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方法文章

一种用于检测过表达突触前蛋白的培养神经元中突触小泡循环的光学检测方法

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DOI：

10.3791/58043

⸱

2018年6月26日

 ,  ,  , 
1Institute for Anatomy and Embryology, University Medical Centre Göttingen

本文内容

摘要

我们描述了一种用于培养神经元中突触小泡（SV）循环的光学检测方法。将该方案与双重转染技术结合，可同时表达突触前标记物和目的蛋白，从而定位突触前位点及其突触小泡循环能力，并确定目的蛋白的作用。

摘要

在活跃的突触前神经末梢，突触小泡经历胞吐和胞吞的循环过程。在回收过程中，突触小泡跨膜蛋白的腔内结构域会暴露于细胞表面。其中一种蛋白是突触结合蛋白-1（Synaptotagmin-1，Syt1）。当将针对Syt1腔内结构域的抗体加入培养基后，该抗体可在胞吐-胞吞循环过程中被摄取。这种摄取量与突触小泡的循环程度成正比，并可通过免疫荧光进行定量分析。在此，我们将Syt1抗体摄取技术与培养的海马神经元的双质粒共转染相结合。该方法可实现：（1）通过表达重组突触前标志蛋白突触素（Synaptophysin）来定位突触前部位；（2）利用Syt1抗体摄取评估这些位点的功能活性；（3）研究目的蛋白GFP-Rogdi的靶向定位及其功能影响。

引言

研究突触小泡循环对于确定突触前特性如何变化至关重要，无论是在突触可塑性过程中，还是在突触功能受到干扰时。通过检测突触素结合蛋白-1（Synaptotagmin-1, Syt1）抗体的摄取，可提供一种测量突触小泡（SV）循环量的方法。Syt1 是一种与突触小泡相关的蛋白，作为 Ca2+ 传感器，在神经递质的胞吐释放过程中起必要作用1,2。它是一种跨膜蛋白，其C端胞质结构域位于突触小泡外侧，而N端腔内结构域则位于突触小泡内侧3。在胞吐过程中，Syt1 的腔内结构域暴露于细胞外环境。我们向该外部环境加入针对其胞质结构域的抗体，这些抗体在内吞过程中被摄入细胞内。这些抗体可预先与荧光染料偶联，或通过二抗进行免疫染色4,5,6,7。最终免疫信号的荧光强度与突触小泡循环量成正比。该方法可用于检测组成型以及去极化诱导的突触小泡循环6,8。

Syt1 摄取实验可在通过病毒介导的基因转移将几乎所有培养皿中的细胞转导后进行，也可在少量细胞稀疏转染后进行。我们的方法结合了钙磷酸盐法对原代海马神经元进行稀疏双转染，并在此基础上开展该检测9。我们使用一种已知可在突触前部位富集的重组标记蛋白——荧光标记的突触素（Synaptophysin）来定位突触前终末，同时过表达目标蛋白 Rogdi。该策略使我们能够检测 Rogdi 是否靶向功能性突触并影响突触小泡（SV）的循环利用。编码 Rogdi 的基因最初是在筛选记忆缺陷型果蝇突变体时被发现的10。在人类中，Rogdi 基因的突变会导致一种罕见且严重的疾病，称为 Kohlschütter-Tönz 综合征。患者表现为牙釉质发育异常、药物难治性癫痫以及精神运动发育迟缓；然而，该基因产物的亚细胞定位一直不明确11。因此，Syt1 摄取实验为 GFP 标记的 Rogdi 定位于功能性突触提供了关键证据9。

这种摄取技术具有多项优势。首先，可通过活体成像实时观察突触囊泡（SV）的循环过程7,12，也可在固定后通过测量Syt1荧光标记的荧光强度来检测其循环情况6,9。此外，目前已开发出多种Syt1抗体变体。其中包括无标签变体，可在固定后按照标准免疫染色流程使用二抗进行标记；以及预先偶联了荧光标记的变体。最后，基于抗体的荧光标记技术具有优势，原因是市面上可选用的商用二抗或偶联染料种类丰富。

