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方法文章

兔模型中最佳胚胎阶段的微创胚胎移植与胚胎玻璃化冷冻

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DOI：

10.3791/58055

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2019年5月16日

 ,  ,  , 
1Departament of Animal Science, Institute for Animal Science and Technology (ICTA), Universitat Politècnica de València (UPV), 2Animal Technology and Research Center (CITA), Instituto Valenciano de Investigaciones Agrarias (IVIA)

本文内容

摘要

辅助生殖技术（ARTs）正处于持续评估中，以提高治疗效果并降低相关风险。本文描述了一种微创胚胎移植方法，并结合高效的冷冻保存方案，使得兔子可作为人类生殖研究的理想动物模型。

摘要

辅助生殖技术（ARTs），例如 体外 胚胎培养或胚胎冷冻保存等操作可能影响自然发育模式，并带来围产期和出生后的后果。为确保辅助生殖技术（ART）应用的安全性，有必要开展动物模型研究。此外，作为最后一步，胚胎发育研究还需评估其发育为足月健康子代的能力。在此过程中，将胚胎移植至子宫是开展任何与辅助生殖技术相关实验所不可或缺的环节。

一个多世纪以来，兔被用作研究哺乳动物生殖的模式生物。除了在系统发育上与人类接近、体型小且维护成本低之外，兔还具有重要的生殖特征，例如诱导排卵、早期胚胎发育时间线与人类相似以及妊娠期较短，这些特点使我们能够方便地研究辅助生殖技术（ART）应用后的后果。此外，辅助生殖技术（如胞质内精子注射、胚胎培养或冷冻保存）在该物种中的应用也具有适当的效率。

通过本文介绍的腹腔镜胚胎移植技术和冷冻保存方案，我们阐述了：1）如何采用一种简便、微创的技术进行胚胎移植；2）一种有效的兔胚胎长期保存方案，以提供灵活的时间安排和样本运输能力。在不同发育阶段兔胚胎移植后获得的结果表明，桑葚胚是兔胚胎回收与移植的理想时期。因此，需要进行输卵管胚胎移植，这证明了手术操作的合理性。此外，兔桑葚胚能够成功实现玻璃化冷冻并经腹腔镜移植，证实了所述技术的有效性。

引言

旨在克服人类不孕症、提高高遗传价值家畜的推广效率以及保存动物遗传资源，一系列被称为辅助生殖技术的方法（如超数排卵）被广泛应用， 体外 受精、胚胎培养或冷冻保存技术得到了发展1,2目前，通过给予激素治疗来刺激卵巢，以产生大量窦状卵泡。1从这些卵泡中采集的卵母细胞可进行成熟、受精并发育 体外 直至它们被冷冻保存或移植到代孕母体中3然而，在这些治疗过程中，配子和受精卵会暴露于一系列非生理性的处理步骤，这可能需要胚胎进行适应以在这些条件下存活4,5这种适应性成为可能源于早期胚胎的可塑性，该特性允许胚胎在基因表达和发育编程方面发生改变6然而，这些修饰可能会影响胚胎发育的后续阶段直至成年期，目前普遍认为，操作方法、处理时机、冷冻保存程序或培养条件均会对胚胎的命运产生不同的影响7,8因此，为了阐明辅助生殖技术（ARTs）所引起的具体效应，使用特征明确的动物模型是必不可少的。

