微生物动力学的特征-基于流式细胞仪的工作流从纯文化到自然群落

Summary

流细胞分析已证明对研究纯文化和监测微生物群落动力学有价值。我们提供了三个全面的工作流程, 从抽样到数据分析, 到纯文化和复杂社区, 在清晰的介质中, 以及在挑战性的矩阵, 分别。

Abstract

对纯文化的调查和微生物群落动态监测对于了解和控制微生物驱动的自然生态系统和技术应用至关重要。下一代测序方法被广泛地用于解决微生物, 但它们通常是资源和时间密集型的, 提供的主要是质量信息。流细胞菌群分析不受这些缺点的影响, 可以提供相对子社区丰度和绝对细胞数的在线。虽然它不提供直接的系统系统的信息, 它可以提高分析的深度和解决的排序方法。流式细胞术在研究和常规设置中与医学应用形成鲜明对比, 目前仍未广泛应用于微生物菌群分析。缺少样本准备和数据分析管道的信息可能会为面临微生物分析挑战的研究人员带来进入障碍, 这通常是教科书流式细胞术的应用。在这里, 我们分别为纯文化、复杂社区在具有挑战性的矩阵中的清晰介质和复杂社区提供三个综合工作流。我们描述各自的抽样和固定程序和优化染色协议的各个样本集。本文以复杂的研究为中心, 以应用为重点的平台顶部设备, 描述了细胞分类程序, 并提出了数据分析包, 细胞分析。此外, 我们还提出了重要的实验控制, 并将所提出的工作流应用于相应的样本集。

Introduction

微生物在人类生活的许多方面起着至关重要的作用。它们是行星碳、氮、磷和硫循环¹的主要生物驱动因素, 其作用是降解^2、3以及在各种工业 (如废水处理) 中合成⁴用于生物催化剂。⁵或生物技术⁶。它们甚至构成了人类的微生物菌群, 直接影响到人类的健康和新陈代谢^7,8。因此, 如果我们的目标是充分理解和操纵这些系统, 那么关于微生物的结构、功能和动态行为的信息, 以响应它们的直接环境是必要的。下一代测序技术是解决菌群结构和功能⁹的既定方法。但是, 对内部数据的分析和评估不能产生量化信息, 而且成本高昂, 耗时, 而且在性能走廊内也没有准备好提供现场结果。有些细菌在1小时以下显示世代时间并且导致经常改变的社区结构在某些环境¹⁰。在这样的动态下, 使用排序方法将超过大多数科学实验室的财务和人力能力。

相比之式细胞术可以提供类似于数据的社区指纹 , 同时保留更高的时间、劳动和成本效率。在这里, 我们提出的流动细胞技术能够遵循微生物群落动力学在网上的单一细胞水平。与本研究不同, 流式细胞术并不提供功能基因的系统进化隶属关系或信息, 而是提供定量的细胞数量。利用流式细胞仪, 可以将微生物群落分解为子社区, 具有明显的光散射和荧光特性 (前向散射 (FSC) 和侧散射 (SSC), 分别提供细胞大小和粒度的指示)。所提出的方法主要利用细胞大小和与某些细胞类型和生理 (生长) 状态相关的 DNA 数量相关信息。dna 含量的量化使用紫外兴奋 4 ', 6-diamidino-2 '-苯基吲哚 (DAPI) 染料, 它绑定到一个 T 丰富的地区的 DNA, 甚至可以解决不同的染色体水平。通过结合 DAPI 荧光和 FSC 超过50子社区可以区分和监测, 以改变丰度随着时间的推移¹¹。子社区丰度变化可与微环境环境的变化相关, 如 pH 值和产品效价¹², 具有全球参数, 如天气^13,14, 或肠道或唾液的情况下微生物与某些医疗治疗¹⁵。这些相关性揭示了关键子社区负责在整个社区的新陈代谢网络中的特定功能。然后, 通过改变周围的微环境, 或者为随后的测序¹⁵或蛋白质组调查¹⁶进行排序, 可以特别促进或抑制关键子社区。

然而, 微生物群落流式细胞术还没有得到广泛的建立, 因为大量的流动细胞装置能够正确地解决微生物种群或群落。此外, 缺乏经验、社区分析管道和有效的数据评估可能会给面临微生物分析挑战的研究人员带来进入障碍。我们已经建立了全面的工作流程来解决这些问题。为了说明它们的一般适用性, 我们将在三示范样本集 (补充文件 1-S1) 上展示它们, 即 i) 一种纯文化 (PC), 用于在明确的培养基中生长的生物技术应用 (单胞菌恶臭KT 2440 上葡萄糖), ii) 在透明介质 (合成废水活性污泥群落 (ASC)) 和 iii) 的一个复杂的实验室社区, 从一个稠密基质 (BC) 的天然环境中的一个复杂的社区 (玉米青贮)。

几个因素影响了每个样本集的协议选择。深冻放弃使用有毒化学品, 但主要限于实验室环境, 因为使用液态氮气的冲击霜。甲醛稳定和随后的乙醇固定允许散装取样, 不需要整除准备, 并已证明是稳定的长期。然而, 富含蛋白质的样品如人唾液¹⁵可能是问题, 因为蛋白质絮凝体, denaturized 由甲醛, 可能导致不赞同的信号到噪声比率。样品干燥将花费多数时间 (大约 1 h 在一共) 过程在这个比较, 但可以在现场执行, 不用毒物化学制品。它在管子中产生稳定的颗粒, 可以很容易地运送而不冷却或额外的危险预防措施。此外, 还提出了许多替代固定方法¹¹。在引入新的样本集时, 我们强烈建议测试不同协议的分辨率和固定稳定性。

我们使用了两个不同的流 cytometers 来分析集合: i) 一个高度复杂和昂贵的, 研究中心的细胞分拣器和 ii) 一个应用重点的台顶分析仪, 似乎更适合现场应用⁵。BC 用工作台顶部分析仪测量, 而 PC 和 ASC 用细胞分拣机测量。分析三示范样本集需要不同的程序, 以优化重现性, 样品稳定性和工作流程的方便。下面的协议将指定三不同系统的各部分。

