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方法文章

维持 Aphis nerii 的生物培养及基因表达检测：植物-昆虫互作研究中的非模式系统

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DOI：

10.3791/58044

⸱

2018年8月31日

 ,  , 
1Biological Sciences Department, Vanderbilt University

本文内容

摘要

蚜虫Aphis nerii定殖于夹竹桃科（Apocynaceae）这类具有高度防御能力的植物上，为研究植物与昆虫之间的相互作用提供了丰富的研究机会。本文中，我们介绍了一系列用于维持植物和蚜虫培养物，以及生成和分析A. nerii分子和组学数据的实验方案。

摘要

蚜虫是研究多种生物学问题的优良实验模型，其研究范围涵盖共生关系的进化、多型现象的发生，以及昆虫与寄主植物相互作用等相关问题。目前已有多种蚜虫物种的基因组资源，随着新一代测序技术的发展，转录组学研究正逐步扩展到缺乏完整基因组的非模式生物。此外，蚜虫种群可从野外采集并在实验室中培养，用于个体水平和分子水平的实验，从而弥合生态学与遗传学研究之间的鸿沟。最后，许多蚜虫可在实验室中依赖其偏好的寄主植物，以持续性的孤雌生殖生命周期进行培养，从而实现对无性繁殖基因型的比较研究。Aphis nerii（夹竹桃蚜，又称马利筋蚜）即为一种可用于结合个体与分子实验研究昆虫与有毒植物相互作用的典型模型。本文概述并讨论了在温室和实验室中建立与维持植物和蚜虫培养物的方法、DNA与RNA提取、微卫星分析、从头转录组组装与注释、转录组差异表达分析，以及差异表达基因的qPCR验证。

引言

蚜虫是一类小型半变态昆虫，广泛定殖于全球多种植物科属。其显著特征包括复杂的生活史，涉及周期性孤雌生殖和明显的多型现象，以及与细菌或酵母类内共生体之间必需的营养共生关系，后者为其缺乏营养的植物汁液食谱提供必需营养物质1尽管大多数蚜虫是专一寄主植物的，但一些广食性种类是重要的农作物害虫，它们通过直接取食或传播病原体和病毒，对农作物造成显著的经济损失。2. 2010年，首个蚜虫基因组——豌豆蚜虫基因组的发表 Acyrthosiphon pisum3，标志着蚜虫生物学研究的一个重要里程碑，因为它提供了基因组资源，可用于探究该昆虫对植食性生活方式的适应机制，包括可能有助于开发更有效防控策略的相关问题4自那时起，随着大豆蚜虫注释基因组的发表，相关的基因组资源不断积累 Aphis glycines5，以及另外三种蚜虫物种公开可用的全基因组资源（Myzus cerasi （黑樱桃蚜虫）， Myzus persicae （桃蚜） Rhopalosiphum padi （禾谷缢管蚜）6. 有价值的 从头合成 转录组资源也可用于其他多种蚜虫物种（例如，Aphis gossypii（棉蚜7, Sitobion avenae （禾谷缢管蚜）8, Cinara pinitabulaeformis （松蚜）9, Aphis nerii （马利筋-夹竹桃蚜虫）10).

蚜虫也对我们理解植物与昆虫的相互作用以及植物上生物的生态学做出了持久贡献11。蚜虫尤其在阐明寄主植物相互作用的化学生态学方面发挥了重要作用。植食性昆虫表现出多种适应机制以克服植物防御，有些甚至会劫持植物的防御物质以利于自身12,13,14。例如，马利筋夹竹桃蚜（Aphis nerii）是一种亮黄色的入侵性蚜虫，广泛分布于全球温带和热带地区，寄生于夹竹桃科（Apocynaceae）植物上。夹竹桃科植物已进化出多种化学防御机制，包括乳白色的乳胶和被称为强心苷（cardenolides）的强心糖苷类物质；这些物质可结合阳离子载体Na,K-ATP酶，有效阻止广食性植食动物取食15,16。专食马利筋的昆虫表现出对强心苷的多种抗性机制，有些种类会主动或被动地在体内积累或修饰强心苷，以此抵御捕食者或其他有利功能17。A. nerii 被认为也以这种方式储存强心苷，但其具体机制和功能益处仍不明确10,18。

