本文描述了一种逐步操作方案，利用光学相干断层扫描技术，对在脉动刺激条件下基于可生物降解聚合物支架构建的组织工程血管进行实时培养过程中的血管重塑及支架降解进行非破坏性、长周期的动态监测。
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本文内容
摘要
摘要
具有与天然血管相似结构和力学性能的工程化血管移植物有望满足日益增长的动脉旁路手术需求。在搏动性刺激条件下，对基于可降解聚合物支架的组织工程血管（TEBV）的生长动态及重塑过程进行表征，是血管组织工程研究中的关键环节。光学成像技术作为一种强大的工具，能够实现对工程化组织血管化过程的实时监测，并提供高分辨率的成像结果。本文展示了一种非破坏性、快速的实时成像策略，利用光学相干断层扫描（OCT）技术对TEBV在长期培养过程中的生长与重塑进行连续监测。通过该方法可评估血管的几何形态，包括血管重塑过程、管壁厚度，以及在不同培养时间点、有无搏动性刺激条件下TEBV厚度的比较。最后，与扫描电子显微镜（SEM）和偏光显微镜对聚合物降解的评估结果相比，OCT技术为在有无搏动性刺激条件下、以及在各个血管节段中实时观察重建组织内聚合物的降解过程提供了切实可行的手段。
引言
组织工程血管（TEBVs）是作为理想血管移植物最具前景的材料之一1。为了开发出在结构和功能特性上与天然血管相似且具有临床应用价值的移植物，研究人员已设计出多种技术以维持血管功能2,3。尽管已有工程化血管在植入后表现出可接受的通畅率，并进入III期临床研究4，但长期培养需求和高昂成本仍凸显了对TEBVs发育过程进行监测的必要性。深入了解在仿生化学-力学环境中，TEBVs中细胞外基质（ECM）的生长、重塑及适应过程，可为血管组织工程的发展提供关键信息。
追踪小直径组织工程血管发育的理想策略应具备无创性、无菌性、纵向性、三维性和定量性5。该成像方式可用于评估不同培养条件下组织工程血管（TEBV），甚至包括血管移植前后发生的变化。目前亟需能够描述活体组织工程血管特征的策略。光学成像技术可实现对组织沉积物和生物材料的可视化与定量分析。其他优势还包括能够实现高分辨率的深层组织成像和无需标记的成像6,7。然而，特定成像分子的使用以及用于实时监测的光学设备较难获取，这一实际障碍限制了非线性光学显微镜的广泛应用。光学相干断层扫描（OCT）是一种具有血管内成像能力的光学方法，已被广泛用作临床工具以指导心脏介入治疗8。文献中已报道OCT方法可用于评估TEBV的管壁厚度9,10，并结合其他可靠的成像方式用于血管组织工程研究。然而，组织工程血管的生长与重塑动态过程尚未被观察到。
在本论文中，我们详细描述了基于可生物降解聚合物支架的组织工程血管（TEBV）在四周培养期内的制备过程。人脐动脉血管平滑肌细胞（HUASMCs）在生物反应器中扩增后接种于多孔可降解的聚乙醇酸（PGA）支架中。可生物降解聚合物在组织工程中起到临时基质的作用，并具有特定的降解速率11。为确保支架降解与新生组织形成之间达到适当匹配，细胞外基质（ECM）和PGA支架是实现有效血管重塑的关键因素。灌注系统可模拟天然血管的生物力学微环境，并在压力刺激下维持一致的形变。
本方案旨在介绍一种相对简单且非破坏性的方法，用于组织工程化血管（TEBV）的成像及长期培养监测。该方案可用于在不同培养条件下，对工程化血管的形态学变化和厚度进行可视化观察与测量。此外，还可通过该方法分析组织工程支架中聚合物材料的降解情况，以实现材料识别。通过结合本方案中采用的扫描电子显微镜（SEM）与偏光显微镜技术，可对细胞外基质分布及PGA降解情况进行关联分析与定量评估，从而借助光学相干断层成像（OCT）进一步促进对支架降解过程的综合评价。
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方案
1. 基于可降解PGA支架的组织工程血管培养
- PGA支架的制备
- 使用5-0缝线将经环氧乙烷灭菌的硅胶管（长17 cm，直径5.0 mm，厚0.3 mm）周围缝合聚羟基乙酸（PGA）网片（直径19 mm，厚1 mm）。
- 将膨体聚四氟乙烯（ePTFE，1 cm 长）用 4-0 缝线缝合至 PGA 网片的每一端，两端各重叠 2 mm。
- 将PGA支架用手浸入1 mol/L NaOH溶液中1分钟，以调节网格的空间结构，随后用组织培养级水浸泡3次，每次2分钟。每次浸泡后用纸巾轻轻拍干支架。然后在通风橱中用吹风机干燥1小时。
- 生物反应器与用于OCT成像的Y型接头的组装
- 将自制的圆柱形玻璃生物反应器（直径10 cm，高11.7 cm，反应器内部有四个凸缘，外部有四个侧臂，如图所示）浸泡于 图1），PGA支架、硅胶管（外径5 mm，壁厚0.3 mm）、生物相容性导管、连接器、搅拌子，以及在95%乙醇溶液中浸泡2小时所需的组装设备。
- 将PGA支架通过连接器从生物反应器的一侧臂穿过，另一侧则通过Y型接头穿过，该Y型接头用于输送OCT导丝。以相同方式在生物反应器中组装另一根PGA支架。请参考 图1.
