一种肺动脉干缩窄压力超负荷诱导右心室肥厚与衰竭的模型

摘要

我们介绍一种在大鼠中诱导右心室肥厚和心力衰竭的手术方法。

摘要

由持续性压力超负荷引起的右心室（RV）衰竭是多种心肺疾病中导致发病和死亡的重要因素。因此，有必要建立可靠且可重复的右心室衰竭动物模型，以研究疾病的发病机制及潜在治疗策略的效果。肺动脉干缩窄术是一种诱导孤立性右心室肥厚的常用方法，但总体而言，既往报道的模型通常未能成功建立稳定的右心室肥厚及衰竭模型。

我们介绍一种通过肺动脉干缩窄术（PTB）诱导压力超负荷所致右心室肥厚的大鼠模型，该模型可实现伴有或不伴有右心室衰竭的不同右心室肥厚表型。我们采用改良的结扎夹施加器，将钛夹环绕肺动脉干压缩至预设的内径尺寸。通过使用不同直径的夹子，可诱导从轻度右心室肥厚到失代偿性右心室衰竭的不同疾病进展阶段。

在大鼠中实施肺动脉瓣上缩窄术（PTB）后，右心室肥厚会稳定地发展。根据所用结扎夹的直径，我们能够准确地复制出不同严重程度的疾病模型，范围从代偿性肥厚到伴有心外表现的严重失代偿性右心室衰竭。

所展示的PTB模型是一种有效且稳健的压力超负荷诱导右心室肥厚及衰竭的模型，相较于其他缩窄模型具有多项优势，包括可重复性高，以及能够诱导出严重且失代偿的右心室衰竭。

引言

右心室（RV）能够适应持续的压力超负荷。然而随着时间推移，适应性机制无法继续维持心输出量，右心室发生扩张，最终导致右心室功能衰竭。右心室功能是多种心肺疾病的主要预后因素，包括肺动脉高压（PAH）、慢性血栓栓塞性肺动脉高压（CTEPH）以及各种导致右心室压力（或容量）超负荷的先天性心脏病。尽管进行了积极治疗，右心室衰竭仍是这些疾病最主要的死亡原因。

由于右心室（RV）具有独特的特性^1,2和胚胎发育过程³，源自左心衰竭的研究成果无法直接外推至右心衰竭。因此，需要建立右心衰竭的动物模型，以研究右心室功能障碍的机制及潜在的药物治疗策略。

已有由SU5416联合低氧（SuHx）⁴ 或野百合碱（MCT）⁵ 诱导的肺动脉高压实验模型，这些模型通过肺血管系统疾病继发引起右心室（RV）衰竭。这些模型常用于评估靶向肺血管系统的药物治疗效果。SuHx模型和MCT模型均为非固定后负荷的右心室衰竭模型。因此，无法判断干预后右心室功能的改善是继发于降低肺血管后负荷的作用，还是由对右心室的直接作用所致。此外，MCT模型还具有多种心外效应。

在实验性肺动脉干缩窄模型中，由于对肺动脉干施加了机械性缩窄，右心室的后负荷被固定。这使得能够独立于肺血管效应，研究干预措施对右心室的直接心脏作用^6,7,8,9。通常，缩窄操作是通过将一根针平行置于肺动脉干旁，然后在针和肺动脉干外围结扎缝线，打结后移除针，从而在肺动脉干周围留下缩窄环。根据所用针的规格不同，可实现不同程度的缩窄。然而，尽管该方法被广泛使用，仍存在一些缺点。首先，由于缝线是围绕针和肺动脉干一同打结的，因此缩窄环的直径并不完全等于针的外径。其次，打结的松紧程度可能存在显著差异，导致特定程度的缩窄难以重复，从而引起缩窄直径的变异，造成更大的离散性。最后，结扎线可能随时间推移而松脱。