鉴于现有的基因组资源， A. nerii 为研究有毒寄主植物与其专食性植食性昆虫之间化学生态相互作用所涉及的分子与遗传机制提供了极佳的实验模型。值得注意的是，尽管一些最早的研究 A. nerii 专注于强心苷的隔离19，自那时起，对 A. nerii 为一系列进化与生态学问题提供了见解，包括入侵性昆虫的遗传结构20 以及自下而上和自上而下调控对植食性动物密度的相互作用21. A. nerii 因此是研究昆虫与植物相互作用的广泛实验模型的理想候选者。任何研究成功的关键在于 A. nerii 精心培养蚜虫种群，包括培养蚜虫所依赖的寄主植物，以及高效获取高质量的组学数据。我们的目标是指导读者完成这两个方面。下文概述了在温室和实验室中建立与维持植物和蚜虫培养的方法、DNA 和 RNA 提取、微卫星分析， 从头合成 转录组组装与注释、转录组差异表达分析以及差异表达基因的qPCR验证。这些方法虽为 A. nerii，通用的培养、提取和分析方法可推广至多种蚜虫物种。

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方案

1. 植物培养

  1. 从任何商业供应商处购买种子，或从田间成熟的植株上采集。
    注意：本方案适用于大多数市售的马利筋物种（例如，Asclepias incarnata、A. syriaca、A. curassavica、Gomphocarpus physocarpus）。部分种子可能需要进行低温层积处理，应查阅种子供应商提供的说明。
  2. 将种子播种于细质发芽基质中（60–70% 细泥炭藓、珍珠岩、蛭石、石灰石）。
    1. 用发芽基质填满标准育苗盘，确保基质填至育苗穴顶部。在每个育苗穴中压出一个凹痕，形成约 3 cm 深的孔洞。
    2. 在每个孔洞中放入一粒种子，并用喷壶充分浇水，使基质覆盖种子并达到饱和状态。
    3. 在温室中培养种子（见下文 1.5 条件）。定期浇水，每天或隔天一次，保持土壤湿度处于中等水平。
  3. 当幼苗长出第一组完整叶片后，将其移栽至通用型盆栽基质中（50–60% 泥炭藓、树皮和石灰石）（图1A）。
    1. 使用可与杯状笼紧密贴合的 4 英寸圆形花盆。填入通用型盆栽土，至距盆口约 5 cm 处。
    2. 在土壤中挖一个足够深的孔洞，直至触及盆底。
    3. 用手轻轻将成熟的幼苗从育苗穴中取出，放入 4 英寸花盆的孔洞深处。用土壤覆盖幼苗，并充分浇水。
    4. 在温室中继续培养植株，定期浇水，每天或隔天一次，保持土壤中等湿度。
  4. 温室培养条件。
    1. 根据设备制造商的说明，设置温室温控系统，使白天温度维持在 18–28 °C，夜间温度维持在 16–22 °C。
    2. 在冬季日照较短的月份，使用 600 W 高压钠灯补充光照（每日 12 小时，上午 8 点至晚上 8 点）。
  5. 使用叶面有机皂液控制不需要的害虫（例如，蓟马、蚜虫），但使用此类产品时需谨慎。
    1. 按照制造商推荐的方法配制皂液，并使用喷雾瓶均匀喷施。
    2. 皂液在植株上保留 4–24 小时。施用后 4–24 小时内用清水轻轻冲洗植株以去除皂液，并在用于实验室蚜虫培养前再用清水冲洗一次。
  6. 在已长出至少 3–4 组完整叶片、且植株高度至少达 10 cm 的植株上培养常规蚜虫种群（图1B）。