- 用4-0缝线将ePTFE固定在生物反应器边缘。
- 将生物反应器再次放入乙醇罐中浸泡1小时，然后在开启吹风机的通风橱中过夜干燥。
- HUASMCs的接种与静态生物反应器培养
- 采用标准组织块法从人脐动脉中分离人脐动脉平滑肌细胞（HUASMCs）。
- 在由DMEM培养基、20%胎牛血清、2.36 mg/mL HEPES、100 U/mL青霉素G、50 µg/mL脯氨酸、20 µg/mL丙氨酸、50 µg/mL甘氨酸、1.5 µg/mL CuSO4、50 µg/mL抗坏血酸、10 ng/mL碱性成纤维细胞生长因子和10 ng/mL血小板源性生长因子组成的平滑肌细胞生长培养基中扩增和维持细胞。
- 以 5×10 的浓度接种 HUASMC 细胞6 细胞/mL 接种于上述培养基中的PGA支架上。
- 在生物反应器中放入一个搅拌子（1.5 cm 长）。通过硅胶塞盖插入一根进料管（5 mm 直径，15 cm 长）和三段短管（5 mm 直径，7 cm 长），用于气体交换。
- 将 PTFE 0.22 µm 滤器连接至每根换气管，并在喂养管上安装一个肝素帽。调节搅拌棒转速至每分钟 13 转。将玻璃生物反应器、硅胶塞盖子和 PGA 支架组装入培养系统中。
- 让HUASMCs贴壁45分钟，每15分钟将生物反应器向左、右两侧交替倾斜一次，使用支架支撑。反应器的所有端口和接头均用石蜡膜密封。
- 将罗叶泵、PBS袋和驱动器用生物相容性管路连接，组成灌注系统。打开驱动器，使PBS充满管路。
- 将整个生物反应器置于含5% CO₂的湿润化培养箱中2 在37 °C条件下，向培养室中加入450 mL HUASMCs培养基。
- 按下停止按钮并关闭驱动装置的电源。将接种后的支架在静态培养条件下培养一周。
- 每隔3-4天更换一次培养基，通过加样管吸出一半的旧培养基，并向反应器中补充等量的新鲜培养基。
- OCT成像灌注系统的制备
- 将 PBS 袋中的液体泵入生物相容性管路中循环，再回流至袋中。
- 打开驱动器电源，将泵的设置调节至每分钟60次搏动频率，收缩压输出为120 mmHg。根据组织工程血管培养的需求调整机械参数。
- 点击运行按钮以启动灌注系统。通过循环加压生物相容性管路，对血管施加上述固定的脉动刺激，持续3周。10,12 静置培养1周后。
2. 使用光学相干断层扫描进行光学成像
- 使用光源，确保基于频域OCT血管内成像系统的轴向分辨率为10–20 µm，成像深度为1–2 mm，以识别TEBV的结构9。
- 打开电源开关，并启动图像采集软件。
- 将光纤成像导管连接至带有自动回撤功能的驱动电机和光学控制器（DOC）。
- 设置图像采集速率为每秒10帧，自动回撤速度为10 mm/s。
- 通过肝素帽和18G针头将成像导管连接至Y型接头。
- 将导管插入硅胶管中，在将PGA支架装载到生物反应器之前，确认PGA网状结构的缝合紧密度。
- 将导管尖端置于目标区域上方，调节回撤装置，并检查图像质量8。
- 在培养期间的第1、4、7、10、14、17、21和28天，对每根TEBV进行成像，连续保存图像，并实时观察TEBV的微观结构，包括表面形貌、内部结构和组成。
- 每次对工程化血管进行测量时重复3次，以获得可靠结果；使用图像采集软件在测试过程中连续捕获一系列图像。