在固定和免疫染色神经元时，还可以对其他蛋白进行染色，并进行共定位分析，以确定这些蛋白相对于循环突触囊泡（SVs）的位置。荧光标记的强度可直接反映突触囊泡循环的数量。此外，抗体可特异性地标记含有Syt1的结构，从而实现高特异性并产生较低的背景荧光4。也可采用不同的刺激方案，例如去极化缓冲液或电刺激方案9,12,13,14。然而，基础状态下的突触囊泡循环也可在不刺激神经元培养物的情况下进行测量15。

本方法专门针对固定后通过二抗免疫标记来检测双转染神经元中Syt1抗体摄取的情况。然而，在讨论中我们提到了该检测方法所有常规使用的变体，以便读者能够根据特定需求调整实验方案。

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方案

未开展涉及活体动物的研究。用于获取细胞培养物的已实施安乐死动物相关实验，已获得当地动物保护主管部门（哥廷根大学医学中心动物保护委员会）批准，批准编号为 T10/30。实验均按照批准的方案进行。

1. 原代海马神经元细胞培养

  1. 在胚胎第19天制备大鼠海马组织的离体细胞培养16,17将细胞以每孔 50,000 - 60,000 个细胞的密度接种于 24 孔板中经多聚赖氨酸（PEI）包被的 12 mm 盖玻片上。使用细胞计数板和相差显微镜检测细胞密度。
  2. 将神经元培养3天（第3天） 体外 （体外培养天数）3）将细胞置于24孔板中，在37 °C、5% CO₂的培养箱中培养2.
  3. 使用透射光显微镜评估盖玻片上细胞健康状况的指标（例如， 使用10-20倍放大倍数的相差显微镜观察。检查以下健康状态的指标：清晰的相差晕环、神经突无串珠样结构、胞体无成簇现象及神经突无束状聚集。

2. 转染

注意：以下方案针对3个孔的双重转染。然而，制备足够用于4个孔的试剂用量时，实验效果最佳。

  1. 在锥形瓶中配制 500 mL 转染缓冲液（274 mM NaCl，10 mM KCl，1.4 mM Na2HPO4，15 mM 葡萄糖，42 mM HEPES）。
    1. 在锥形瓶中，将 8.0 g NaCl、0.37 g KCl、0.095 g Na2HPO4、1.35 g 葡萄糖和 5.0 g HEPES 溶于 400 mL 蒸馏水中。
    2. 使用 pH 计，以 1 M NaOH 将 pH 值调节至 6.95。
    3. 用蒸馏水定容至 500 mL，并使用 pH 计检测 pH 值。
    4. 通过向转染缓冲液中加入 1 M NaOH，用移液器配制 pH 值分别为 6.96、6.97、6.98、6.99、7.00、7.01、7.02、7.03、7.04、7.05、7.06、7.07、7.08、7.09、7.11 的 20–30 mL 分装液。
      注意：转染缓冲液的 pH 值对转染效率至关重要。
    5. 为测试哪种 pH 值的转染缓冲液可获得最高数量的转染细胞，需逐一测试 pH 值从 6.96 到 7.11 的缓冲液。采用 2.2–2.11 步骤所述的转染方法，并使用表达 GFP 的已验证质粒。测定每种 pH 值转染缓冲液下每盖玻片的转染细胞数，以评估最佳缓冲液。
    6. 将转染效率最高的缓冲液分装至 2 mL 微量离心管中，于 -20 °C 冷冻保存。
  2. 将低血清培养基、细胞培养基和蒸馏水在水浴中预热至 37 °C。
  3. 在 1.5 mL 微量离心管中配制转染混合液。操作需在超净工作台内进行，以确保无菌条件。
    1. 将 7.5 µL 2 M 氯化钙与 4 µg 无内毒素 DNA（Synaptophysin-mOrange 和 mGFP/GFP-Rogdi）混合，再加水至总体积为 60 µL，置于 1.5 mL 微量离心管中。
    2. 向混合液中加入 60 µL 转染缓冲液。为获得最佳效果，应在轻微涡旋震荡 DNA 混合液的同时逐滴加入转染缓冲液。
    3. 室温（RT）孵育 20 分钟。孵育期间避免震荡孵育管，可将管子放置于超净工作台旁静置。
  4. 在超净工作台内，使用 1000 µL 移液器从孔中移除细胞培养基（“条件培养基”），并将其储存在培养箱内的单独容器中。
  5. 向每孔加入 500 µL 低血清培养基。将细胞在 37 °C 和 5% CO2 条件下孵育，直至完成 20 分钟孵育期（步骤 2.3.3）。
  6. 通过多次滴加方式向每孔加入 30 µL 转染混合液。弃去管底残留液体。
  7. 所有孔加完转染混合液后，轻轻摇动 24 孔板，以确保转染混合液在培养基中均匀分布。
  8. 将各孔在 37 °C 和 5% CO2 条件下孵育 60 分钟。
  9. 移除并弃去转染混合液，用细胞培养基洗涤三次。每孔加入 1 mL 细胞培养基，在室温下孵育 30 秒。移除 750 µL 培养基，并加入等量新鲜培养基。重复此操作三次。
    注意：洗涤步骤至关重要。应尽量减少每孔无培养基的时间（i.e.，逐孔操作，即移即加），并轻柔加入洗涤培养基。
  10. 移除并弃去细胞培养基，逐孔加入 450 µL 条件培养基。
  11. 将神经元在 37 °C 和 5% CO2 的培养箱中继续培养至 DIV 10。