2. 蚜虫培养

  1. 从现有的实验室同基因型种群开始建立蚜虫种群，或按照以下说明从野外采集的蚜虫开始建立。
    1. 从现有的实验室同源克隆种群建立新的实验室种群时，按照2.3.1–2.3.3所述方法转移蚜虫。
  2. 开始新的同克隆实验时，采集田间蚜虫种群，并按步骤1.6所述，将一只正在繁殖的成年蚜虫置于合适的寄主植物上。
    注意：种群可由有翅（alate）或无翅（apterous）成虫起始建立。
    1. 在将温室植物用于实验室蚜虫实验之前，人工检查植物上是否存在不需要的害虫。将带有不需要的蚜虫的植物进行冷冻处理。如有需要，可使用乙醇真空抽滤瓶去除蓟马或其他害虫。
      注意：使用前务必按照步骤 1.5.2 所述，冲洗经肥皂处理过的植物。
    2. 使用毛笔或用3/16英寸管制成的口吸移液器，安全转移一只成年蚜虫" ID x 1/4" OD塑料管、1,000 µL移液器吸头和2,000 µL移液器吸头（图2A).
    3. 用剪去顶部的塑料杯制成杯罩，罩住带蚜虫的植株，杯口覆盖细网并用胶带固定图2B).
    4. 将有蚜虫侵害的植物放入托盘中，并置于可控环境培养室（16小时光照:8小时黑暗，22 °C，70%湿度）内培养。
  3. 每周将蚜虫转移到新鲜的植株上以维持种群（2.2.1–2.2.3）。
    1. 安全转移1–3个2nd 或 3rd 若虫和1头成虫期蚜虫，使用口吸管（图2A、图3).
      注意：最好通过转移无翅个体来维持品系。
    2. 用剪去顶部并覆盖细网、再用胶带固定的塑料杯制成杯笼，将受蚜虫侵扰的植物稳妥罩住。
    3. 将植物放入托盘中，并将蚜虫置于环境培养箱内（16小时光照：8小时黑暗，22 °C，70%湿度）。
    4. 或者，若需要且寄主植物质量较好，可使用乙醇真空瓶来减少种群数量，仅保留一只繁殖成虫和两到三只2龄或3龄若虫。
  4. 为在实验中使用同龄群体，可将最多5只成虫（最好为无翅型）从原种群转移至新的寄主植物上。
    1. 24小时后移除成虫。
    2. 约5至7天后，当F1 子代成虫成熟后，将最多5只无翅F1 24小时后，将成虫从新寄主植物上移除。
    3. 一旦 F2 当该种群已发育至成年阶段时，即可用于实验。
      注意：此步骤可确保实验群体的年龄大致相同，且其母体的年龄也大致相近。
  5. 使用微卫星基因分型（如下所述，第3节）确认野外捕获的同基因型品系之间的基因型差异 & 4).