3. 成像分析
- 使用图像分析软件测量组织工程血管（TEBV）的壁厚。选择待分析的图像，点击追踪工具，由软件自动识别TEBV内侧边界，并手动勾画外侧边界。屏幕上将显示厚度示意图。
- 对每个样本重复测量5次，以获得可靠的结构测量结果。OCT分析由两名独立的研究人员完成，且其对所获取的信息设盲。
4. TEBV 的收获与组织处理
- 当培养结束后，打开覆盖在生物反应器上的硅胶塞盖，弃去培养基。松开生物反应器边缘的膨体聚四氟乙烯（ePTFE）膜，并用剪刀从ePTFE外侧剪断硅胶管。从生物反应器中取出组织工程血管（TEBV），并将其切成若干段用于扫描电子显微镜检查。
- 取出其余的组织工程血管（TEBV），切成4 µm厚的切片。抽出支撑用的硅胶管，用4%多聚甲醛固定切片。进行常规的Masson三色染色和天狼星红染色，以观察胶原和聚羟基乙酸（PGA）的形态10,13,14。
- 为评估聚羟基乙酸（PGA）含量及胶原成分，使用偏光显微镜观察经天狼星红染色的组织学样本。PGA残留物可通过双折射现象清晰区分，并可根据横截面积对残留区域进行定量分析10。
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结果
三维培养系统由生物反应器中的培养室和具有闭合液体循环的灌注系统组成10,13（图1）。将OCT成像导管插入Y型接头的远端，并在硅胶管内回撤以进行成像。在生物反应器培养过程中，首次采用OCT成像技术对基于可降解聚合物支架的组织工程血管的结构特征进行表征。
图2展示了通过实时横断面成像观察工程化血管重塑的过程。评估了几何形态学特征，包括管壁厚度、可降解PGA含量，以及不同培养时间点组织工程血管（TEBV）厚度的比较，并分析了是否存在脉动刺激的影响。在培养的前两周内，观察到厚度逐渐减小以及工程化组织发生显著变化的趋势，提示富含信号的PGA逐渐降解，新生组织结构由疏松向致密转变。培养至21天时，血管已形成结构平滑的组织，细胞外...
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讨论
构建具有与天然血管相似结构和力学特性的工程化血管，有望缩短其临床应用所需时间，这也是血管组织工程的最终目标。光学成像技术能够可视化组织工程血管中的特定组分，但传统方法难以在不破坏无菌环境的前提下，对单个构建物在整个培养过程及移植物暴露期间进行连续监测7。本文中，培养室与灌注系统相互分离。相对独立的灌注系统不仅降低了培养过程中污染的风险，也便于光学相干断层成像（OCT）导丝的放置。同时，这种管腔内成像方式可实现对原位组织工程血管（TEBV）安全、便捷的高分辨率监测，其分辨率接近组织病理学水平，使得对TEBV生长状态的评估更加切实可行，并有望在植入前或植入后加以应用。
本方案介绍了一种易于获取、快速、实时且非破坏性的成像策略，用于评估基于可降解聚合物的组织工程血管的发育情况，该方法采用基于导管的光学相干断层扫描（OCT）。通过观察动态过程，可及早发现影响血管组织工程的一些主要因素，例如污染或细胞-材料相互作用不匹配所导致的组织丢失。确保本方案有效性的关键步骤包括：制备经NaOH修饰的PGA支架、成功在支架上接种人脐动脉平滑肌细胞（HUAS...