3. 刺激与Syt1摄取

注意：以下方案适用于3个孔。若需对其他数量的孔进行去极化处理，请相应调整试剂用量。

  1. 在锥形瓶中配制 50 mL 的 10 倍去极化缓冲液（640 mM NaCl、700 mM KCl、10 mM MgCl2、20 mM CaCl2、300 mM 葡萄糖、200 mM HEPES，pH 7.4）。
    注意：去极化缓冲液可在 4 °C 下保存数周。若同时使用非去极化溶液，请配制 10 倍 Tyrode 溶液，其成分为 1290 mM NaCl、50 mM KCl、10 mM MgCl2、20 mM CaCl2、300 mM 葡萄糖、200 mM HEPES，pH 7.4，以用于比较刺激诱导的囊泡循环与自发性循环。使用前将溶液稀释至 1 倍浓度，并加入 1 µM 河豚毒素以阻断动作电位的产生。
    1. 在锥形瓶中，将 1.87 g NaCl、2.61 g KCl、0.1 g MgCl2-6H2O、0.15 g CaCl2-2H2O、3.0 g 葡萄糖-1 H2O 和 2.38 g HEPES 溶解于 50 mL 去离子水中。用 NaOH 调节 pH 值，并对溶液进行无菌过滤。将缓冲液用去离子水按 1:10 稀释，得到 1 倍浓度的工作液。
  2. 在 1 倍 PBS（pH 7.4）中配制 4% 多聚甲醛（PFA）用于刺激后的固定。
    1. 配制 500 mL 的 4% PFA（溶于 1 倍 PBS）：将 20 g 多聚甲醛溶解于 450 mL 去离子 H2O 中。
      注意：加热可加速溶解，但温度不得超过 70 °C，否则 PFA 可能降解。
      警示：PFA 具有毒性，可能具有致癌性和致畸性。操作时需佩戴手套，在通风橱中进行，并避免摄入。
    2. 待溶液冷却至室温后，加入 50 mL 的 10 倍 PBS 储存液。使用 pH 计以 NaOH/HCl 调节 pH 至 7.4。
  3. 将 600 µL 的 1 倍去极化缓冲液和 10 mL 细胞培养基置于水浴中预热至 37 °C。
  4. 向 1 倍去极化缓冲液中加入 1 µL 小鼠抗 Syt1 抗体（克隆号 604.2），涡旋振荡 10 秒。
  5. 移除并弃去细胞培养基，向每孔加入 200 µL 去极化缓冲液-抗体混合液，在 37 °C、5% CO2 条件下孵育 5 分钟。
  6. 移除并弃去去极化缓冲液-抗体混合液，用细胞培养基洗涤 3 次。每次向每孔加入 1 mL 细胞培养基，室温孵育 30 秒。吸出 750 µL 培养基，加入等量新鲜培养基。重复此步骤 3 次。
  7. 移除并弃去细胞培养基，向每孔加入 300 µL 1 倍 PBS 中的 4% PFA，4 °C 下孵育 20 分钟。
  8. 用 1 倍 PBS 洗涤 3 次，每次 5 分钟。
    注意：本实验方案可在此处暂停。