3. DNA 提取

  1. 准备
    1. 使用无菌技术配制 1 L 裂解缓冲液（0.1 M NaCl，0.2 M 蔗糖，0.1 M Tris（pH 9.1），0.05 M EDTA，0.05% SDS）。
    2. 将加热块或水浴锅预热至 65 °C。
  2. 组织匀浆与裂解
    1. 将蚜虫置于无菌的 1.5 mL 微量离心管底部附近。
    2. 将无菌研杵放入含有蚜虫的管中，并将管底浸入液氮中。
      注意：当蚜虫位于研杵与管壁之间时，可实现最佳的组织破碎效果。
    3. 用研杵研磨蚜虫，初步裂解细胞。
    4. 对于单只成年蚜虫，使用 200 µL 裂解缓冲液（分为 2 × 100 µL 两份）。加入第一份缓冲液，研磨并重悬破碎的蚜虫，直至样品明显分散；然后使用第二份缓冲液冲洗研杵。
    5. 将破碎的蚜虫在 65 °C 水浴或加热块中孵育 30 分钟。
  3. DNA 沉淀
    1. 在管子仍温热时，加入 14 µL 8 M KOAc，倒置混匀。将样品置于冰上静置 30 分钟。
      注意：此步骤可暂停，样品可在 -20 °C 保存最多 24 小时。
    2. 在室温下以 13,000 x g 离心 15 分钟。用移液器将上清液转移至新的 1.5 mL 管中，注意避免吸取沉淀的杂质。
    3. 为提高 DNA 沉淀的可见性，可在上清液中加入 2 µL 甘油（20 µg/mL）。若样品量足够大，可省略此步骤。
    4. 向上清液中加入 200 µL 冷的 100% 分子级乙醇。倒置混匀后，在室温下孵育至少 15 分钟。
      注意：此步骤可暂停，样品可在 -20 °C 保存最多 24 小时。
    5. 在室温下以 13,000 x g 离心 15 分钟。用移液器小心吸除乙醇。
  4. DNA 洗涤与洗脱
    1. 加入 200 µL 冷的 70% 分子级乙醇，轻轻弹动管子以重悬并洗涤沉淀。
    2. 在室温下以 13,000 x g 离心 5 分钟。观察沉淀时，小心用移液器吸除乙醇，然后加入 200 µL 冷的 100% 分子级乙醇。
    3. 在室温下以 13,000 x g 离心 5 分钟。观察沉淀时，小心用移液器吸除乙醇。
      注意：如有必要，可重复 100-70-100 乙醇洗涤步骤。
    4. 将沉淀在纸巾上水平敞口放置，空气干燥 5–10 分钟。
    5. 用 80 µL 低 TE 缓冲液（10 mM Tris-HCl，0.1 mM EDTA）重悬 DNA 沉淀。
    6. 使用分光光度计定量重悬的 DNA。
    7. 在 4 °C 保存。

4. 蚜虫基因分型的微卫星PCR与测序

  1. 订购适用于微卫星测序的相应正向（F）和反向（R）引物（表120）。
    注意：反向引物序列应进行修饰，添加5'-6-FAM或5'-5-HEX荧光标记，以便实现微卫星测序样本的多重分析。
  2. 使用单个蚜虫DNA样本（见第3节）和荧光标记的微卫星引物进行PCR扩增。
    1. 按照试剂制造商的说明书配制PCR反应体系（每种F/R引物各0.2 µM，2.5 mM MgCl2，DNA模板50–200 ng）。
    2. 采用以下PCR仪程序：94 °C预变性4分钟；随后进行35个循环，每个循环包括94 °C变性30秒、58 °C退火35秒、72 °C延伸45秒；最后72 °C终延伸10分钟。
  3. 将带有不同荧光标签的PCR样本合并，以减少需要测序的样本数量，并在基因分型平台进行微卫星样本测序。
  4. 使用微卫星分析软件对.fsa原始数据文件进行分析。

