神经退行性变的定量细胞生物学研究 果蝇 使用 ImageJ 对荧光标记蛋白进行无偏分析

摘要

我们开发了一种简单且可适应的工作流程，用于从基于荧光成像的细胞生物学研究中提取定量数据，以分析神经退行性 Drosophila 模型中枢神经系统中的蛋白质聚集和自噬流。

摘要

随着神经退行性疾病发病率的不断上升，深入理解导致神经元功能障碍和丢失的潜在病理生理机制变得愈发重要。基于荧光的成像工具和技术能够实现对亚细胞水平神经生物学过程的前所未有的分析，但仍亟需一种无偏倚、可重复且易于获取的方法，以从成像研究中提取可量化的数据。我们开发了一种简单且可灵活调整的工作流程，用于从基于荧光的成像研究中提取定量数据，该方法利用神经退行性疾病的 Drosophila 模型实现。具体而言，我们描述了一种易于操作的半自动化方法，使用 Fiji/ImageJ 分析两个细胞过程：首先，通过荧光标记的突变型亨廷顿蛋白，定量分析 Drosophila 视叶中的蛋白聚集体含量及其分布特征；其次，利用自噬双荧光报告系统进行比率化定量，评估 Drosophila 视觉系统中的自噬-溶酶体通量。尤为重要的是，本文所述方案包含一个半自动化的分割步骤，以确保所有荧光结构均被分析，从而最大限度地减少选择偏差，并提高细微差异比较的分辨率。该方法可拓展应用于分析神经退行性疾病中其他相关的细胞结构与过程，例如蛋白聚集点（应激颗粒和突触复合物）以及膜结合区室（线粒体和膜运输囊泡）。本方法为图像分析与定量提供了标准化且可灵活调整的参考基准，有助于提升该领域内研究的可靠性与可重复性，最终促进对神经退行性疾病机制的深入理解。

引言

每年有数百万人受到神经退行性疾病的影响，且随着人口老龄化，其发病率正在上升¹。尽管每种神经退行性疾病的病因各不相同，但错误折叠蛋白的聚集以及蛋白质稳态网络的破坏是许多此类疾病的共同病理特征。阐明这些基本且相互关联的过程如何失调并导致神经元功能障碍和细胞死亡，对于理解神经退行性疾病以及指导治疗干预至关重要。基于荧光的成像技术可用于研究神经元中这些复杂而动态的过程，并极大地促进了我们对神经元细胞生物学的理解。对荧光标记蛋白的分析具有挑战性，尤其是在体内（in vivo）进行实验时，由于组织高度致密、细胞类型多样以及形态异质性显著，分析难度更大。人工辅助的定量方法成本较低且操作直接，但通常耗时较长且易受人为偏差影响。因此，亟需发展一种无偏倚、可重复且易于获取的方法，以从成像研究中提取可量化的数据。

我们概述了一种使用 Fiji/ImageJ 的简单且可灵活调整的工作流程。Fiji/ImageJ 是一款功能强大且可免费获取的图像处理软件^2,3，可用于从以 Drosophila 为模型的神经退行性疾病荧光成像研究中提取定量数据。通过遵循本方案对蛋白质聚集和自噬流——这两个与神经退行性疾病病理高度相关的细胞生物学特征——进行定量分析，我们验证了该方法的灵敏性和可重复性。在 Dros....

方案

1. 图像分析实验设计的考虑因素与准备工作

1. 预先确定合适的解剖学、细胞或亚细胞标记物，作为在不同样本间标准化感兴趣区域（ROI）的参照标志，例如4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）、膜标记物、定位性荧光蛋白 等等。
2. 选择一种荧光标记物，该标记物能够将目标结构的离散点状信号与背景水平清晰区分开来。
   注意：本方案已针对蛋白质类结构进行优化（例如，错误折叠的蛋白质聚集体）和膜结合细胞器（例如，自噬报告基因）。为观察蛋白质聚集，使用了带有138个重复的致病性多聚谷氨酰胺（polyQ）序列的人源Htt蛋白N端片段，并用RFP标记（RFP-hHttQ138）⁵突变型Htt蛋白在神经元特异性启动子驱动表达时会在细胞质中形成聚集体 elav-GAL4^5,6为了可视化自噬小体-溶酶体流 actin-GAL4 用于广泛驱动串联mCherry-GFP-Atg8a报告基因的表达。mCherry和GFP阳性点状结构指示自噬小体，自噬流通过溶酶体酸性环境中GFP荧光的淬灭来监测，而耐酸的mCherry信号则持续存在，直至蛋白质被降解⁷对于比率分析，可使用单一通道作为结构的稳定标记物进行分割；或者，....

