单液滴数字聚合酶链式反应用于热点区域突变的全面同步检测

摘要

本文介绍一种利用液滴式数字PCR（drop-off ddPCR）和一对独特的水解探针，在单次反应中精确定量目标区域多种基因改变的实验方案。

摘要

微滴数字聚合酶链式反应（ddPCR）是一种高灵敏度的定量聚合酶链式反应（PCR）技术，其原理是将样本分割成数千个纳米级的油包水独立反应单元。近年来，ddPCR 已成为循环肿瘤 DNA（ctDNA）检测中最准确且最敏感的工具之一。标准 ddPCR 技术的主要局限性在于每反应所能筛查的突变数量有限，因为需要针对每种可能的等位基因版本设计特异性的水解探针。一种替代方法——drop-off ddPCR 技术可提高检测通量，因其仅需一对探针即可检测和定量目标区域内可能存在的全部遗传变异。drop-off ddPCR 的灵敏度与传统 ddPCR 相当，且具有在单次反应中检测更多突变的优势。该方法成本效益高，节省珍贵的样本材料，且在突变位点未知时亦可作为发现工具使用 先验的.

引言

已报道了数千种与癌症发展相关的体细胞突变¹其中，少数是靶向治疗疗效的预测性标志物 ^2,3 这些突变的基因检测现已成为常规临床实践。微滴数字PCR（ddPCR）技术可用于高精度检测突变的存在或缺失，且与无创液体活检具有高度兼容性。^4,5然而，目前的数字滴液聚合酶链式反应（ddPCR）检测主要设计用于检测已知突变 先验的这严重限制了在突变未知时将ddPCR用作发现工具的应用。事实上，在传统的ddPCR设计中，识别野生型等位基因的水解探针（WT探针）与识别突变型等位基因的特异性探针（MUT探针）相互竞争。图1A）。亲和力较高的探针与模板杂交并释放其荧光团，从而指示相应等位基因的性质。每个液滴获得的荧光数据可在散点图中可视化，分别以不同维度表示野生型（WT）和突变型（MUT）探针发出的荧光。图中展示了常规数字液滴PCR（ddPCR）检测的典型结果示意图。 图1A在此示例中，蓝色云团对应于由野生型（WT）探针识别出的含有野生型等位基因的液滴，而红色云团对应于由突变型（MUT）探针扩增并识别出的含有突变型等位基因的液滴。根据反应....

方案

本方案遵循居里研究所的伦理准则。所有人体样本均来自在居里研究所机构审查委员会批准的研究项目中，经知情同意后入组的患者。

1. 血液采集、血浆储存及游离DNA提取

注意：可使用从任何类型“组织”中提取的 DNA（例如， 新鲜或甲醛固定石蜡包埋（FFPE）组织、培养细胞或血液样本。本文提供了血液采集、血浆分离与保存以及游离DNA（cfDNA）提取的详细操作步骤。

1. 血液采集与血浆储存图2B)
   1. 使用7 mL EDTA管采集血样。建议采集两管，以获得约4 mL血浆。
   2. 将离心管以820 x g离心10分钟 g 采血后3小时内分离红细胞（RBC）、白细胞（WBC）和血浆。采样至离心的时间间隔对于获得高质量的游离DNA（cfDNA）至关重要。即， cfDNA未被白细胞释放的DNA污染。
   3. 使用1 mL移液器小心吸取上清液（血浆），避免接触白细胞层；通常每根EDTA管可回收约2 mL血浆。
   4. 将血浆转移至2 mL离心管中，将等分试样在16,000 x g 在15 °C下离心10分钟以去除细胞碎片。
   5. 小心吸取上清....

结果

在一项概念验证研究中，采用降落式数字PCR（drop-off ddPCR）策略，对癌症患者的福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织和血浆样本中的KRAS外显子2突变（密码子12和13）以及EGFR外显子19缺失进行了检测⁶。

KRAS 降落探针检测了 KRAS 基因第2号外显子中一个包含多个突变的16 bp区域，该区域涵盖了人类癌症中95%以上的已知 KRAS 突变¹¹。参考探针长度为20 bp，位于下游3 bp处。为了优化我们的检测方法，我们使用了来自含有两种最常见的 KRAS 突变氨基酸的细胞系中提取的DNA：G12V（c.35GT，SW480）和 G13D（c.38GA，HCT 116）。