首例记录在案的哺乳动物胚胎移植后活产发生于1890年9。如今，将胚胎移植（ET）至代孕雌性个体是研究辅助生殖技术（ART）在胚胎着床前阶段对后续胚胎发育影响的关键步骤10。胚胎移植技术取决于每种动物的体型大小和解剖结构。对于体型较大的动物模型，已可采用经宫颈非手术胚胎移植技术进行操作；而对于体型较小的物种，宫颈插管更为复杂，常需采用手术方法11。然而，手术性胚胎移植可能引起出血，血液可侵入子宫腔，导致胚胎死亡，从而影响胚胎着床和发育10。目前，经宫颈非手术胚胎移植技术仍应用于人类、狒狒、牛、猪和小鼠12,13,14,15,16,17，而手术性胚胎移植仍在山羊、绵羊或其他存在额外操作困难的动物中使用10,18,19,20,21，例如兔子（具有两个独立的宫颈）或小鼠（体型微小）。尽管如此，手术性移植方法正逐渐被侵入性更小的技术所取代。例如，在兔子、猪和小型反刍动物中已采用内窥镜技术进行胚胎移植18,19,20。这些微创内窥镜方法可通过漏斗部将胚胎移植至壶腹部，在兔子中尤为关键，并在某些物种中显示出有益效果20。该方法基于胚胎在输卵管内早期发育阶段与母体之间正确对话的重要性。如上所述，兔子胚胎在输卵管迁移过程中发生的胚胎重塑对于获得具备着床能力的胚胎至关重要22,23。

大型动物模型（如牛）具有研究价值，因为其生化特征和着床前特征与人类相似24。然而，大型动物在初步试验中成本过高，因此啮齿类动物被认为是实验室研究的理想模型（76%的模式生物为啮齿类）25。尽管如此，在生殖研究中，兔模型相较于啮齿类具有一些优势，因为人类某些生殖生物学过程在兔子中的表现比在小鼠中更为相似。人类与兔子在胚胎基因组激活的时间顺序、原肠胚形成以及血绒毛膜胎盘结构方面均具有相似性。此外，由于兔子为诱导排卵，可准确确定受精和妊娠各阶段的时间点25。兔子生命周期较短，妊娠期为31天，约4-5个月即达到性成熟；其性情温顺、无攻击性，易于操作，且饲养成本远低于大型动物。此外，必须指出的是，兔子具有双子宫结构，拥有两个独立的子宫颈11,25。这一特点使兔子处于有利地位，可将不同实验组的胚胎移植至同一只动物的不同子宫角内，从而在同一母体中比较不同实验处理的效果，有效减少母体因素对实验结果的干扰。

目前，非手术胚胎移植（ET）技术尚未在兔中应用。20世纪90年代末期进行的一些研究采用经宫颈胚胎移植技术，其分娩率仅为5.5%至20.0%11,26，而手术方法的分娩率可达50%–65%，其中包括Besenfelder和Brem18所描述的腹腔镜手术。这些非手术ET方法在兔中成功率较低，与输卵管中缺乏必要的胚胎重塑过程有关，而经宫颈ET则避开了这一过程。本文介绍了一种以兔为模式生物的有效且微创的腹腔镜ET操作方法。该技术为大型动物及人类的进一步生殖研究提供了模型。

由于兔子的胚胎着床时间窗口特别狭窄，该物种的胚胎移植（ET）需要在移植时胚胎的发育阶段与受体的生理状态之间实现高度同步27在某些情况下，经过减缓胚胎发育的生殖处理（例如 体外 培养）或改变子宫内膜容受性（如超数排卵治疗）的情况下，胚胎与母体子宫之间无法同步。这些情况可能对结果产生负面影响。为应对上述问题，我们描述了一种有效的兔桑葚胚玻璃化冷冻保存方案，该方案使我们能够暂停、规划并继续实验。这一过程在生殖研究中具有理想的可操作性，并使胚胎的长期保存和运输成为可能。腹腔镜手术与冷冻保存策略相结合，有助于更合理地规划实验，减少动物使用数量。因此，本方法在卫生和经济方面均具有优势，并符合动物实验“3R原则”（替代、减少和优化），旨在改善实验动物的人道待遇。因此，利用这些方法，兔成为一种理想的模式生物 体内 生殖实验。

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方案

本研究中使用的所有实验程序均按照欧盟动物实验指令 2010/63/EU 的规定进行，并经西班牙瓦伦西亚理工大学动物实验伦理委员会审查和批准（研究编号：2015/VSC/PEA/00170）。XGD、FMJ、MPVC 和 JSV 持有由瓦伦西亚自治区政府行政部门颁发的动物实验许可证书。XGD 被授权在实验期间对动物的福利和护理进行现场监督。