Protocol

1. 取样和固定

1. 纯净的文化: 深冻^15,17
   1. 2毫升的细胞悬浮, 离心机5分钟室温 (RT) 和 5000 x g和丢弃上清。
      注: 取样细胞悬浮在补充文件 1-S1 中描述。
   2. 并用重悬1毫升磷酸盐缓冲盐水中的细胞 (PBS; 6 毫米 Na₂HPO₄, 1.8 毫米 NaH₂PO₄, 145 毫米氯化钠与双蒸馏 H₂O, pH 7.2) 另外包含 15% (v/v) 甘油作为低温保护剂。
   3. 在冰上孵育10分钟, 在液氮中进行休克冷冻, 随后贮存在-80 摄氏度。
      注意: 协议可以在这里暂停。样品稳定至少一个月。
2. 活性污泥群落: 甲醛稳定 + 乙醇固定^5,10,18
   1. 采取4毫升的细胞悬浮液, 离心机为20分钟15摄氏度和 3200 x g , 并丢弃上清。
      注: 取样细胞悬浮在补充文件 1-S1 中描述。
   2. 在 PBS 中加入4毫升2% 甲醛, 在 RT 中孵化30分钟。
      1. 从多聚甲醛中制备8% 甲醛库存溶液, 以避免添加到液体中的甲醛中的保存添加剂甲醇。添加4克多聚甲醛到50毫升 PBS 在70摄氏度。添加大约125µL 10 米氢氧化钠溶液。搅拌直到多聚甲醛完全溶解, 然后让它冷却到 RT. 将 pH 值调整为 7.0, 约100µL 37% HCl. 冻结甲醛溶液在15毫升整除数储存。不要使用解冻整除数长于10天。
         注意: 由于有毒和致突变的特性, 甲醛需要小心处理和处置。在处理的时候总是戴手套。使用排气罩, 同时溶解多聚甲醛, 以防止接触有毒烟雾。
   3. 离心样品10分钟在15°c 和 3200 x g和放弃上清。
   4. 并用重悬样品在4毫升70% 乙醇并且存放在-20 °c。
      注意: 协议可以在这里暂停。样品稳定至少2月。根据样品的性质, 1.2.1 中的离心步骤也可以在4摄氏度的10分钟内进行, 以节省时间。
3. 沼气群落: 干燥
   1. 使用一个修剪的1000µL 吸管提示200µL 的粘性沼成2毫升管。
   2. 添加1700µL 的 PBS 缓冲器并彻底混合。
   3. 将管置于35赫和 80 W 的超声波浴中, 有效输出功率为1分钟, 以解散大细胞聚集体和分离细胞, 粘附植物细胞残留物。
   4. 彻底混合样品, 通过50µL 滤网过滤样品, 将滤液分成四整除数约400µL。
      注意: 在这一点上准备整除数提供了两大优势。首先, 较小的体积更容易和更快地脱水机械 (离心机) 和热 (干燥), 但从通常厚的沼气污泥抽样的小体积是非常有挑战性的。第二, 额外的样本可用于后续的细胞排序, 备份测量或控制。
   5. 离心整除数两次为10分钟在10°c 和 4000 x g并且完全地放弃上清液两次充分地机械脱水样品尽可能。
   6. 在加热的真空离心机中干燥样品40分钟, 在35摄氏度, 约-97 帕和 2500 x g , 以创建稳定的小球。把小球储存在4摄氏度的黑暗中。
      注意: 协议可以在这里暂停。颗粒稳定至少6月。

2. 染色

注: DAPI 染色已证明提供高分辨率的斑点情节, 因此特别有利, 当分析社区。染色液中的 DAPI 浓度需要优化, 以保证细胞门的荧光强度远远高于噪音水平, 但低于珠子。优化取决于仪器的灵敏度和珠的选择, 可以不同的样本集由于含碳微生物的含量, 并应一般测试新引进的样本集。建议设置的0.24 µM DAPI 和1µM DAPI 之间的浓度测试。其他染料可能用于特定的应用。当绝对细胞计数准确性在指纹分析 (补充文件 1-S1)^6,15的优先级时, 建议使用 SYBR 绿色 I 染色协议。它包括较少的样品处理和离心步骤, 并适用于固定和重要的细胞。使用生命细胞进一步减少样品处理步骤通过跳过固定, 因此只需要一个离心的细胞收割。这减少了潜在的细胞损失, 因此系统测量误差。在所有以下步骤中使用的 PBS、通透缓冲器和染色液应通过0.2 µm 注射器过滤器进行过滤, 以减少样品中的额外颗粒载荷。建议将含有大肠杆菌 BL21 ( DE3) 的一个样品染色为生物标准。