4. 免疫细胞化学

  1. 配制 50 mL 封闭缓冲液。
    注意：封闭缓冲液可在 -20 °C 保存数月。
    1. 将 2.5 g 蔗糖和 1 g 牛血清白蛋白（BSA）溶解于 5 mL 10x PBS 储存液中。加入 1.5 mL 10% 去垢剂储存液。搅拌至所有组分完全溶解，然后加入蒸馏 H2O 至终体积为 50 mL。分装溶液，将分装液冷冻保存。
  2. 在每个孔中用 200 µL 封闭缓冲液按 1:1000 的比例稀释二抗（针对一抗 Syt1 抗体种属的荧光标记二抗）。
  3. 移除并弃去含有盖玻片的各孔中的 1x PBS。
  4. 向每个孔中加入 200 µL 封闭缓冲液-抗体混合液，在室温下孵育 60 分钟。
    注意：由于二抗对光敏感，后续所有操作均需在避光条件下进行。
  5. 孵育结束后，用 1 mL 1x PBS 洗涤细胞三次，每次 5 分钟。
  6. 将盖玻片用封片介质封固在显微镜载玻片上。
    1. 在显微镜载玻片上滴加 7 µL 封片介质。用注射器提起并用镊子夹取 24 孔板中的盖玻片。
      注意：盖玻片表面的细胞容易受损，因此操作镊子时必须小心谨慎。
    2. 将盖玻片浸入蒸馏水中以去除 PBS，并用软纸巾轻触其一端小心吸干水分。
    3. 将盖玻片细胞面朝下翻转至封片介质液滴上，使细胞面紧贴载玻片，从而将细胞封固于封片介质中。
  7. 将载玻片置于通风橱中干燥 1 - 2 小时（需覆盖以避免光照），然后存放在显微镜载玻片盒中，于 4 °C 保存。
    注意：本实验方案可在此处暂停。

5. 显微分析

  1. 盖玻片干燥后，将其置于显微镜下，使用物镜和相机进行观察。
  2. 调整每个通道的曝光时间，使极少像素过曝，以确保灰度值的最大分布。
    注意：不同通道之间的曝光时间可能不同，但同一通道的曝光时间应保持恒定，以确保不同盖玻片之间的可比性。
  3. 每张盖玻片采集10个感兴趣区域（ROI）的多通道图像。通过检测GFP荧光（应呈点状）确认ROI中包含转染神经元的轴突过程。

6. 统计分析

  1. 将图像导出为 .tif 文件。通过点击 文件 | 加载图像文件，在 OpenView18 中加载图像。
  2. 选择突触素-mOrange 图像作为通道 1，Rogdi-GFP/mGFP 图像作为通道 2，Alexa647 荧光图像作为通道 3。
  3. 对感兴趣区域（ROI）进行阈值设定。
    1. 点击 分析 | 在点状信号上放置区域。选择合适的阈值和强度差值，使得在目视检查时排除弥散性荧光，仅保留通道 1 图像中的点状信号（代表 Synaptophysin-mOrange 荧光）。所有图像应使用相同的阈值。
  4. 通过点击 立即执行，将这些感兴趣区域（ROI）转移至每个盖玻片区域对应的通道 2（GFP-Rogdi/mGFP 荧光）和通道 3（Syt1-荧光）。
    注意：仅当细胞为双转染时，才应考虑这些感兴趣区域（ROI）。在此方法中，mOrange 和 GFP 荧光应清晰可见。
  5. 通过点击 记录数据，将数据保存至分析日志编辑器中。
  6. 在 窗口 选项卡下打开分析日志编辑器，复制各通道的数值。将各通道的数值分别粘贴至电子表格中。
  7. 计算两种转染条件（GFP-Rogdi 和 mGFP）下，Syt1 通道在感兴趣区域（ROI）处的平均荧光强度。
  8. 采用适当的统计学检验方法（如 Student’s t检验）以确定显著性差异。