1. 胚胎移植

  1. 受体雌性动物的准备
    1. 仅使用性成熟的雌性个体（> 4.5 个月大。
    2. 移植前一周，将雌性动物适应于16小时光照/8小时黑暗的光照周期，以启动卵泡生长并增强雌性接受性。
    3. 选择受体雌性，观察阴门的肿胀程度和颜色。若阴门肿胀且呈红润状，则该雌性处于可接受交配状态。
    4. 通过单次肌肉注射诱导假孕（排卵） 1 µg 无论体重如何，均使用醋酸布舍瑞林（促性腺激素释放激素的合成类似物）。
      注意：通常情况下， 0.8 µg 适用于中等体型兔子（4-5 kg）的促排卵诱导剂量，因此 1 µg 通常可确保排卵。
    5. 根据拟移植胚胎的年龄，提前相应天数诱导排卵（例如，新鲜桑葚胚移植前70-72小时）。
  2. 麻醉与镇痛
    1. 称重兔子，并准备以下麻醉剂和镇痛剂。
      1. 在1 mL注射器中装入赛拉嗪（5 mg/kg）和盐酸丁丙诺啡（0.03 mg/kg），配30G针头。在另一支1 mL注射器中装入盐酸氯胺酮（35 mg/kg），配23G颅周针头。
    2. 固定兔子，并将赛拉嗪-丁丙诺啡混合物进行肌肉注射。
    3. 通过耳缘静脉插入含氯胺酮的颅周针，缓慢将注射器内全部药液经静脉注入。
    4. 固定针头，并在整个后续步骤中保持其插入，以便必要时追加麻醉。
    5. 将兔子留在笼中（笼子需清洁且无其他动物），置于温暖的平台上。
    6. 失去意识后，涂抹眼药膏以防止眼睛干涩，并检查睑反射是否消失。
      注意：本方案提供的手术麻醉平面至少可持续 30 分钟。若需延长麻醉时间，可在 30 分钟后追加剂量，追加量为 1.2.1 中所述盐酸氯胺酮剂量的一半。
    7. 通过检查足底反射和呼吸运动来监测麻醉深度。呼吸模式变为不规则且加快，表明已失去适当的麻醉平面。
    8. 监测黏膜（眼睛、嘴唇）的颜色， 等等。）、呼吸频率（30-60 次/分钟）、心率（120-325 次/分钟）和直肠温度（38-39.6 °C).
    9. 移植前8小时，停止给动物喂食，以避免肠道体积增大和活动增强，直至胚胎移植（ET）过程结束。可自由饮水。
  3. 胚胎制备
    1. 将胚胎操作培养基预热至 25 °C基础培养基（BM），由添加了0.2%（w/v）牛血清白蛋白的杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）组成。
    2. 在体视显微镜下操作，用BM缓冲液冲洗新鲜或已解冻（步骤2）的胚胎。
    3. 使用无菌手套，将一根适当配置的17G硬膜外导管连接至1 mL注射器。
    4. 吸取1 cm的骨髓液进入导管，随后吸入一小段空气。
    5. 吸取5-7个胚胎，体积为 10 µL 骨髓，随后是另一个小气泡。
    6. 通过抽吸1 cm骨髓完成导管的装载。
  4. 胚胎移植
    1. 考虑使用无菌手套、防护服和口罩，以确保无菌环境。