一项研究在肺动脉干周围应用了一种半闭合的钽夹¹⁰。他们将钽夹压缩至肺动脉干周围，使其内径面积为1.10 mm²，并与使用18 G针头缝线缩窄的模型大鼠进行比较。总体而言，使用钽夹进行缩窄与较少的围手术期并发症和数据变异相关。

基于 Schou 所述的原理 等¹¹我们进一步开发并表征了肺动脉干缩窄（PTB）诱导右心室肥厚与衰竭的动物模型。本文基于既往研究结果，介绍我们应用该模型的经验^12,13在此模型中，将钛夹压缩至肺动脉干周围，使其达到精确预设的内径，可通过调整该内径以诱导出不同的右心室衰竭表型。

方案

所有大鼠均按照丹麦动物实验法及动物实验部长令中所述的丹麦国家准则进行处理。所有实验均经机构伦理审查委员会批准，并依据丹麦动物研究法（司法部授权编号 2012-15-2934-00384）进行。

1. 结扎夹施加器的调节

注意：肺动脉干缩窄术使用一种带有角度钳口的改良开放式结扎夹施夹器进行。该施夹器经过改造，配备可调节限位装置，当钳口相互达到特定距离时，限位装置可自动停止进一步加压。当使用该改良施夹器压缩小型钛制结扎夹时，夹子两臂之间会保留一个特定直径的管腔，其大小取决于限位装置的调节设置（图1）。

1. 选择所需条带的直径，例如, 0.6 mm
2. 调节结扎夹施夹器，使钳口在完全闭合时间距为1.0 mm。由于夹子的两个支脚厚度各为0.2 mm，因此可留下0.6 mm的管腔。

图1：PTB 手术操作示意图。（A）用于 PTB 手术的手术器械，包括结扎夹施加器（蓝色箭头所示）。（B）结扎夹施加器的可调节限位装置。旋转齿轮（蓝色箭头）可调节限位销（黄色箭头）的位置，当施加器的钳口相互闭合至特定距离时，限位销将阻止其进一步闭合。该距离对应于夹子腿厚度的两倍加上夹子压缩状态下的内径，可通过已知外径的针头等标准物进行校准。（C）施加器将钛夹压缩至通过调节施加器预设的精确内径。（D）可通过调节压缩后夹子的内径，诱导不同程度的右心室肥厚与功能衰竭。在本研究展示的数据中，采用 1.0 mm 的内径以诱导轻度右心室肥厚，0.6 mm 的内径以诱导中度右心室衰竭，0.5 mm 的内径以诱导重度右心室衰竭。（E）夹子围绕肺动脉干放置后的状态。请点击此处查看该图的放大版本。

2. 大鼠的准备

注意：可采用其他镇痛药给药方案。

1. 使用体重约为 100–120 g 的 Wistar 大鼠幼鼠。为在手术期间维持体温，请使用带覆盖物的加热垫。
2. 手术过程中使用机械呼吸机，设置潮气量约为 1.75 mL，呼吸频率为每分钟 75 次。
3. 将大鼠置于诱导室中，用七氟烷（7% 与 1.5 L/min 的 O₂ 混合）麻醉 5 分钟。使用 17 G 静脉留置针进行气管插管，针尖远端 2 mm 已剪除，以便软导管覆盖针尖。拔出针芯后，将留置针连接至呼吸机。
4. 将大鼠仰卧放置于加热垫上。通过观察胸壁运动确认插管位置正确。胸壁运动应无左右差异，并与呼吸机节律同步。
   注意： 若无胸壁运动、出现腹部收缩或左上腹胃部膨胀，提示导管位置错误。应拔出导管，将大鼠重新放入诱导室并再次插管。
5. 正确插管后，将七氟烷浓度下调至维持水平（3.5% 与 O₂ 混合，1.5 L/min），并将大鼠四肢固定于加热垫上。
6. 使用镊子夹捏大鼠足部，检查四肢回缩反射，以确认麻醉深度。
7. 皮下注射布托啡诺（0.1 mg/kg）和卡洛芬（5 mg/kg）以缓解术后疼痛。
8. 剃除胸部毛发，并用氯己定消毒。