5. RNA 提取

  1. 用1.5 mL无RNase/DNase的离心管收集蚜虫样品用于RNA提取，并立即在液氮中速冻。
    注意：如果后续步骤不能立即进行，样品可在-80 °C下保存。
  2. 组织匀浆
    1. 将装有蚜虫的离心管连同无菌研杵一起置于液氮中冷冻10–15秒，直至样品停止发出嘶嘶声。按照步骤3.2所述，用研杵充分研磨蚜虫。
      注意：当蚜虫位于研杵与管壁之间时，可实现最佳的组织破碎效果。
    2. 在通风橱中，向样品（1–5只成年蚜虫）加入800 µL异硫氰酸胍-苯酚-氯仿提取试剂。用研杵充分匀浆样品，随后丢弃研杵。
  3. 相分离
    注意：所有步骤均应在通风橱中进行。
    1. 将匀浆后的样品在室温下孵育5分钟。向样品中加入160 µL氯仿，手动剧烈振荡15秒。
    2. 在室温下孵育2–3分钟，然后在4 °C下以12,000 x g离心15分钟。
      注意：离心后混合物分为三层——下层为红色的苯酚-氯仿相，中间为界面层，上层为无色水相。RNA完全保留在水相中。水相体积约为480 µL。
  4. RNA沉淀
    1. 在通风橱中，将水相转移至新的无RNase离心管中，注意不要扰动中间相。
    2. 加入400 µL异丙醇以沉淀RNA，并将样品在-20 °C下孵育10分钟。
      注意：本步骤可暂停，样品可在-20 °C下保存最多24小时。
    3. 在4 °C下以12,000 x g离心10分钟。
  5. RNA洗涤与洗脱
    1. 小心吸除上清液，注意观察RNA沉淀。
    2. 用1 mL 75%乙醇（溶于DEPC处理水中）洗涤RNA沉淀。缓慢涡旋混匀。在4 °C下以7,500 x g离心5分钟。
    3. 重复步骤5.5.1–5.5.2，以帮助去除苯酚类污染物。
    4. 吸除上清液，将离心管水平敞口置于无菌操作台面上，空气干燥沉淀5–10分钟。注意不要使RNA沉淀完全干燥。
    5. 将RNA沉淀溶于30 µL无RNase水或DEPC处理水中。轻轻吹打混匀。在55–60 °C下孵育10–15分钟。

6. RNA测序 从头合成 转录组组装、注释与差异表达分析

  1. 使用基于芯片的毛细管电泳系统分析RNA样本的浓度和质量。
    注意：与使用分光光度计分析相比，基于芯片的毛细管电泳系统是更优选的方法，因为它能更准确、更灵敏地测定RNA的浓度和质量。
    1. 若样品质量合格（总量 ≥ 250 ng，RNA 完整性数值 RIN ≥ 5），则进行 RNA 测序。
      注意：重要的是，因为该测序数据将同时用于表达谱分析和 从头合成 转录组组装中，更高的测序深度将产生更高质量的转录组。使用Illumina测序技术进行较为全面的组装时，建议起始测序量为1亿至2亿条100 bp的双端测序读长。总mRNA文库构建及RNA测序由测序机构完成。
  2. 使用 Fast QC 检查测序读段质量22.
  3. 合并所有样本的测序读段并组装转录组 从头合成 使用 Trinity23,24 （启用 Trimmomatic 质量过滤）。
  4. 优化组装过程
    1. 使用 TransDecoder25 鉴定长度至少为100个氨基酸的开放阅读框（ORFs）。
    2. 对翻译出的开放阅读框进行 Pfam 同源性搜索26 和 UniProt27 使用BLASTP进行数据库搜索28 和 HMMER29分别。
    3. 去除细菌转录本（任何其最佳BLAST比对结果为细菌基因，且比特分数超过300、氨基酸序列一致性不低于50%的翻译序列）。
    4. 使用 CD-HIT 合并所有在氨基酸水平上至少 99% 相同的完整已翻译 ORF30.
    5. 使用 CD-HIT 合并其余在核苷酸水平上至少 95% 相同的不完整 ORF30.
    6. 为剩余的核苷酸序列分配具有唯一性的物种特异性标识符（例如， APHNE 0001
  5. 使用BUSCO（http://busco.ezlab.org/）和节肢动物基因数据集评估优化后基因组组装的完整性31.
  6. 转录组注释
    1. 首先，使用 HMMER 将精细转录组与 Pfam 数据库进行比对以完成注释26,29.
    2. 其次，使用 BLASTP 将转录组与 UniProt 数据库进行比对以完成注释27,28.
    3. 第三，利用已发表并注释基因组的选定昆虫的编码序列，通过BLASTP对转录组进行注释。
    4. 最后，仅使用BLASTP针对豌豆蚜虫蛋白质数据库对转录组进行注释。
    5. 使用 Trinotate 根据 UniProt 登录号生成 GO 注释。
    6. 使用 Trinotate 将所有注释结果整合到一个 SQLite 数据库中，并生成注释报告。
  7. 差异表达分析
    注意：以优化后的转录组作为参考，分别对每个文库进行比对和定量。
    1. 使用 Trimmomatic 对原始测序读段文件进行质量过滤和修剪32.
      注意：如果在 Trinity 组装后执行此步骤，可改用该步骤中 Trimmomatic 的输出结果。
    2. 使用 Bowtie2 对每个样本进行局部比对33.
    3. 使用 SAMtools 从每个样本中单独提取读段计数34.
    4. 使用 DESeq2 及其默认参数和参数化拟合方法，计算目标样本间的差异表达35.