1. 纯文化
   1. 除霜样品, 离心机5分钟在 RT 和 5000 x g和放弃上清。
   2. 并用重悬的细胞颗粒在冰冷 PBS 中重复吹打, 并调整 OD_700nm到 0.035 (路径长度_试管= 0.5 厘米)。
   3. 准备细胞染色。
      1. 离心机1毫升调整细胞悬浮5分钟在 RT 和 5000 x g和放弃上清。
      2. 并用重悬1毫升的通透缓冲液中含有0.3 米柠檬酸和4.1 毫米 Tween20 的细胞, 并彻底混合。
      3. 在冰上孵化10分钟的样品, 为随后的染色创造渗透性细胞膜。
      4. 离心样品5分钟在 RT 和 5000 x g 和放弃上清。
   4. 添加1毫升的染色液含有0.68 µM DAPI 417 毫米 na₂HPO₄/NaH₂PO₄缓冲器 (289 毫米 Na₂HPO₄, 128 毫米 NaH₂PO₄与双蒸馏 H₂O, pH 7), 混合和在黑暗中在 RT 中孵化至少15分钟。
      注意: 精确 OD 调整对于保证可比测量是至关重要的, 因为如果 DAPI 浓度保持恒定, DAPI 荧光会随细胞密度而变化。清液应小心去除, 因为一个普遍脆弱的颗粒, 以防止细胞损失。
      注意: 处理和处置 DAPI 由于其诱变性质。
2. 活性污泥群落
   1. 将固定样品彻底混合, 并将0.6 毫升转移到玻璃管中。添加1.4 毫升 PBS 和油脂实验10分钟的 RT, 如步骤1.3.3 所述。离心样品10分钟在4°c 和 3200 x g 和去除上清。添加2毫升 PBS, 并彻底混合。油脂实验5分钟。
   2. 用 PBS 调整外径_700nm至 0.035 (路径长度_试管= 0.5 厘米)。
   3. 准备细胞染色。
      1. 离心样品10分钟在4°c 和 3200 x g和去除上清。
      2. 并用重悬1毫升的通透缓冲液中含有0.11 米柠檬酸和4.1 毫米 Tween20 的细胞, 并彻底混合。
      3. 孵育20分钟的 RT, 以创建渗透细胞膜, 随后染色。
      4. 再离心样品10分钟在4°c 和 3200 x g和去除上清。
   4. 添加2毫升的染色液含有0.68 µM DAPI 和417毫米 Na₂HPO₄/NaH₂PO₄缓冲, 彻底混合和孵化至少60分钟在 RT 在黑暗中。
      注: 建议使用玻璃管, 因为某些微生物往往坚持塑料管壁, 可能会丢失的过程中。孵化过夜也是可能的, 通常简化实验室程序。
      注意: DAPI 由于其诱变性, 需要小心处理和处置。
3. 沼气社区
   1. 在 PBS 中悬浮干细胞颗粒。
      1. 添加800µL 的 PBS, 彻底混合, 让颗粒浸泡15分钟。
      2. 用1000µL 吸管吸入液相, 用吸管尖端将浸泡的小球移到管壁的圆柱形部分。它应该粘在那里。
      3. 将吸管尖端移动到圆形运动中, 沿管壁挤压颗粒。
      4. 将所产生的泥浆从管壁上清洗, 将液相从管壁上的吸管尖处配药。
      5. 将悬浮液吸气并悬浮在三次吸管中搅拌。
   2. 用 PBS 清洗样品两次。
      1. 离心机为5分钟, 在10摄氏度和 4000 x g , 并丢弃上清。
      2. 添加1500µL 的 PBS, 并彻底混合。
      3. 重复上述两个步骤。
   3. 按照步骤1.3.3 中所述, 将管置于超声波浴中1分钟, 随后, 通过50µL 滤网过滤器将每个样品过滤成一个单独的玻璃管。
   4. 稀释2毫升的样品到 OD_700nm 0.035 (路径长度_试管= 0.5 cm) 与 PBS。
   5. 准备细胞染色, 如上文步骤2.2.3 所述。
   6. 添加2毫升的染色液含有0.24 µM DAPI 和417毫米 Na₂HPO₄/NaH₂PO₄缓冲, 彻底混合和孵化夜间在 RT 在黑暗中。
      注意: DAPI 由于其诱变性, 需要小心处理和处置。

3. 测量

注: 用两种不同的流 cytometers 分析了示范样品集。对 PC 机和 ASC 进行了比较复杂、高度可调、易于自定义的研究中心单元分拣。对于 PC 分析, 该装置配备了一个激光设置, 如前出版物¹⁶所述, 短蓝色 (488 nm, 400 兆瓦) 和紫外线 (334–364 nm, 100 兆瓦) 氩离子激光器。对于 ASC 分析, 安装了新的蓝色 (488 nm, 400 兆瓦) 和紫外线 (355 nm, 150 兆瓦) 半导体激光器。在这两种情况下, 蓝激光诱导的 FSC (带通滤波器 488 nm 5 nm, 中性密度滤波器 1.9) 和 SSC (带通滤波器 488 nm 5 nm, 中性密度滤波器 1.9, 触发器)。这些光学特性分别与细胞大小和细胞密度有关。紫外激光器激发了 DAPI 荧光 (带通滤波器 450 nm 32.5 nm), 以量化细胞 DNA 含量。射流系统运行在 56 psi (3.86 巴) 与样品超压在最大 0.3 psi 和70微米喷嘴。所有参数都记录为峰值高度, 而不是峰值区域, 以提高测量分辨率。对沼气群落进行了长期监测, 采用了较不复杂、流量试管的台顶分析仪。采用紫外半导体激光器 (355 nm, 50 兆瓦) 诱导 FSC (带通滤波器 355 nm 5 nm) 和 SSC (带通滤波器 355 nm 5 nm, 触发) 信号, 激发 DAPI 荧光 (带通滤波器 455 nm C)。两种装置的鞘缓冲用水均采用双蒸馏和0.1 µm 过滤。用于稀释样品的 PBS 应通过0.2 µm 注射器过滤器过滤, 尽可能减少测量中的粒子噪声。