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结果

该方法的预期结果是在每张盖玻片上定位到约50个双转染的神经元，密度为每孔50,000个神经元。每个神经元的轴突应显示出多个荧光标记的突触素聚集热点，表明突触小泡（SVs）的簇集。在功能性突触前位点，重组突触素信号与成簇的Syt1荧光共定位。通过双转染，将目的蛋白GFP-Rogdi（图1）或对照mGFP与重组突触素共同表达。

在本实验中，我们分析表达 GFP-Rogdi 或 mGFP 的神经元中突触前位点的突触囊泡回收。如果对照蛋白 mGFP 在整个细胞中均匀分布，但其在突触位点的影响仍需研究，则有必要共转染第二种在突触前富集的蛋白——荧光标记的突触素蛋白（Synaptophysin）。

如前所述，细胞会发生去极化诱导的递质释放。因此，功能性突触会摄取添加到培养基中的Syt1...

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讨论

目前有三种常规检测方法用于研究突触囊泡（SV）的回收。前两种方法包括：a）使用荧光苯乙烯染料（如FM1-43），这类染料可插入膜结构，在内吞过程中被摄入细胞器，并在外排过程中释放；b）使用荧光标记的重组突触囊泡蛋白（此类蛋白在过表达后可整合到囊泡回收机制中）。如果所连接的荧光基团的荧光特性随pH变化而改变，则可用于监测突触囊泡内部酸性环境与细胞外环境pH之间的差异。使用pH敏感型GFP变体标记的重组蛋白被称为Phluorins。上述两种检测方法此前已有报道19,20，且各自的优势与局限性也已被综述21。

在此，我们描述第三种成熟可靠的方法4,5,6,7,<...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

感谢Irmgard Weiss提供的专业技术支持。本工作由德国研究基金会（DFG）通过纳米级显微技术与脑部分子生理学卓越集群（CNMPB，项目编号B1-7，资助对象T.D.）资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
B27Gibco17504-044
BSASigmaA7030-50g
CaCl2Sigma-AldrichC3306-100g
CoolSNAP HQ2Photometrics
dH2OInvitrogen15230
DABCO默克8.03456.0100
驴抗小鼠 Alexa 647Jackson ImmunoResearch715605151抗体
DMEMInvitrogen41966
DPBSGibco14190
Eppendorf管Eppendorf30120094
多孔板 24 孔Fisher Scientific087721H
50 mL 离心管Greiner Bio-One227261
FBS 优质BiochromAGS0615
葡萄糖默克1,083,421,000
HBSSInvitrogen14170
HEPESSigmaH4034-500g
Hera Cell 150（培养箱）ThermoElectron Corporation
KCLSigma-AldrichP9541-500g
L-谷氨酰胺Gibco25030
MgCl₂2霍尼韦尔M0250-500g
显微镜载玻片Fisher Scientific10144633CF
Microsoft Excel微软
Mowiol4-88Calbiochem475904
NaClBioFroxx1394KG001
Na2HPO4BioFroxx5155KG001
NeurobasalInvitrogen21103049
OpenView 实验分析应用程序免费软件，参见评论作者：Noam E. Ziv，Technion – 以色列海法以色列理工学院
PBS（10倍浓缩液）罗氏11666789001
Opti-MEMInvitrogen31985
青霉素-链霉素（Penstrep）Gibco15140-122
PFASigmaP6148-1kg
安全通风橱ThermoElectron序列号 40649111
蔗糖neoFroxx1104kg001
突触结合蛋白1Synaptic Systems105311小鼠单克隆；克隆株 604.2
Triton X-100默克1,086,031,000
Vortex Genius 3 IKA3340001
水浴锅GFL1004
Zeiss Observer Z1 Zeiss

参考文献

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