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
我们感谢中国广东省科学技术计划项目（2016B070701007）对本工作的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| PGA 网片 | Synthecon | ||
| 硅胶管 | Cole Parmer | ||
| 连接器 | Cole Parmer | ||
| 血管内 OCT 系统 | St. Jude Medical, Inc | ILUMIEN™ OPTIS™ SYSTEM | |
| 扫描电子显微镜 | Philips | FEI Philips XL-30 | |
| 偏光显微镜 | Olympus | Olympus BX51 | |
| 缝合线 | Johnson & Johnson | ||
| 脉动泵 | 广东省心血管病研究所 | ||
| LightLab Imaging 软件 | St. Jude Medical, Inc |
参考文献
- Chan-Park, M. B., et al. Biomimetic control of vascular smooth muscle cell morphology and phenotype for functional tissue-engineered small-diameter blood vessels. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 88, 1104-1121 (2009).
- Ballyns, J. J., Bonassar, L. J. Image-guided tissue engineering. Journal of Cellular & Molecular Medicine. 13, 1428-1436 (2009).
- Smith, L. E., et al. A comparison of imaging methodologies for 3D tissue engineering. Microscopy Research & Technique. 73, 1123-1133 (2010).
- Chang, W. G., Niklason, L. E. A short discourse on vascular tissue engineering. NPJ Regenerative Medicine. 2, (2017).
- Appel, A. A., Anastasio, M. A., Larson, J. C., Brey, E. M. Imaging challenges in biomaterials and tissue engineering. Biomaterials. 34, 6615-6630 (2013).
- Rice, W. L., et al. Non-invasive characterization of structure and morphology of silk fibroin biomaterials using non-linear microscopy. Biomaterials. 29, 2015-2024 (2008).
- Niklason, L. E., et al. Enabling tools for engineering collagenous tissues integrating bioreactors, intravital imaging, and biomechanical modeling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 3335-3339 (2010).
- Zheng, K., Rupnick, M. A., Liu, B., Brezinski, M. E. Three Dimensional OCT in the Engineering of Tissue Constructs: A Potentially Powerful Tool for Assessing Optimal Scaffold Structure. Open Tissue Engineering & Regenerative Medicine Journal. 2, 8-13 (2009).
- Gurjarpadhye, A. A., et al. Imaging and characterization of bioengineered blood vessels within a bioreactor using free-space and catheter-based OCT. Lasers in Surgery and Medicine. 45, 391-400 (2013).
- Chen, W., et al. In vitro remodeling and structural characterization of degradable polymer scaffold-based tissue-engineered vascular grafts using optical coherence tomography. Cell & Tissue Research. 370, 417-426 (2017).
- Naito, Y., et al. Characterization of the natural history of extracellular matrix production in tissue-engineered vascular grafts during neovessel formation. Cells Tissues Organs. 195, 60-72 (2012).
- Ye, C., et al. The design conception and realization of pulsatile ventricular assist devices-from Spiral-Vortex pump to Luo-Ye pump. Chinese Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 9, 35-40 (2002).
- Chen, W., et al. Application of optical coherence tomography in tissue engineered blood vessel culture based on Luo-Ye pump. Chinese Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 31, 687-690 (2015).
- Pickering, J. G., Boughner, D. R., et al. Quantitative assessment of the age of fibrotic lesions using polarized light microscopy and digital image analysis. American Journal of Pathology. 138, 1225-1231 (1991).
- Martinho, J. A., et al. Dependence of optical attenuation coefficient and mechanical tension of irradiated human cartilage measured by optical coherence tomography. Cell Tissue Bank. 16, 47-53 (2015).
- Poirierquinot, M., et al. High-resolution 1.5-Tesla magnetic resonance imaging for tissue-engineered constructs: a noninvasive tool to assess three-dimensional scaffold architecture and cell seeding. Tissue Engineering Part C Methods. 16, 185-200 (2010).
- Naito, Y., et al. Beyond burst pressure: initial evaluation of the natural history of the biaxial mechanical properties of tissue-engineered vascular grafts in the venous circulation using a murine model. Tissue Engineering Part A. 20, 346-355 (2014).
- Smart, N., Dube, K. N., Riley, P. R. Coronary vessel development and insight towards neovascular therapy. International Journal of Clinical and Experimental Pathology. 90, 262-283 (2009).
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