维持 Aphis nerii 的生物培养及基因表达检测：植物-昆虫互作研究中的非模式系统

摘要

蚜虫Aphis nerii定殖于夹竹桃科（Apocynaceae）这类具有高度防御能力的植物上，为研究植物与昆虫之间的相互作用提供了丰富的研究机会。本文中，我们介绍了一系列用于维持植物和蚜虫培养物，以及生成和分析A. nerii分子和组学数据的实验方案。

摘要

蚜虫是研究多种生物学问题的优良实验模型，其研究范围涵盖共生关系的进化、多型现象的发生，以及昆虫与寄主植物相互作用等相关问题。目前已有多种蚜虫物种的基因组资源，随着新一代测序技术的发展，转录组学研究正逐步扩展到缺乏完整基因组的非模式生物。此外，蚜虫种群可从野外采集并在实验室中培养，用于个体水平和分子水平的实验，从而弥合生态学与遗传学研究之间的鸿沟。最后，许多蚜虫可在实验室中依赖其偏好的寄主植物，以持续性的孤雌生殖生命周期进行培养，从而实现对无性繁殖基因型的比较研究。Aphis nerii（夹竹桃蚜，又称马利筋蚜）即为一种可用于结合个体与分子实验研究昆虫与有毒植物相互作用的典型模型。本文概述并讨论了在温室和实验室中建立与维持植物和蚜虫培养物的方法、DNA与RNA提取、微卫星分析、从头转录组组装与注释、转录组差异表达分析，以及差异表达基因的qPCR验证。

引言

蚜虫是一类小型半变态昆虫，广泛定殖于全球多种植物科属。其显著特征包括复杂的生活史，涉及周期性孤雌生殖和明显的多型现象，以及与细菌或酵母类内共生体之间必需的营养共生关系，后者为其缺乏营养的植物汁液食谱提供必需营养物质¹尽管大多数蚜虫是专一寄主植物的，但一些广食性种类是重要的农作物害虫，它们通过直接取食或传播病原体和病毒，对农作物造成显著的经济损失。². 2010年，首个蚜虫基因组——豌豆蚜虫基因组的发表 Acyrthosiphon pisum³，标志着蚜虫生物学研究的一个重要里程碑，因为它提供了基因组资源，可用于探究该昆虫对植食性生活方式的适应机制，包括可能有助于开发更有效防控策略的相关问题⁴自那时起，随着大豆蚜虫注释基因组的发表，相关的基因组资源不断积累 Aphis glycines⁵，以及另外三种蚜虫物种公开可用的全基因组资源（Myzus cerasi （黑樱桃蚜虫）， Myzus persicae （桃蚜） Rhopalosiphum padi （禾谷缢管蚜）⁶. 有价值的 从头合成 转录组资源也可用于其他多种蚜虫物种（例如，Ap....

方案

1. 植物培养

1. 从任何商业供应商处购买种子，或从田间成熟的植株上采集。
   注意：本方案适用于大多数市售的马利筋物种（例如，Asclepias incarnata、A. syriaca、A. curassavica、Gomphocarpus physocarpus）。部分种子可能需要进行低温层积处理，应查阅种子供应商提供的说明。
2. 将种子播种于细质发芽基质中（60–70% 细泥炭藓、珍珠岩、蛭石、石灰石）。
   1. 用发芽基质填满标准育苗盘，确保基质填至育苗穴顶部。在每个育苗穴中压出一个凹痕，形成约 3 cm 深的孔洞。
   2. 在每个孔洞中放入一粒种子，并用喷壶充分浇水，使基质覆盖种子并达到饱和状态。
   3. 在温室中培养种子（见下文 1.5 条件）。定期浇水，每天或隔天一次，保持土壤湿度处于中等水平。
3. 当幼苗长出第一组完整叶片后，将其移栽至通用型盆栽基质中（50–60% 泥炭藓、树皮和石灰石）（图1A）。
   1. 使用可与杯状笼紧密贴合的 4 英寸圆形花盆。填入通用型盆栽土，至距盆口约 5 cm 处。
   2. 在土壤中挖一个足够深的孔洞，直至触及盆底。

结果

植物培养：种子生长至可移栽的大小所需时间约为两到四周，具体时长取决于季节（图1A）。移栽后的幼苗还需再经过两到四周的生长，以达到适合进行蚜虫培养的最佳大小（图1B）。

蚜虫培养：成虫 A. nerii 可通过部分深色化的尾片进行区分，其形态可分为无翅型（无翅型，图3A、B）或有翅型（有翅型，图3C, D）。若若虫发育至第三龄期，可观察到翅芽的形成（

讨论

人们早已认识到，具有警戒色的A. nerii可为研究植物防御机制（尤其是化学物质积累）的抗性模式与机理提供重要线索^18,37。近年来，针对A. nerii的多种基因组资源相继建立¹⁰，为以A. nerii为模型开展生态学与功能基因组学研究提供了新的机遇。本文概述了蚜虫与植物培养以及分子/基因组技术的基本实验方案，并假设未来对该物种的研究很可能涉及基因组学与功能生态学方法的应用。关于A. nerii中强心甾类毒素的解毒与积累机制及其生物学意义，仍有许多未解的问题。在此方面，诸如RNA干扰（RNAi）介导的基因表达抑制或基因编辑等技术将具有重要应用价值。

在饲养蚜虫的过程中，其中一个挑战在于它们极强的繁殖和扩散能力。这些特性直接导致蚜虫成为严重的农业害虫，因此在实验需要同基因型品系时，蚜虫培养几乎需要每天照看，并需格外小心。上述所描述的技术，包括用于获.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Sun Gro Fafard 发芽培养基混合物	Hummert International	10-0952-2
Sun Gro Fafard 3B/基质混合物	Hummert International	10-0951-2
2" x 4" 圆形标准育苗盆	Anderson Pots	1503
DreamTaq DNA 聚合酶	ThermoFisher Scientific	EP0701
Trizol	ThermoFisher Scientific	15596026
SuperScript® III 第一链合成试剂盒	ThermoFisher Scientific	18080051
Power SYBR Green PCR 主混合液	ThermoFisher Scientific	4367659