    2. 对手术器械进行灭菌，清洁手术操作表面，并用70%乙醇擦拭。
    3. 按照先前所述方法（步骤1.2）实施麻醉，并检查反射是否消失。
    4. 用电剃刀剃除腹部腹侧的毛发。
    5. 无菌条件下准备腹部腹侧区域。
      1. 清洁手术区域并去除残留毛发。使用葡萄糖酸氯己定皂液清洗手术区域。用氯己定溶液和96º乙醇消毒该区域（共3次）。
    6. 将动物置于温暖的手术台上，呈头低脚高的特伦德伦堡位（Trendelenburg's position） 45°以确保胃和肠位于头侧。若膀胱充盈，应考虑将其排空。若在操作过程中任何内脏受损，动物可能会死亡。因此，确保内脏正确就位非常重要（图1).
    7. 用一块带孔（开窗）的无菌毛巾覆盖该区域，使剃毛区域暴露，以隔离手术部位与可能的污染区域。
    8. 将一个内镜套管针插入腹腔，位置位于剑突下方2 cm处，插入深度为5 cm，并通过该套管针使用压力调节型机械气腹机向腹膜腔内充气。
      注意：腹腔内压力应维持在 8–12 mmHg，使用 CO₂2 (图1A).
    9. 将内窥镜摄像头插入内窥镜套管针中（图1B).
      注意：在胚胎移植前，识别生殖道，确定壶腹部和扩大部分的状态与位置，以利于后续操作。
    10. 将17-G硬膜外针插入漏斗部下方2-3 cm处的腹股沟区域（图1B).
    11. 确定漏斗部的入口（图 2A，2B).
    12. 将已装载的导管（步骤1.3）经硬膜外穿刺针插入腹部（图1C).
    13. 找到输卵管，将硬膜外导管插入漏斗部至壶腹部，插入深度为1-2 cm（图2A-2C不要深入输卵管，以免造成损伤和出血。
    14. 通过轻轻按压连接到导管的注射器活塞，将胚胎释放到输卵管中（图 2D-2F两个空气泡都必须排出导管。
    15. 在胚胎释放后立即移除导管。
    16. 冲洗导管，通过抽吸和释放操作液来检查胚胎是否残留，并确认胚胎已成功移植。
    17. 必要时，在子宫的另一侧重复步骤 1.4.11 至 1.4.16。
    18. 移除硬膜外针和内窥镜摄像头。
    19. 释放 CO2 通过内窥镜套管排出。如果动物腹腔内残留过多气体，将引起疼痛和不适。
    20. 取出腹腔内的内镜穿刺器。移除手术巾。
    21. 停止麻醉。
    22. 用氯己定溶液清洁套管针造成的切口。使用微粉化铝和塑料敷料闭合套管针造成的切口。 
  5. 术后护理
    1. 用抗生素处理动物：每24小时皮下注射一次恩诺沙星，剂量为10 mg/kg，连续5天。
    2. 给予镇痛剂：盐酸丁丙诺啡（0.03 mg/kg），肌内注射，每12小时一次，持续3天；美洛昔康（0.2 mg/kg），皮下注射，每24小时一次，持续3天。
    3. 手术后至少监测动物30分钟（根据动物种类和所使用的麻醉剂量而定），确保其生理状态恢复正常。
    4. 确定受体（例如， 耳标标记，并将动物单独饲养于清洁笼具中，保持适宜的环境条件。