7. 差异表达基因的qPCR验证

注意：如果用户希望研究其RNA测序实验中差异表达的基因，可采用以下方案验证差异表达模式。

  1. 按照上述方法（步骤5）制备RNA样品。
  2. 使用分光光度计对RNA提取物进行定量，以检测其质量并获得浓度。
  3. 根据制造商的建议，使用 commercially available 的试剂盒合成cDNA样品。
  4. 测定目的基因的引物扩增效率，以确保准确的两倍PCR扩增。
    1. 根据原始RNA浓度，进行连续稀释（101），获得3种cDNA浓度。
    2. 使用定量PCR预混液，按照制造商的方案，将三份重复的qPCR反应混合，采用三种不同的引物浓度（例如，100 nM、200 nM、300 nM）与三种连续稀释的cDNA浓度（例如，0.1 ng/µL、10 ng/µL、100 ng/µL）组合。
    3. 针对每个目标基因，以各样品的平均Ct值为因变量，以cDNA浓度的对数（log）为自变量，计算所得直线的斜率（m）（共三个数据点）。
    4. 使用以下公式计算引物效率（E），其中m为步骤7.4.3中计算得到的斜率：
      E = 10^(-1/m)
      注：引物效率在90–110%之间时适用于后续分析。该步骤可确保所有参与计算的基因均实现均等扩增。
  5. 采用ΔΔCt法并结合看家基因，对目的基因的差异表达水平进行定量36。

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结果

植物培养：种子生长至可移栽的大小所需时间约为两到四周，具体时长取决于季节（图1A）。移栽后的幼苗还需再经过两到四周的生长，以达到适合进行蚜虫培养的最佳大小（图1B）。

蚜虫培养：成虫 A. nerii 可通过部分深色化的尾片进行区分，其形态可分为无翅型（无翅型，图3A、B）或有翅型（有翅型，图3C, D）。若若虫发育至第三龄期，可观察到翅芽的形成（

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讨论

人们早已认识到，具有警戒色的A. nerii可为研究植物防御机制（尤其是化学物质积累）的抗性模式与机理提供重要线索18,37。近年来，针对A. nerii的多种基因组资源相继建立10，为以A. nerii为模型开展生态学与功能基因组学研究提供了新的机遇。本文概述了蚜虫与植物培养以及分子/基因组技术的基本实验方案，并假设未来对该物种的研究很可能涉及基因组学与功能生态学方法的应用。关于A. nerii中强心甾类毒素的解毒与积累机制及其生物学意义，仍有许多未解的问题。在此方面，诸如RNA干扰（RNAi）介导的基因表达抑制或基因编辑等技术将具有重要应用价值。

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

我们感谢 Michelle Moon（范德堡大学）在摄影方面提供的帮助。范德堡大学为 PA 提供了支持，SSLB 获得 DGE-1445197 项目资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Sun Gro Fafard 发芽培养基混合物Hummert International10-0952-2
Sun Gro Fafard 3B/基质混合物Hummert International10-0951-2
2" x 4" 圆形标准育苗盆Anderson Pots1503
DreamTaq DNA 聚合酶ThermoFisher ScientificEP0701
TrizolThermoFisher Scientific15596026
SuperScript® III 第一链合成试剂盒ThermoFisher Scientific18080051
Power SYBR Green PCR 主混合液ThermoFisher Scientific4367659

参考文献

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