1. 纯文化与活性污泥群落
   1. 启动仪器, 激光, 计算机和软件, 准备样品分析。
      1. 打开激光器, 运行15分钟, 达到工作温度, 确保光束稳定。
      2. 填充鞘罐与10x 鞘缓冲器 (19 毫米₂PO₄, 38 毫米氯化钾, 166 毫米 Na₂HPO₄, 1.39 米氯化钠与双蒸馏 h₂o) 稀释的双蒸馏 h 2 o 为0.2x 工作解决方案 (用于细胞排序: 0.5x工作解决方案)。
      3. 主要的射流系统与 56 psi 的压力和垃圾箱约 6 psi 真空。
      4. 在反冲模式下运行该仪器最少15分钟, 以冲洗样品口、油管和喷嘴。
   2. 用标准的珠子校准。
      1. 准备在线性 (1 微米蓝 + 2 微米黄绿色荧光) 和对数范围 (0.5 微米和1微米蓝色荧光) 的校准珠混合。从原库存悬浮液中稀释珠悬浮物, 达到同等浓度。
      2. 通过操纵喷嘴和激光光学位置, 在线性范围内对仪器进行预校准, 连续测量线性珠混合, 并将珠峰与预设校准模板配合。
      3. 切换到对数范围, 并连续测量对数珠混合。将珠峰与预设校准模板配合, 微调仪器的硬件。使用光电倍增管 (并联机床) 的增益设置对珠位进行最后调整。
      4. 检查仪器噪声的位置, 并可能调整它以适应校准模板。
         注: 需要在测量项目之前准备一个固定的校准模板, 以确定珠子的位置, 并且不能更改 (参见补充文件 1-S4)!仪器噪声可以由样品中的微粒或并联机床的电子噪声引起, 并在一定程度上记录下来。不建议通过增益调整或绘图偏移完全隐藏噪声。噪声事件的丰度和位置可以是一个有价值的信息来源, 因此应该包含在原始数据中。非常微粒密集的样品可能需要随后去除噪声为密谋和数据分析原因。在测量日定期控制校准时间, 以保证仪器的稳定性, 从而使样品可比性。
   3. 根据1.2 所述的 ASC 协议, 测量含有 2.1.4 (DAPI 染色大肠杆菌 BL21 (DE3) 中所述的生物标准的样本, 在固定阶段 (16 小时) 内取样和固定。检查峰值位置与其预设的校准模板 (请参阅补充文件 1-S5)。
      注: 每个样品池的生物标准的常规染色和测量也将作为染色程序的内部控制。如果使用珠子校准设备, 并且生物标准不符合预设的校准模板, 则可能需要重复染色程序。
   4. 样品采集。
      1. 运行染色液10分钟冲洗样品的端口和管, 确保 DAPI 荧光在后续样品中的稳定性。
      2. 在测量前用50微米滤网过滤染色样品, 以防止细胞仪喷嘴或流毛细管堵塞。
      3. 添加对数珠混合到样品, 以监测仪器的稳定性, 并提供了一个追溯校准检查的可能性。样品应包含两个珠门的每一个1000到2500事件。
      4. 在新样本集的第一次试验测量过程中, 在仪表软件中创建一个单元格门。该门应包含染色的细胞, 并排除噪音和珠子。
      5. 将样品和测量的最大速度混合3000事件的^-1 , 直到25万细胞 (社区) 或5万细胞 (纯文化) 检测到细胞门内。
         注意: 这些单元格计数是根据示例集的体验选择的。不同的数字可能被用来改变测量效率和检测子社区的两个方向的低丰度之间的权衡。
         故障排除: 在喷嘴内被困的气泡会导致珠子和细胞位置的突然测量变化。这就需要去除和清洗喷嘴和冲洗的射流系统与鞘缓冲。在重新装入喷嘴后需要重新调整仪器 (从步骤3.1.2 开始)。
      6. 在关闭和切换样品前, 将仪器与鞘缓冲器彻底反冲。
2. 沼气社区
   1. 启动仪器, 激光, 计算机和软件, 准备样品分析。
      1. 反冲至少6毫升的鞘缓冲 (双蒸馏 H₂O) 通过油管和样品端口进入松散连接管使用的 "鞘液素数" 功能的仪器软件。
      2. 测量双蒸馏 H₂O 在5µL s^-1冲洗射流系统直到少于200事件的^-1被检测在规则流速0.5 µL s^-1。
   2. 校准系统。
      1. 准备珠混合 (0.5 微米和1微米蓝色荧光)。从原库存溶液中稀释珠悬浮液, 达到同等浓度。
      2. 通过操纵流试管和激光光位置, 连续测量对数₄范围内的珠混合, 并将珠峰与预设校准模板相匹配。用并联机床的增益设置对珠位进行最后调整。
   3. 按照步骤3.1.3 中描述的生物标准控制校准。
   4. 样品采集。
      1. 在 PBS 1600 µL 中稀释400µL 的染色样品, 测量并监测事件计数, 进行浓度测试。
         注: 其他样品来源可能需要调整稀释率。事件计数不应超过1200事件 s^-1中的粒子丰富的样本, 以防止在前散射的分辨率损失 (补充文件 1-S2 中的负面例子)。纯文化可以用多达2000个事件的^-1来衡量。
      2. 在第一次试验测量过程中, 在仪器软件中创建一个单元门。该门应包含染色的细胞和排除噪音和珠子。
      3. 根据浓度测试的结果稀释样品, 运行在最大1200事件的^-1 , 并添加珠混合到样品监测仪器的稳定性, 并提供了一个追溯校准检查的可能性。样品应包含两个珠门的每一个1000到2500事件。
      4. 混合和测量样本, 直到25万细胞 (社区) 或5万细胞 (纯文化) 检测在细胞门。
      5. 关闭和切换样品前, 用双蒸馏 H₂O 彻底冲洗仪器。

4. 细胞分类

注意: 单元格排序过程需要额外的仪器设置, 并根据已发布的协议¹²执行。

1. 如步骤 3.1. 1-3. 1.3 所述, 启动和校准仪器, 但使用鞘缓冲器的0.5x 工作溶液。
2. 设置 dd 频率和 dd 振幅以发现水滴断裂。
3. 安装偏转板, 对其进行充电, 并决定2或4路排序模式。
4. 使用2微米黄绿色珠子进行内部跌落延迟校准, 以定义从审问点 (激光命中单元) 到附加到流的最后一滴水的时间跨度。
5. 在玻璃滑梯上分类6乘以20颗珠子, 用显微镜计数, 以验证延时校准。
6. 准备分拣门模板。
7. 使用 "单下一滴模式: 最高纯度 99%", 速度不高于2500总事件^-1 , 一次在最大4个门中排序50万个单元格 (4 路排序模式)。
8. 通过离心 (2万 x g, 6 °c, 25 分钟) 来收获细胞, 并将颗粒冻结在-20 摄氏度, 以供以后的 DNA 分离和测序。
   注意: 避免对门中的单元格进行分类, 相对丰度小于 5%, 因为排序时间与相对丰度成反比。在单元分拣手册中详细描述了各个步骤。所需的单元号严重依赖于各自的用例和提取协议。已经应用了许多方法: ddPCR (1000 细胞^17,19), 16S rDNA 或 mcrA 扩增子测序 (50万细胞^6,10,15) 和蛋白质组学 (最多 1.1 x 10⁷个细胞^16,17)。由于排序的子社区中的多样性较低, 因此在结合 metagenomics 方法时, 单元格排序将特别有利。
   注意: 在分拣过程中, 由于电压过高, 请勿触摸偏转板。