3. 肺动脉干的分离

1. 用剪刀沿胸骨中段的皮肤做一处 2 cm 的切口。辨认胸大肌并切断其胸骨附着处。辨认第 2 肋^nd, 3^rd，以及 4^th 下方的肋状突起。
2. 可选地，抓取 2^nd 用持针钳夹住肋骨，用缝线（4-0，多股，可吸收）在2周围缝合^nd 第1条肋骨^st 肋间隙至第2肋骨下内侧部分^nd 肋间隙。打一个牢固的结以结扎胸廓前动脉。
   注意： 如果前胸部动脉出血是一个反复出现的问题，这种方法可能很有用。
3. 切下 4^th, 3^rd，以及 2^nd 用剪刀沿靠近胸骨的肋骨进行剪开，并仔细分离肋间肌，直至完成左侧开胸术。若胸廓内动脉出现出血，应用血管钳压迫止血并结扎该动脉。
4. 在胸骨与肋骨之间插入拉钩，并撑开以获得良好的手术视野。视野上方为覆盖主动脉和肺动脉干的胸腺。使用止血钳小心提起胸腺，并将其向上翻起，以暴露下方的主动脉和肺动脉干。
5. 用小型手术钩的尖端引导 85° 通过位于左心耳后方的横位心包窦穿入，将线从中穿过一半并回拉，引导耳钩尖端向上，直至其出现在升主动脉与肺动脉干之间。
   1. 使用虹膜剪去除覆盖在尖端的任何结缔组织，以分离肺动脉干与升主动脉。
   2. 可选：使用更大的钩子重复该步骤。
6. 用弯角肌用镊子经钩子开辟的通道绕过肺动脉干。夹住一段约10 cm长的结扎线（4-0，多股）一端，将其中一半长度的结扎线经该通道拉回。此时肺动脉干已与升主动脉分离，并可通过其周围的结扎线进行控制。

4. 夹子的应用

1. 将调整好的结扎夹施加器装入一个夹子。小心地将其中一个钳口和夹子的一条腿穿过肺动脉干周围的通道。利用结扎线轻轻上提肺动脉干，并将其拉入夹子的叉状结构中。
2. 当肺动脉干位于夹子的叉状结构内，且夹子两条腿的尖端均无结缔组织阻碍时，压下施加器闭合夹子，完成缩窄环扎。
3. 观察右心室（RV）在环扎后立即出现的扩张反应，并移除结扎线。

5. 关闭胸腔

1. 取出胸腺中的棉签，并将胸腺复位至其自然位置。移除牵开器。
2. 分三层缝合胸腔：肋间层、胸大肌层和皮肤（使用4-0多股可吸收缝线）。皮下注射2 mL生理盐水，以补充手术过程中丢失的体液。
3. 关闭七氟烷麻醉，继续将大鼠连接于呼吸机（1.5 L/min氧气）直至其自主呼吸恢复，随后拔除气管插管。
4. 术后三天内通过饮水给予布托啡诺镇痛¹⁴，或采用类似的镇痛方案。三天后，大鼠应已恢复，且无不适表现。
5. 在接下来的数周内，应每日评估大鼠的健康状况及可能的不良反应。术后第一周应特别关注开胸切口的愈合情况，以便及时发现感染或瘢痕愈合不良的迹象。若大鼠出现生长迟滞的表现，如毛发竖立、活动能力下降、呼吸困难或体重减轻，应密切监测；若体重减轻超过20%或出现急性呼吸衰竭，应实施安乐死。