结果

荧光标记的突变型Htt聚集体的数量、面积和强度的定量分析 果蝇 视叶

研究中枢神经系统中错误折叠蛋白的聚集 果蝇 亨廷顿病模型，带有RFP标签的突变型人类Htt，具有非致病性（UAS-RFP-hHttQ15）或病理性扩张（UAS-RFP-hHttQ138）以及膜结合型GFP（UAS-mCD8::GFP)¹¹ 在泛神经元驱动子下共表达 elav-GAL4雌性果蝇羽化后2天（DAE）的脑组织按照方案第2节所述进行解剖、固定和DAPI染色。使用40倍油镜（数值孔径NA为1.30）对视叶区域进行共聚焦激光扫描显微成像，扫描速度为 8.0 µs 每像素12位，空间分辨率为1024×1024像素。成像软件确定的最佳步长为 1.08 µm 每张切片使用以下激发/发射波长组合的物镜进行成像：通道1）GFP为488/510.......

讨论

本文所述方案可用于对基于荧光成像所观察到的细胞生物学过程进行稳健且可重复的定量分析。在指导实验设计时，必须仔细考虑生物学背景和技术局限性。对于目的亚细胞结构的荧光标记物，无论其为免疫组织化学标记、染料标记或基因表达产物，均需在形态和强度上能够与背景清晰区分。UAS/GAL4 系统被广泛用于在 Drosophila 中驱动靶向基因表达。本文所展示的示例使用携带 GAL4 驱动元件的转基因品系，通过 UAS 增强子调控荧光标记蛋白的转录，以研究神经系统中的蛋白质聚集和自噬现象。若实验需要同时表达一个实验性 UAS 转基因和一个荧光报告转基因，则对照组也应共表达一个无显著生物学效应的转基因，以平衡 GAL4 的剂量效应，例如 UAS-GFP 或 UAS-lacZ。标准化的样品制备流程——如本文所述针对 Drosophila 中枢神经系统和视觉系统的解剖、固定、抗体染色至封片等步骤——对于实现最佳成像与定量分析至关重要。

为实现半自动化分析，并确保实验组之间的准确比较，必须采用良好的成像实践，以最大化.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
SYLGARD(R) 184 硅酮弹性体试剂盒	Dow Corning Corporation	PF184250	解剖皿
Falcon 35 mm 未经组织培养处理的易握型细菌培养皿	Corning	351008	解剖皿
Dumont #5 镊子	Fine Science Tools	11251-20	解剖工具
氯化钠	Sigma	S3014	PBS 溶液
磷酸氢二钠	Sigma	S5136	PBS 溶液
磷酸二氢钾	Sigma	P5655	PBS 溶液
Triton X-100	Sigma	T9284	洗涤和抗体孵育溶液。
37% 甲醛	VWR	10790-710	固定
一次性微量离心管（0.5 mL，蓝色）	VWR	89000-022	固定、洗涤和抗体孵育。
普通和磨砂载玻片（25×75 mm）	VWR	48312-004	共聚焦成像用载玻片
矩形显微盖玻片（22×40 mm）	VWR	48393-172	共聚焦成像用载玻片
橡胶胶水	Slime	1051-A	封片
VECTASHIELD 抗荧光淬灭封片剂	Vector Laboratories, Inc.	H-1000	封片
Scotch Magic 810 透明胶带（19 mm×25.4 m）	3M Company	810	封片
正常山羊血清	Thermo Fisher Scientific	PCN5000	抗体孵育
DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚，二盐酸盐）	Thermo Fisher Scientific	D1306	核酸染色。用去离子水溶解配制成 5 mg/mL 储存液，于 -80°C 保存。使用时用 PBTx 稀释至工作浓度 10–20 μg/mL。
3.5X–90X 立体变倍工业检测显微镜	AmScope	SM-1BNZ	解剖显微镜。配备 6 W LED 双蛇形管照明器
ImageJ/Fiji	NIH	v1.51u	含 SCF_MPI_CBG 插件（版本 1.1.2）
FV1000-IX81 共聚焦激光扫描显微镜	Olympus
重组构建体	Bloomington Drosophila Stock Center	BL37749