5. 数据分析

注: 细胞测量结果为 "流式细胞仪标准". fcs 数据文件, 数据结构一般一致。然而, 不同的细胞仪制造商使用略微适应的版本和旧的仪器可能早在2010引进最新的 FCS 标准3.1。这可能导致点图缩放问题, 从而防止与不同仪器收集的结果进行直接比较。然而, 各个数据点总是存储在矩阵的行中, 在不同的列中有各自的散射和荧光强度值。所提出的微生物菌群分析管道采用独特的细胞大小和 DNA 含量来描述微生物子社区。这些参数与 fsc 和 DAPI 荧光通道强度 (细胞分选器: FL-4, 分析仪: FL-1) 相关, 在二维 FSC 和 DAPI 荧光图中可视化后产生子社区簇。这些点图允许对流式细胞仪数据进行解释和分析, 通常对数缩放。它们可以从. fcs 文件中使用专有的细胞仪软件或第三方解决方案来显示, 是自动化 (细胞直方图图像比较、别致) 和半自动 (细胞条形码、CyBar) 社区分析的基础。

1. 细胞直方图图像比较
   注: 此软件包的代码、详细文档和手册可在 http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/flowCHIC.html 提供。他们也被出版了²⁰。
   1. 安装并加载 R 包, 设置包含. fcs 文件的工作目录, 并通过执行以下操作设置文件列表:
      > 来源 ("https://bioconductor.org/biocLite.R")
      > biocLite ("flowCHIC")
      > 图书馆 (flowCHIC)
      > # 将工作目录设置为您的 FCS 文件所在的路径
      > # 在引号中键入路径
      > setwd ("")
      > # 获取位于工作目录中的 FCS 文件的文件名列表
      > 文件 <-列表. 文件 (getwd (), 完整 = TRUE, 模式 = "*. fcs")
      > # 获取包含在包中的 FCS 文件的文件名列表
      > 文件 <-列表. 文件 (系统. 文件 ("extdata", 包 = "flowCHIC"),
      + 完整 = TRUE, 模式 = "*. fcs")
      > # 将第一个 FCS 文件读取为 flowFrame
      > 框架 <-阅读。FCS (文件 [1], 改变. 名称 = TRUE, 转换 = FALSE)
      > 获取参数/通道名称的列表
      > unname (frame@parameters@data $ 名称)
   2. 通过执行 "fcs_to_img" 包函数为细胞原始数据创建图像:
      > # 使用默认参数创建直方图图像
      > fcs_to_img (文件)
   3. 通过执行 "img_sub" 包函数定义直方图图像的子集:
      > # 使用默认参数创建直方图图像子集
      > img_sub (文件, ch1 = "FS。日志 ", ch2=" 佛罗里达州 4. 日志 ")
   4. 通过执行 "calculate_overlaps_xor" 包函数, 计算重叠和 XOR 值以进行图像分析:
      > # 将所有子集图像的名称保存为列表
      > 子集 <-列表. 文件 (路径 = 粘贴 (getwd (), "chic_subset", 9月 = "/"), 完整 = TRUE, 模式 = "*. png")
      > # 计算重叠和 XOR 图像并将值写入两个新文件
      > 结果 <-calculate_overlaps_xor (子集)
   5. 通过执行 "plot_nmds" 包函数, 为相似性分析创建非度量多维缩放 (NMDS) 地块:
      > 显示示例的 NMDS 图
      > plot_nmds (结果 $ 重叠, 结果 $ xor)
2. 细胞条形码
   注: 此软件包的代码、详细文档和手册可在 http://www.bioconductor.org/packages/devel/bioc/html/flowCyBar.html 提供。他们也被出版了^11,12。
   1. 开发用于所有示例的主闸门模板。
      1. 使用拖放功能将. fcs 文件加载到分析软件中。
      2. 双击测量, 然后从相应的下拉列表中选择 x 和 y 轴参数以打开 FSC 与 DAPI 荧光图。
      3. 使用多边形绘图工具重现以前用于控制步骤3.1.4.5 和3.2.4.4 中分析单元格数量的单元格栅, 并据此命名它。将 "所有示例" 组的 "示例" 列表中的单元格门项拖动到池中。
      4. 双击单元格门并更正坐标轴分配以可视化单元格门事件。
      5. 在已发布的准则¹²之后, 用椭圆门工具定义示例集中的子社区, 并使用 SSC 或其他第三个参数²¹进行扫描, 以确保栅极模板的完整性。池, 控制和调整其他样品的子社区分配。
   2. 将相对子社区丰度导出到 .txt 文件中, 以便在 R 脚本中使用。
      1. 使用 "编辑" 选项卡打开表编辑器。
      2. 为步骤5.2.1.5 中定义的每个子社区添加列, 并将输出统计信息设置为 "父级频率" 并命名它们。
      3. 选择 "保存格式" 和 "目标" 后, 在 "表编辑器" 中创建表。
         注: 分析软件直接提供相对子社区丰度。它们也可以通过在单个子社区门中的事件计数在单元格门中的事件计数来获得。必须将这些值保存在 .txt 文件中的制表符分隔矩阵中, 这些字段不能包含任何 "补码" 域, 需要满足 R 代码读取的一些附加要求 (请参阅手册和常见问题解答)。
   3. 通过执行以下操作来安装和加载 R 包并加载数据:
      > 来源 ("https://bioconductor.org/biocLite.R")
      > biocLite ("flowCyBar")
      > # 在引号中键入路径
      > setwd ("")
      > # 加载数据集
      > 数据 (Cell_number_sample)
      > # 显示数据
      > Cell_number_sample [,-1]
   4. 通过执行 "规范化" 包函数正常化相对丰度:
      # 规范化数据, 打印2位数字
      正常化 (Cell_number_sample [,-1], 数字 = 2)
   5. 通过执行 "cybar_plot" 包函数, 创建规范化的条形码和原始相对丰度的箱线图:
      Normalized_mean <-正常化 (Cell_number_sample [,-1], 数字 = 2)
      Normalized_mean <-数据框架 (数据. 矩阵 (Normalized_mean))
      # 使用默认参数进行绘制
      cybar_plot (Normalized_mean, Cell_number_sample [,-1])
   6. 创建原始相对丰度的 NMDS 图。
      > Normalized_mean <-正常化 (Cell_number_sample [,-1], 数字 = 2)
      > Normalized_mean <-数据框架 (数据. 矩阵 (Normalized_mean))
      > # NMDS 规范化的数字图
      > nmds (Normalized_mean)
   7. 通过执行 "相关" 包函数, 创建规范化的相对丰度和其他参数的相关性分析:
      > # 加载数据集
      > 数据 (Corr_data_sample)
      > # 显示相关值
      > Corr_data_sample [,-1]
      > 运行相关分析
      > 相关 (Corr_data_sample [,-1])
      注意: 别致和 CyBar 依赖于相对丰度。然而, 流式细胞术也可以确定绝对细胞数, 这可能是非常感兴趣的生物技术应用。为了确定绝对单元数, 感兴趣门中的单元格数除以所分析的样本量。所分析的样品体积可以通过添加珠悬浮与已知浓度的样品 (补充文件 1-S7 的公式) 确定。工作台顶部分析仪还配备了一个真正的容积计数功能, 直接量化的样品管在测量期间的体积。建议使用 SYBR 绿色 I 染色协议进行细胞计数。