6. 假手术

1. 除不进行夹闭操作（步骤4）外，其余步骤均按上述操作进行假手术。

结果

根据本课题组先前研究所述的肺动脉瓣下缩窄（PTB）操作方法^12,13，我们采用1.0 mm夹闭器进行缩窄以诱导右心室肥厚（PTB轻度），采用0.6 mm夹闭器造成中度右心室功能障碍（PTB中度），采用0.5 mm夹闭器造成重度右心室功能障碍（PTB重度）。接受重度缩窄的大鼠出现了右心室功能障碍相关的心外表现，包括肝功能衰竭和腹水（图5E）。所有大鼠均在PTB手术后七周进行评估，假手术组大鼠接受相同操作但未使用夹闭器。围手术期死亡率低于1/6。重度缩窄组大鼠的七周存活率为80%，而轻度或中度缩窄组及假手术组大鼠的存活率接近100%。

为评估PTB手术的效果，我们采用超声心动图结合心脏磁共振成像（MRI）来测定右心室（RV）容积和心输出量。三尖瓣环平面收缩期位移（TAPSE）通过心...

讨论

我们介绍一种简便且高度可重复的肺动脉干缩窄方法，该方法使用改良的结扎夹施加器将钛夹压缩于肺动脉干周围。通过调节施加器以将钛夹压缩至不同的内径，可诱导出不同程度的右心室肥厚和功能障碍表型，包括伴有心外失代偿表现的重度右心室衰竭。

尽管该方案较为简单，但仍包含几个关键步骤。重要的是，大鼠在接受肺动脉缩窄术（PTB）时体型不能过大。根据我们的经验，体重为100–120 g的Wistar大鼠幼仔适用于该手术。在体型较大的大鼠中，实施严重的缩窄可能导致急性右心室衰竭和死亡。其他研究^{6,7,8,9,10,16} 主要使用体型更大的大鼠（160–260 g），但其相应的缩窄直径也更大（1.27–1...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
17 G IV Venflon 留置针	Becton Dickinson, US	393228	针头远端 2 mm 已被切除
1 mL 注射器 + 26 G 针头	Becton Dickinson, US	303172 & 303800
4-0 可吸收多股缝线	Covidien, US	GL-46-MG	Polysorb，紫色，5x18"
4-0 多股结扎线	Covidien, US	LL-221	Polysorb，紫色，98"
布托啡诺	Indivior UK Limited		本地采购，Temgesic 0.3 mg/mL
卡洛芬	ScanVet, DK	27693	Norodyl 50 mg/mL
氯己定	Faaborg Pharma, DK		本地采购
持针器（Contractor）	Aesculap, Germany	BV010R	钝头，自持式，70 mm
耳钩	Lawton, Germany	66-0261	小型，14 cm，尖端改装为 85° 角度
眼用凝胶	Decra, UK		Lubrithal，本地采购
精细组织镊	Lawton, Germany	09-0020
解剖镊	Lawton, Germany	09-0013	1 把常规，1 把尖端改装为 100° 角度
气体麻醉系统	Penlon Limited, UK	SD0217SL	Sigma Delta 蒸发器
毛发修剪器	Oster	76998-320-051
Horizon 开放式结扎夹施加器	Teleflex, US	137085	改装带可调节限位装置
Horizon 钛夹	Teleflex, US	001200	小型
诱导室	N/A
虹膜剪	Lawton, Germany	05-1450
虹膜剪	Aesculap, Germany	BC060R
机械呼吸机	Ugo Basile, Italy	7025
显微剪	Lawton, Germany	63-1406
显微镜	Carl Zeiss, Germany	303294-9903
持针钳	Lawton, Germany	08-0011	TITEGRIP
止血钳	Lawton, Germany	06-0100	Halsted-Mosquito，直型
Pro-Optha	Lohmann & Rauscher, Germany	16515	棉片
生理盐水 9 mg/mL	Fresenius Kabi, DK	209319
七氟烷	AbbVie, US		Sevorane，本地采购
手术钩	Lawton, Germany	51-0665	Cushing，19 cm，尖端改装为 90° 角度
手术胶带	3M, US	1530-0	Micropore
温度控制器	CMA Microdialysis; Sweden	8003760	CMA 450
电子天平	VWR, US
断奶期 Wistar 大鼠	Janvier Labs, France		RjHan:WI，100–120 g