应测试更长时间的固定稳定性（本研究中，活性污泥群落为60天，沼气群落为195天，见补充文件1-S9）。
染色通常不会出现问题，但需要使用生物学标准品进行对照，以便应用生物信息学分析工具。我们使用了模拟菌株E. coli BL21 (DE3)，该菌株按照ASC方案固定，并作为每批染色实验的储备标准品。
除了 DAPI 之外，SYBR Green I 近年来已成功应用于解析微生物群落长达数年14,23,24,25,26。SYBR Green I 可在在线模式下利用活细胞将群落划分为高核酸和低核酸亚群（HNA 和 LNA）。然而，DAPI 对 DNA 的结合更具特异性，能够在一份样本中区分出超过 50 个亚群，但染色前需要进行固定步骤。
细胞分选是该方法的一个显著优势，如果某些亚群具有进一步研究价值，可应用此技术。需要强调的是，戊二醛（仅处理30分钟）、乙醇处理或DAPI染色10均未对后续的16S扩增子测序产生负面影响。固定和染色步骤对亚群宏基因组分析可能产生的影响仍有待验证。
当使用能够以虚拟的单细胞水平解析群落特征，并将这些特征与非生物参数关联起来的生物信息学工具时，可以独立于分选方法获得大量关于群落功能和趋势动态的信息。
最近，已开发出多种新的生物信息学评估工具，这些工具对于 SYBR Green I 和 DAPI 方法均具有实用价值，可用于解析流式细胞术群落图谱。其中包括 FlowFP27、本研究所采用的软件包（flowCHIC20、flowCyBar28）、基于淡水群落建立的去卷积模型29，以及一种可根据生理特征区分菌株的工具30。此外，细胞计量法可测定群落多样性25，甚至可通过在线工具追踪微生物群落的稳定性特征10。
因此，在快速评估微生物群落及可能的非生物参数相关性方面，流式细胞术分析具有显著优势。然而，该方法仍存在局限性。由于依赖经验进行设门操作，流式细胞分析无法真正通过flowCyBar工具实现在线应用。此外，开发定制化且易于使用的流式细胞仪将极大推动流式细胞术在微生物组分析中的广泛应用。目前已有研究迈出了朝向这一方向的初步步伐28。
可以预见，微生物流式细胞术在微生物生态学中的未来应用前景广阔，因为它能够在细菌世代时间范围内实现高频监测，并且已有研究表明，生态学范式适用于流式细胞术数据5,10。该方法在自然环境的常规筛查中非常有用，例如瑞士强制性的饮用水检测31。它也可作为医学应用中的有力工具，用于人类15或动物32微生物组筛查。此外，生物信息学的最新进展可能使微生物流式细胞术成为受控微生物系统过程控制中的集成传感器。微生物群落流式细胞术还为细胞分选提供了筛选工具，从而能够对特定群落子集进行更高分辨率的基因组研究。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们衷心感谢 Michael Jahn 和 Yuting Guo 分别提供了纯培养和活性污泥群落的研究方法与数据集。我们进一步感谢 Katrin Mörters 对沼气群落样品的分析工作。本研究由德国联邦食品和农业部（BMEL）委托的可再生原料代理机构（FNR，项目 Biogas-Fingerprint 编号 22008313）、德国联邦经济和能源部（BMWi）的中小企业中央创新计划（ZIM）（INAR-ABOS，编号 16KN043222）、德国联邦环境基金会（DBU，项目“按需从啤酒厂和污水处理厂残余物中生产磷酸盐肥料”编号 33960/01-32）、德国联邦教育与研究部（BMBF）（资助编号 FZK 03XP0041G）以及亥姆霍兹协会项目导向资助（POF III R31 主题 3 生物能源）提供资金支持。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Milli-Q系统Synthesis A10 | Merck, Darmstadt, (GER) | ||
| BioPak超滤柱 | Merck, Darmstadt, (GER) | CDUF BI0 01 | |
| MoFlo Legacy细胞分选仪 | Beckman-Coulter, Brea, California (USA) | ||
| Innova 90C | Coherent, Inc , Santa Clara (USA) | 334 nm - 364 nm, 100 mW | |
| Innova 70C | Coherent, Inc , Santa Clara (USA) | 488 nm, 400 mW | |
| Genesis MX488-500 STM OPS | Coherent, Inc , Santa Clara (USA) | 488 nm, 400 mW | |
| Xcyte CY-355-150 | Lumentum, Milpitas, California, USA | 355 nm, 150 mW | |
| 光电倍增管R928和R3896 | Hamamatsu Photonics, Hamamatsu City (Japan) | ||
| Summit 4.3软件 | Beckman-Coulter, Brea, California (USA) | ||
| 1 µm FluoSpheres | Molecular Probes, Eugene, Oregon (USA) | F8815 | 350/440 蓝色荧光 |
| 2 μm YG FluoSpheres | Molecular Probes, Eugene, Oregon (USA) | F-8827 | 505/515 黄绿色荧光微球 |
| 0.5 μm Fluoresbrite BB 羧基微球 | PolyScience, Niles, Illinois (USA) | 18339 | 360/407 |
| 1 μm Fluoresbrite BB 羧基微球 | PolyScience, Niles, Illinois (USA) | 17458 | 360/407 蓝色荧光 |
| 1 µmYG FluoSpheres | Molecular Probes, Eugene, Oregon (USA) | F-13081 | 505/515 黄绿色荧光微球 |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich, St. Louis (USA) | CAS no. 7778-77-0 | |
| KCl | Sigma-Aldrich, St. Louis (USA) | CAS no. 7447-40-7 | |
| Cyflow Space | Sysmex Corporation, Kobe (Japan) | ||