Results

以下代表的结果强调了在三样本集上复制和举例说明不同的数据可视化和分析技术的必要性。他们展示了可能的数据评估管道的结果适合回答标准研究问题关于各自集合。然而, 所提出的技术并不排斥它们所呈现的样本集。流式细胞仪原始数据是公开提供的 FlowRepository ID FR-FCM-ZY46。以前上载的 ASC 数据在 ID FR-FCM-ZYD7 下可用。

根据已发表的¹¹号议定书, 进行了生物和技术复制, 编写和分析。从个人计算机和 ASC 的生物复制从三个平行的烧瓶被采取了。BC 的生物复制被采取了作为三后继抽样在一个地点在一个试验性规模植物。三整除数的样品进行固定、染色和分析, 以确保技术重现性。根据先前公布的程序¹¹, 对重现性进行了评估。一个样本集的所有样本 (补充文件 1-S6) 的门模板用于计算每门的标准偏差 (%)。

对于 PC, 相对丰度的最大标准偏差为 3.44%, 平均标准偏差为 2.13% (图 1)。对于 ASC 和 BC, 相对丰度的最大标准偏差为1.27% 和 0.88%, 而标准偏差的平均值为2.13% 和 0.21% (补充文件 1-S8)。

一个标准的程序, 当调查纯应变培养, 是准备一个增长曲线, 以分析滞后阶段, 产生时间和细胞密度在特定条件下。我们将此过程与流程细胞分析工作流相结合, 以实现对系统的更深入的了解 (图 2)。FSC 与 DAPI 荧光图揭示了间歇培养的不同点的细胞周期状态。建立了主门模板 (补充文件 1-S6), 以量化细胞的比例与一个 (c1n), 两个 (c2n) 和多染色体 (航空公司,图 2B)。接种细胞的主要比例只有一条染色体 (93.7% 在 0 h)。这在指数增长期间发生了剧烈的变化, 几乎所有的细胞包含不止一个 (99.6%, 4 小时) 和超过一半的人口 (53.1%) 甚至包含两个以上的染色体。这说明P. 恶臭的染色体复制速度比它的生成时间快。

流细胞分析已被证明是非常有用的监测微生物群落的演变。它可以跟随社区动力学比更多资源密集的分子方法^5,10更加接近。我们在一部电影中强调了这些动态, 并获得了随着时间的推移, 活性污泥群落变化的概述。每1/2 帧显示一个 FSC 与 DAPI 荧光图的样本点 (补充文件 2)。在0天和4天之间的一个非常明显的转变之后, 在7天之后建立了一个核心社区。另外的子社区在21天出现了。我们建立了一个主门模板 (补充文件 1-S6), 使评估微生物动力学的子社区水平。实验的不同阶段的显性子社区使用 CyBar 工具进行了清晰的识别 (图 3)。将它与相对子社区丰度的频率分布结合起来, 有助于选择有趣的门 (在关键时间点触发的大量的显著变化) 和可行 (超过5% 相对丰度) 进行排序和进一步分析²²。

工业规模的生物反应器应用可以面对潜在的空间异质性由于搅拌限制。它们也经常接触到变化的操作参数, 如非合成基底质量的改变。BC 代表这样一个系统并且从不同的现场取样在一个动态地被驾驶的塞流反应器。FSC 与 DAPI 荧光地块 (图 4) 的模范抽样点显示只有很少的空间, 但明显的时间异质性。BC 是进一步调查使用, 快速自动化别致和更深入的主门模板基于 CyBar 方法。

它的自动化, 快速和无偏见的性质, 使别致特别有趣的现场控制发酵在一个工业环境。它比较了所有可用样本的原始. fcs 数据。其中的两个比较显示在图 5中。由此产生的不同值证实了以前关于空间和时间异质性的观察。NMDS 地块生成的别致工具不同矩阵 (图 6) 进一步证实这一结果, 并据此形象化。

此外, 我们计算了公元前23子社区的相对丰度, 使用主浇口模板 (补充文件 1-S6)。对48例一年期的样品进行相关分析, 了解微生物群落中的功能关系。这可以帮助确定感兴趣的门进一步调查 (4 细胞分类)。强正或负相关的非生物参数, 如产品的效价可以帮助了解和优化生态系统和生物技术的过程。这一相关性中包含的有机负载率 (图 7) 是这种非生物参数的例证。G5、G4 和 G10 具有较强的正相关性, 可能含有发酵类, 而 G8 中的负相关可能暗示甲烷古菌。

图 1: 纯文化细胞分析的重现性.与控制珠 (A, B) 和条形图的3子社区丰度 [%] 的 DAPI 荧光地块, 其中误差条代表了一个标准偏差 (C, D)。相对丰度的确定与门模板显示在补充文件 1-S6。三生物复制 A, B 和 C 被采取了增长曲线在 4 h 和三技术复制 P1, P2, P3 从样品 A 和三次被测量了, 分别: M1, M2, M3, 并且给以他们各自的标准偏差。5万事件被记录在细胞门。请单击此处查看此图的较大版本.