兔的外科内窥镜手术；麻醉、插入和样本注射序列。
图 1：腹腔镜辅助下的胚胎移植（外部视图）。 A) 内窥镜套管针（单通道）的插入。 B) 内窥镜摄像头和硬膜外穿刺针的插入（黑箭头）。 C) 通过硬膜外穿刺针插入胚胎移植导管（白箭头）。 请点击此处查看该图的放大版本。

腹腔镜成像系列，显示生殖研究中的卵巢导管和输卵管。
图 2：腹腔镜辅助胚胎移植（内部视图）。 A： 将导管通过硬膜外穿刺针插入腹腔区域。星号表示漏斗部。 B、C、D： 装载胚胎的导管穿过漏斗部插入壶腹部。 E、F： 胚胎释放，通过观察到输卵管肿胀得以确认。本图改编自 Marco-Jiménez 等38。 请点击此处查看此图的高清版本。

2. 胚胎玻璃化冷冻与复温

  1. 在室温下（约 22 °C以降低在较高温度下玻璃化冷冻溶液的毒性。
    注意：可使用 0.1-2 µL 本方案中使用自动移液器，但其他可带动最小体积液体并转移胚胎的类似装置也可适用。
  2. 采用两步添加法对胚胎进行玻璃化冷冻：
    1. 将胚胎置于平衡液中放置2分钟，平衡液成分为10%（v/v）乙二醇和10%（v/v）二甲基亚砜溶解于BM中。
    2. 将步骤2.2.1中的胚胎移入玻璃化冷冻液中，处理1分钟，该冷冻液由20%（v/v）乙二醇和20%（v/v）二甲基亚砜溶于BM中组成。
  3. 将胚胎装入一个 125 µL 塑料微型吸管（一端封闭并带有棉塞，另一端开口）。该过程的示意图如图所示。 图3.
    1. 将封闭端连接 0.125 μL 使用合适的微量移液器（如 Captroll III®）进行微量移液。 
    2. 吸出骨髓液至吸管长度的1/3处，随后吸入一小段空气。
    3. 吸出胚胎及其周围液体 40 µL 玻璃化溶液，随后是另一个小气泡。
    4. 吸出骨髓液，直至第一份液体部分（步骤 2.3.2）到达棉塞处。
    5. 用吸管塞封闭开口端。
  4. 在执行步骤2.3的同时进行步骤2.2.2，以确保间隔时间不超过一分钟，避免对胚胎产生毒性。
  5. 将细管直接浸入液氮中以实现玻璃化冷冻。
  6. 将细管置于液氮杜瓦瓶中，保存所需时间。
  7. 一步法解冻胚胎。
    1. 将细管平放于液氮蒸气上方10 cm处，持续20-30秒。
    2. 当 ministraw 内开始结晶时，将 ministraw 浸入水浴中，水浴温度为 25 °C 10–15 秒。
    3. 移除细管塞并剪断棉塞。
    4. 使用耦合的微量分液器，将细管中的全部内容物排入含有 0.33 M 蔗糖溶液的培养板中 25 °C 在BM中孵育5分钟。
      注意：此步骤必须快速完成，以减少胚胎对玻璃化冷冻液的暴露。 
    5. 将胚胎转移至含有BM溶液的新培养皿中，继续孵育5分钟。
    6. 仅选择无损伤的胚胎（具有完整黏液层和透明带）进行后续胚胎移植（ET）。
      注意：需考虑到在解冻胚胎中，非同步移植（例如， 60-62小时（桑葚胚移植）可能通过促进胚胎与母体子宫内膜之间的再同步化而改善结果。

胚胎样本标识设置示意图；细管操作的示意图及气隙和封堵的特写。
图3：正确装载细管的示意图。 A) BM 指玻璃化冷冻过程中使用的胚胎操作培养基。胚胎必须在玻璃化冷冻液中装载。B) 装载后细管的宏观外观及其胚胎位置的放大细节。这种大容量装置使我们能够对大量胚胎进行玻璃化冷冻，而不同于最小体积装置。此外，与最小体积装置相比，该装置的操作更为简便，而在家兔中的冷冻效果相似41。请点击此处查看此图的放大版本。

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结果

通过微创腹腔镜技术移植新鲜或玻璃化冷冻的胚胎，使兔成为生殖研究中最理想的模式动物之一。表1展示了在不同发育阶段（图4）移植胚胎后新鲜胚胎移植的结果。出生时的存活率（发育为仔兔的胚胎百分比）证明了本文所述腹腔镜技术的有效性。当移植处于桑葚胚阶段（包括早期或致密化桑葚胚）的胚胎时，获得的存活率更高。基于这些结果，我们进行了第二项实验，以验证这些胚胎经玻璃化冷冻后的存活率。因此，表2展示了同时期回收的玻璃化冷冻兔桑葚胚移植后的结果，并根据胚胎是否达到良好致密化程度进行区分。不同胚胎阶段的出生存活率存在差异，其中致密化桑葚胚的存活率更高。因此，腹腔镜胚胎移植是一种在兔中可靠地移植新鲜和玻璃化冷冻胚胎的技术