讨论

为了设计高效的drop-off数字PCR（ddPCR）检测方法，优化至关重要，且必须严格遵循实验方案。每一对引物和探针组合都具有独特的PCR反应效率，因此在将检测方法应用于珍贵的测试样本之前，必须先在对照样本上对其进行仔细验证。优化和验证对于确保达到最佳信号检测、评估特异性和灵敏度非常重要。如实验方案所述，位于"probe 2"覆盖的目标区域内的所有突变均有可能被检测。然而，对于位于"probe 2" 5'端或3'端的突变，建议进行额外验证，因为这些位置的突变可能会影响drop-off检测的效率。

本文所述方法可用于从任何类型的"组织"中提取的DNA，包括FFPE组织、培养细胞或血液样本。然而，核酸提取的质量会显著影响ddPCR结果。在采样和纯化步骤中，必须尽可能去除肝素、蛋白质、血红素、苯酚、蛋白酶、胶原蛋白、黑色素、去垢剂或盐类等PCR抑制物。尽管可通过稀释DNA样本以降低PCR抑制物对ddPCR的影响，但稀释会降低检测灵敏度，因为每个反应中检测的目标拷贝数将减少。当需要达到特定灵敏度水平时，应考虑这一点，因为必须检测最低数量的拷.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
K2EDTA 管（颜色编码：淡紫色）	BD	367863	EDTA 管用于获取全血或 EDTA 血浆样本
QIAamp 循环核酸提取试剂盒（手动操作方案）	Qiagen	55114	用于从人血浆中分离游离循环 DNA
QIAsymphony DSP 循环 DNA 试剂盒（自动化操作方案）	Qiagen	937556	用于从人血浆中分离游离循环 DNA
QIAsymphony SP 系统	Qiagen	9001297	用于 cfDNA、DNA 或 RNA 纯化的完全集成化和自动化系统
QIAvac 24 Plus	Qiagen	19413	可同时纯化多达 24 个 cfDNA 样本
Qubit 荧光仪	Invitrogen	Q33226	Qubit 荧光仪是一种台式荧光仪，用于 DNA 定量
QX100 或 QX200 读取仪	Bio-Rad	186-3003 或 186-4003，分别对应	读取仪在液滴通过检测器时测量每个液滴的荧光强度，并检测其大小和形状
QX100 或 QX200 液滴生成仪	Bio-Rad	186-3002 或 186-4002，分别对应	用于生成液滴的仪器
C1000 梯度 PCR 仪	Bio-Rad	1851196	模块化热循环仪平台，包含 C1000 Touch 热循环仪主机和 96 孔快速反应模块
PCR 板封膜机	Bio-Rad	181-4000	PX1™ PCR 板封膜机
DG8 卡盒支架	Bio-Rad	186-3051	用于在仪器中定位并固定 DG8 卡盒以进行液滴生成
液滴生成卡盒及垫圈	Bio-Rad	186-4007	微流控 DG8 卡盒用于混合样本与油相以生成液滴；DG8 垫圈用于密封卡盒，防止蒸发并施加液滴形成所需的压力
PCR 超混合液	Bio-Rad	186-3010	适用于探针的 ddPCR 超混合液（不含 dUTP）
96 孔 PCR 板	Eppendorf	951020362	96 孔半裙边板
铝箔封膜	Bio-Rad	181-4040	可穿刺热封铝箔膜
ddPCR 液滴读取油	Bio-Rad	186-3004	读取过程中使用的油
探针用液滴生成油	Bio-Rad	186-3005	用于液滴生成的油
DNA LoBind 管 1.5 mL	Eppendorf	0030 108.051	Eppendorf LoBind 管通过显著减少样本与管壁的结合，最大化样本回收率
多重 I 型 cfDNA 参考标准品套装	HORIZON	HD780	多重 I 型 cfDNA 参考标准品是经过高度表征、具有生物学相关性的参考材料，用于评估检测体细胞突变的 cfDNA 检测方法的性能
QUBIT DSDNA HS 检测试剂盒，500	Life Technologies	Q32854	HS 检测法对双链 DNA（dsDNA）具有高度选择性，优于 RNA，并设计用于初始样本浓度在 10 pg/µL 至 100 ng/µL 范围内的准确检测
Qubit 检测管	Life Technologies	Q32856	Qubit 检测管为 500 µL 薄壁聚丙烯管，专用于 Qubit 荧光仪