图 2: 在 12 h (a) 的生长曲线实验过程中所采取的纯文化的细胞周期分析.FSC 与 DAPI 荧光图的双小时抽样在指数生长阶段表现出 DNA 含量的变化。这个测量系列不包括珠子 (参见补充文件 1-S3)。(B).基于光密度的生长曲线, 误差条代表了子社区的一个标准偏差和相对丰度。请单击此处查看此图的较大版本.

图 3: 活性污泥群落结构演化24天以上.(A) 在 boxplots 中, 根据趋势的相似性、相应的颜色键 (B) 以及在 NMDS 图 < 0.001 中的相似性分析, flowCyBar 与叠加频率分布可视化的, 分别为:C). 基础地块显示在补充文件2的电影序列中。使用辅助文件 1-S6 中的栅极模板确定了相对丰度。请单击此处查看此图的较大版本.

图 4: 工业级插头流沼气反应器中微生物群落结构的时空异质性.(A) 在223天, 对四个取样口的微生物群落结构进行比较。(B) 将0天至384日的时间依赖性社区结构变化与第二港口的比较。噪音已被切断, 以提高可视化。25万事件被测量了在细胞门 (补充文件 1-S6)。请单击此处查看此图的较大版本.

图 5: 细胞直方图图像比较-别致.通过比较两个表示空间和时间异质性的样本, 说明了别致算法的基本原理。(一) 在选择两个要显示的参数后, 从. fcs 文件创建别致图像 (FSC 与 DAPI 荧光)。灰度 (0–255) 在像素中对事件计数进行编码。(ii) 在指定包含单元格的区域后生成别致子集 (这里: 200 < x < 4000, 200 < y < 2200)。(iii) 通过比较子集之间的像素来创建 XOR 组合图像。没有区别等于 0, 并显示为黑色。最大差等于 200, 显示为白色。通过在 xor 图像中添加所有像素的灰度值来计算相应的 XOR 值。(iv) 叠加组合图像是通过添加子集像素的灰度值创建的。对应的叠加值是通过计算不等于零的叠加图像的像素并因此包含信息来计算的。(v) 不同值的计算方法是除以 XOR 和叠加值。这些是图 6中 NMDS 图的基础。不同的价值和 NMDS 的情节显示了一个微不足道的空间和明显的世俗群落异质性。请单击此处查看此图的较大版本.

图 6: 基于别致的沼气群落样本相似性分析.0天的样品被排除在这个情节由于它的极端不同的社区结构歪曲分析 (补充文件 1-S11)。NMDS 剧情证实了使用别致的工具做的低空间和更高的世俗异质性的假设并且解释了图 5。请单击此处查看此图的较大版本.

图 7: 沼气群落的相关分析.用长矛的秩阶系数计算矩阵, 并以辅助文件 1-S6 中主浇口模板确定的23子社区的相对丰度为基础。在一年的时间内, 它们与48份样品的有机负荷率 (OLR) 相关。请单击此处查看此图的较大版本.

图 8: 废水中浮游 (P) 和污泥基 (S) 群落的相似性分析.样品取自一个全尺寸污水处理厂的主澄清池 (PCL)、活性污泥池 (AS) 和消化池 (DT) (补充文件 1-S10 中的点地块)。使用辅助文件 1-S6 中显示的门模板确定了相对丰度。这些子社区丰度还与 flowCyBar 工具进行了分析, 以创建一个 CyBar (补充文件 1-S10) 和 NMDS 情节 (R < 0.01)。请单击此处查看此图的较大版本.

图 9: 纯文化的固定稳定性.在0小时的生长曲线实验样品中, 28 天内储存了15% 甘油的-80 摄氏度。对控制珠的 DAPI 荧光图进行了对比。测量系列不包括珠子 (补充文件 1-S3)。5万事件被记录在细胞门 (补充文件 1-S6)。请单击此处查看此图的较大版本.

补充文件 1:请点击这里下载此文件.

补充文件 2:请点击这里下载此文件.

Discussion

对微生物种群和群落的成功分析需要经过良好调整的 cytometers, 适当的细胞参数选择, 以及从取样和固定到测量和数据评估的可靠工作流程。所选单元格参数必须与可用的激发波长匹配。我们使用和推荐 DAPI, 这是非常敏感的低浓度;但需要被紫外线激光激发, 这通常不包括在标准的细胞仪设置。其他染料, 如 SYBR 绿 I, 也玷污了整个人口或社区, 但一般提供劣质决议。我们不建议在微生物群落中使用鱼类程序或生存能力测试。这些方法无法量化、验证和控制, 因为它们对群落中个别物种的影响是不确定的。只要有相当一部分典型的社区仍然不能作为纯文化存在, 就无法对它们进行可靠的测试。

该协议的关键步骤包括取样和固定程序以及细胞分类。由于某些纯净的文化和微生物群落的倾向聚集到絮凝体或附着在样品基质中的微粒, 取样可能会变得复杂。在引入流细胞分析以保证可靠的结果之前, 必须在样品中消散这些聚集物并将细胞分离出来。对所提出的制备方案进行了优化, 以实现单细胞分析。最后50µm 过滤是在测量之前执行, 以去除任何残余骨料和防止70µm 喷嘴的细胞分拣器和流试管的分析仪从堵塞。污水处理厂的细胞絮凝体尤其丰富、健壮, 对系统的功能至关重要。对某大型污水处理厂不同储罐中的浮游污泥基微生物群落进行了研究, 对所建立的协议进行了测试。污泥形成细胞团聚体明显消散, 群落组成保持稳定。此外, 浮游和污泥为基础的群落在所有三取样罐中表现出显著的相似性 (图 8, 补充文件 1-S10)。这些结果通过比较 16S rDNA 扩增子测序的新鲜, 甲醛处理-, 甲醛和乙醇固定-, 和排序样本¹⁰验证。然而, 极具挑战性的环境样品, 如强的生物膜或在紧密相连的链条中生长的细菌, 可能无法消散。土壤样品可能是特别疑难的, 因为无处不在的微粒出现在直方图中, 并且可以通过纯粹的丰度掩盖细胞。在这种情况下, 需要采用传统的测序方法。