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讨论

自首例通过移植胚胎实现活产的病例被记录以来9，该技术及兔种已在生殖研究中变得至关重要。此外，涉及操作、生产、冷冻保存的胚胎研究 等等。 最后一步需要评估胚胎产生健康足月后代的能力，因此胚胎移植技术不可或缺。13,28多年来，最初用于将胚胎移植到母体子宫的外科手术方法，已在绝大多数物种中逐渐被侵入性更小的方法所取代。13,14,15,21,27,29,30然而，在兔子中，早期胚胎发育阶段的输卵管内胚...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究得到了西班牙经济与竞争力部（AGL2017-85162-C2-1-R）以及巴伦西亚自治区政府研究计划（PrometeoII 2014/036）的资金支持。英文文本由 N. Macowan 英语语言服务修订。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
牛血清白蛋白（BSA）VWR332
盐酸丁丙诺啡Alvet Escartí626须由持证兽医开具处方。
醋酸布舍瑞林Sigma AldrichB3303
氯己定葡萄糖酸盐皂Alvet Escartí0265DCCJ500B
氯己定葡萄糖酸盐溶液Alvet Escartí0265DCCA500B
CO2液化空气集团99921CO2 N48
CO2 培养箱Fisher Scientific15385194
二甲基亚砜Sigma AldrichW387509
杜尔贝科’磷酸盐缓冲液（DPBS）Sigma AldrichD5773不含氯化钙
电动剃须刀Oster Golden A5078005-140-002
内窥镜摄像头Optomic Spain S.AOP-714
带硅胶瓣膜阀的内镜穿刺器卡尔·史托斯内窥镜伊比利亚公司érica S.A.30114GK轻量型套管穿刺器模型
恩诺沙星Alvet Escartí9993046须由持证兽医开具处方。
23G 皮颅针Alvet Escartí514056353也可以使用更小的针头。
硬膜外导管Vygon 公司187.10
硬膜外穿刺针Vygon 公司187.10
乙二醇Sigma Aldrich102466-M
眼膏Alvet Escartí5273
盐酸氯胺酮Alvet Escartí184须由持证兽医开具处方。
腹腔镜设备卡尔·史托斯内窥镜伊比利亚公司érica S.A.26003 AAHopkins® 腹腔镜，0º-mm 直视腹腔镜，30 cm 长，5 mm 工作通道。
光源Optomic Spain S.AFibrolux 250
液氮液化空气集团P1505XXX
机械式CO2气腹机卡尔·史托斯内窥镜伊比利亚公司érica S.A.Endoflator®
美洛昔康Alvet Escartí9993501须由持证兽医开具处方。
35毫米培养皿Sigma AldrichCLS430165-500EA
塑料敷料（Nobecutan）IBOR medica7140028
0.25 mL 塑料吸管IMV - 技术6431
聚维酮碘溶液Alvet Escartí02656DPYS500S
剪刀ROBOZRS-5880任何常规外科级不锈钢小直剪均可使用。
气腹机用硅胶管卡尔·史托斯内窥镜伊比利亚公司érica S.A.20400040
体视显微镜LeicaMZ16F较便宜的选择包括Leica MZ8或Nikon SMZ-10、SMZ-2B等。
无菌手套Alvet Escartí087GL010075
无菌手术衣Alvet Escartí12261501
无菌口罩Alvet Escartí058B15924B
稻草塞IMV - 技术6431
蔗糖Sigma AldrichS7903
1 mL注射器Fisher Scientific11750425
5 mL注射器Fisher Scientific11773313
导尿管IMV - 技术17722
水浴锅RAYPABAE-4
赛拉嗪Alvet Escartí525225须由持证兽医开具处方。
兔子理工大学è瓦尔技术ènciaA线其他母系，如V系或HP系，也可使用。

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