| UV激光器Genesis CX | Coherent, Inc , Santa Clara (USA) | 355 nm, 150 mW | |
| H6779-32系列光电倍增管 | Hamamatsu Photonics, Hamamatsu City (Japan) | ||
| FloMax软件 | Sysmex Partec GmbH, Görlitz, (GER) | ||
| 所有光学滤光片 | Carl Zeiss, Jena (GER) | ||
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich, St. Louis (USA) | CAS no. 7778-77-0 | |
| KCl | Carl Roth, Karlsruhe (GER) | 6781.3 | |
| FlowJo 10.0.8r1 | FlowJo, LLC, Ashland, Oregon (USA) | 构建编号：42398 | |
| R软件v.3.4.3 | R Core Team | ||
| flowCHIC | http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/flowCHIC.html | ||
| flowCyBar | http://www.bioconductor.org/packages/devel/bioc/html/flowCyBar.html |
参考文献
- Xu, X., Hui, D., King, A. W., Song, X., Thornton, P. E., Zhang, L. Convergence of microbial assimilations of soil carbon, nitrogen, phosphorus, and sulfur in terrestrial ecosystems. Scientific Reports. 5 (1), 17445(2015).
- Fathepure, B. Z. Recent studies in microbial degradation of petroleum hydrocarbons in hypersaline environments. Frontiers in Microbiology. 5, 173(2014).
- Alshehrei, F. Biodegradation of Synthetic and Natural Plastic by Microorganisms. Journal of Applied & Environmental Microbiology. 5 (1), 8-19 (2017).
- Sarria, S., Kruyer, N. S., Peralta-Yahya, P. Microbial Synthesis of medium-chain chemicals from renewables. Nature Biotechnology. 35 (12), 1158-1166 (2017).
- Günther, S., Faust, K., Schumann, J., Harms, H., Raes, J., Müller, S. Species-sorting and mass-transfer paradigms control managed natural metacommunities: Species-sorting and mass-transfer paradigms in metacommunities. Environmental Microbiology. 18 (12), 4862-4877 (2016).
- Lambrecht, J., Cichocki, N., Hübschmann, T., Koch, C., Harms, H., Müller, S. Flow cytometric quantification, sorting and sequencing of methanogenic archaea based on F420 autofluorescence. Microbial Cell Factories. 16 (1), 180(2017).
- Huttenhower, C., et al. Structure, function and diversity of the healthy human microbiome. Nature. 486 (7402), 207-214 (2012).
- Lloyd-Price, J., et al. Strains, functions and dynamics in the expanded Human Microbiome Project. Nature. 550, 61-66 (2017).
- Goodwin, S., McPherson, J. D., McCombie, W. R. Coming of age: ten years of next-generation sequencing technologies. Nature Reviews Genetics. 17 (6), 333-351 (2016).
- Liu, Z., et al. Ecological Stability Properties of Microbial Communities Assessed by Flow Cytometry. mSphere. 3 (1), e00564-e00517 (2018).
- Koch, C., Günther, S., Desta, A. F., Hübschmann, T., Müller, S. Cytometric fingerprinting for analyzing microbial intracommunity structure variation and identifying subcommunity function. Nature Protocols. 8 (1), 190-202 (2013).
- Koch, C., Fetzer, I., Schmidt, T., Harms, H., Müller, S. Monitoring Functions in Managed Microbial Systems by Cytometric Bar Coding. Environmental Science & Technology. 47 (3), 1753-1760 (2013).