在设计实验前, 必须对每套新样品集的固定稳定性进行测试, 以保证结果的有效性。良好的固定稳定性也能在一天内使多样本时间点的汇集染色和测量。在实验结束和最后评价后, 它还能使复制测量和回溯细胞分类成为决定性的时间点。对纯培养物的固定稳定性进行了28天的验证 (图 9)。对于包括样品运输在内的现场试验, 应在较长时期内对固定稳定性进行试验 (在这种情况下, 活性污泥群落为60天, 沼气群落195天, 补充文件 1-S9)。

染色通常不是问题, 但需要控制与生物标准, 以允许应用的生物信息学评估工具。我们使用了模拟应变大肠杆菌BL21 (DE3), 这是根据 ASC 协议和储存, 以用于每一个染色批次。

除了 DAPI, SYBR 绿我已经成功地应用于解决微生物群落^{14 年,23,24,25,26}。SYBR 绿色我可以用在线工作中的活细胞来解决社区变成高和低核酸子集 (海航和放大器)。然而, DAPI 在对 DNA 的结合上更具体, 并且在一个样本集合中能够区分超过50子社区, 但需要在染色前采取固定步骤。

细胞分类是这种方法的一个突出特点, 如果某些子社区有进一步的兴趣, 就可以应用。需要强调的是, 无论是粉煤灰 (仅执行30分钟), 还是乙醇处理或 DAPI 染色¹⁰都对随后的16S 扩增子测序产生负面影响。固定和染色程序对子社区 metagenome 分析的潜在影响仍需检验。

在涉及生物信息学工具的情况下, 许多关于社区功能和趋势动态的信息可以独立于分类方法中, 并通过细胞层次来解决虚拟细胞的社区特征, 并将这些特征参数。

最近, 一些新的生物信息学评估工具, 所有有用的 SYBR 绿色 I 和 DAPI 方法, 已开发解决细胞社区模式。这些是 FlowFP²⁷, 这项研究中使用的包 (flowCHIC²⁰, flowCyBar²⁸), 一个与淡水社区²⁹建立的反褶积模型和一个工具, 用于区分菌株根据其生理特征³⁰。此外, 细胞多样性可以确定²⁵ , 甚至微生物群落的稳定性特性现在可以遵循在线工具¹⁰。

因此, 在快速评价微生物群落和可能的非生物参数相关性方面, 流细胞分析具有巨大的优势。但是, 该方法仍然存在一些限制。由于有经验的基于门设置的程序, 它不能真正地在网上使用 flowCyBar 工具。此外, 研制定制、使用方便的流 cytometers 将极大地促进流细胞菌群分析方法的扩散。在这个方向上的第一步是进行²⁸。

微生物流式细胞术的未来应用可以在微生物生态学中得到展望, 因为它允许在细菌产生时间范围内进行高频监测, 并表明生态学范式适用于细胞数据 5. ^,10。该方法对在瑞士³¹的强制性饮水控制等自然环境的常规筛查非常有用。它也可以是一个宝贵的工具, 医疗应用, 如人类¹⁵或动物³²微生物筛查。此外, 生物信息学的最新发展可能使微生物流式细胞术成为管理微生物系统过程控制中的一个整体传感器。微生物群落细胞术也为细胞分类提供了一个筛选工具, 它允许对特定群落子集进行更高分辨率的基因组调查。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Milli-Q 系统 合成 A10	默克，达姆施塔特，（德国）
BioPak 超滤柱	默克，达姆施塔特，（德国）	CDUF BI0 01
MoFlo Legacy 细胞分选仪	贝克曼-库尔特，布雷亚，加利福尼亚（美国）
Innova 90C	Coherent， Inc ，圣克拉拉（美国）		334 nm - 364 nm，100 mW
Innova 70C	Coherent， Inc ， 圣克拉拉 （美国）		488 nm， 400 mW
Genesis MX488-500 STM OPS	Coherent， Inc ， 圣克拉拉 （美国）		488 nm， 400 mW
Xcyte CY-355-150	Lumentum， Milpitas， California， USA		355 nm， 150 mW
光电倍增管 R928 和 R3896	滨松光子学公司，滨松市（日本）
Summit 4.3 软件	Beckman-Coulter，布雷亚，加利福尼亚州（美国）
1 µM FluoSpheres	分子探针，尤金，俄勒冈州（美国）	F8815	350/440 蓝色荧光
2 &μ;m YG FluoSpheres	分子探针，美国俄勒冈州尤金	F-8827	505/515 黄绿色荧光珠
0.5 μm Fluoresbrite BB 羧酸盐微球	PolyScience，奈尔斯，伊利诺伊州（美国）	18339	360/407
1 μm Fluoresbrite BB 羧酸盐微球	PolyScience，伊利诺伊州奈尔斯（美国）	17458	360/407 蓝色荧光
1 µmYG FluoSpheres	分子探针，美国俄勒冈州尤金	F-13081	505/515 黄绿色荧光珠
KH2PO4	Sigma-Aldrich， St. Louis （USA）	CAS号 7778-77-0
KCl	Sigma-Aldrich， St. Louis （USA）	CAS no. 7447-40-7
Cyflow Space	Sysmex Corporation，神户（日本）
紫外激光器 Genesis CX，Coherent	， Inc，圣克拉拉（美国）		355 nm，150 mW
H6779-32 系列 PMT 滨	松光子学公司，滨松市（日本）
FloMax 软件	Sysmex Partec GmbH，Görlitz， （德国）
所有光学滤光片	Carl Zeiss， Jena （德国）
KH2PO4	Sigma-Aldrich， St. Louis （USA）	CAS no. 7778-77-0
KCl	Carl Roth， Karlsruhe （GER）	6781.3
FlowJo 10.0.8r1	FlowJo， LLC， Ashland， Oregon （USA）		构建号： 42398
R 软件 v.3.4.3	R Core Team
flowCHIC	a href="http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/flowCHIC.html">http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/flowCHIC.html
flowCyBar