- Lefort, T., Gasol, J. M. Short-time scale coupling of picoplankton community structure and single-cell heterotrophic activity in winter in coastal NW Mediterranean Sea waters. Journal of Plankton Research. 36 (1), 243-258 (2014).
- Besmer, M. D., Epting, J., Page, R. M., Sigrist, J. A., Huggenberger, P., Hammes, F. Online flow cytometry reveals microbial dynamics influenced by concurrent natural and operational events in groundwater used for drinking water treatment. Scientific Reports. 6, 38462(2016).
- van Gelder, S., et al. A cytometric approach to follow variation and dynamics of the salivary microbiota. Methods. 134, 67-79 (2018).
- Jehmlich, N., et al. Advanced tool for characterization of microbial cultures by combining cytomics and proteomics. Applied Microbiology and Biotechnology. 88 (2), 575-584 (2010).
- Jahn, M., et al. Accurate Determination of Plasmid Copy Number of Flow-Sorted Cells using Droplet Digital PCR. Analytical Chemistry. 86 (12), 5969-5976 (2014).
- Koch, C., Müller, S. Personalized microbiome dynamics - Cytometric fingerprints for routine diagnostics. Molecular Aspects of Medicine. 59, 123-134 (2018).
- Jahn, M., Vorpahl, C., Hübschmann, T., Harms, H., Müller, S. Copy number variability of expression plasmids determined by cell sorting and Droplet Digital PCR. Microbial Cell Factories. 15 (1), 211(2016).
- Koch, C., Fetzer, I., Harms, H., Müller, S. CHIC-an automated approach for the detection of dynamic variations in complex microbial communities. Cytometry Part A. 83 (6), 561-567 (2013).
- Günther, S., Müller, S. Facilitated gate setting by sequential dot plot scanning: Facilitated Gate Setting by Sequential Dot Plot Scanning. Cytometry Part A. 87 (7), 661-664 (2015).
- Guo, Y., Baumgart, S., Stärk, H. -J., Harms, H., Müller, S. Mass Cytometry for Detection of Silver at the Bacterial Single Cell Level. Frontiers in Microbiology. 8, 1326(2017).
- Gasol, J. M., Del Giorgio, P. A. Using flow cytometry for counting natural planktonic bacteria and understanding the structure of planktonic bacterial communities. Scientia Marina. 64 (2), 197-224 (2000).
- Gasol, J. M., Morán, X. A. G. Flow Cytometric Determination of Microbial Abundances and Its Use to Obtain Indices of Community Structure and Relative Activity. Hydrocarbon and Lipid Microbiology Protocols. , 159-187 (2016).
- Props, R., Monsieurs, P., Mysara, M., Clement, L., Boon, N. Measuring the biodiversity of microbial communities by flow cytometry. Methods in Ecology and Evolution. 7 (11), 1376-1385 (2016).
- Kinet, R., et al. Flow cytometry community fingerprinting and amplicon sequencing for the assessment of landfill leachate cellulolytic bioaugmentation. Bioresource Technology. 214, 450-459 (2016).
- De Roy, K., Clement, L., Thas, O., Wang, Y., Boon, N. Flow cytometry for fast microbial community fingerprinting. Water Research. 46 (3), 907-919 (2012).
- Koch, C., Harnisch, F., Schröder, U., Müller, S. Cytometric fingerprints: evaluation of new tools for analyzing microbial community dynamics. Frontiers in Microbiology. 5, 273(2014).
- Amalfitano, S., Fazi, S., Ejarque, E., Freixa, A., Romaní, A. M., Butturini, A. Deconvolution model to resolve cytometric microbial community patterns in flowing waters: Deconvolving Cytometric Microbial Subgroups. Cytometry Part A. 93 (2), 194-200 (2017).
- Buysschaert, B., Kerckhof, F. -M., Vandamme, P., De Baets, B., Boon, N. Flow cytometric fingerprinting for microbial strain discrimination and physiological characterization: Flow Cytometric Fingerprinting. Cytometry Part A. 93 (2), 201-212 (2017).
- Besmer, M. D., et al. Laboratory-Scale Simulation and Real-Time Tracking of a Microbial Contamination Event and Subsequent Shock-Chlorination in Drinking Water. Frontiers in Microbiology. 8 (1900), (2017).
- Zimmermann, J., et al. High-resolution microbiota flow cytometry reveals dynamic colitis-associated changes in fecal bacterial composition: Technical comment. European Journal of Immunology. 46 (5), 1300-1303 (2016).
重印与许可
标签
