家兔模型最佳胚胎阶段微创胚胎移植与胚胎玻璃化

为了绕过人类不育或改善高遗传价值牲畜的传播和保护动物遗传资源, 一套统称为辅助生殖技术的技术, 如超排卵, 在体外受精, 胚胎培养, 或冷冻保存, 发展 1, 2。目前, 激素治疗是为了刺激卵巢, 并产生大量的卵泡 1.从这些卵泡中收集的卵母细胞可以成熟、受精和体外发育, 直到它们被冷冻保存或转移到代孕母亲³。然而, 在这些治疗过程中, 配子和合子暴露在一系列非生理过程中, 这些过程可能需要胚胎适应才能在这些条件下存活 4^,5。这种适应是可能的由于早期胚胎可塑性, 允许胚胎在基因表达和发育编程6的变化。然而, 这些修饰会影响到成年前胚胎发育的各个阶段, 现在人们普遍认为, 方法、时间、冷冻保存程序或培养条件对胚胎命运^的影响是不同的。^,8. 因此, 为了阐明抗逆转录病毒疗法的具体诱发影响, 使用特征良好的动物模型是不可避免的。

1890年发生了第一次由哺乳动物胚胎移植而产生的活产.如今, 胚胎移植 (ET) 对代孕女性的影响是研究胚胎植入前对随后胚胎发育阶段10的抗逆转录病毒效应的关键一步。ET 技术取决于每种动物的大小和解剖结构。在大型动物模型的情况下, 它是可能的执行 et 通过经宫颈非手术 ET 技术, 但在较小的物种导尿子宫颈是比较复杂的, 手术技术是经常使用 11.然而, 手术 ET 可导致出血, 可能会损害植入和胚胎发育, 因为血液会侵入子宫腔, 导致胚胎死亡¹⁰。经宫颈非手术 et 技术仍适用于人类、、牛、猪和小鼠^{12、13、14、15、16、17, 但}手术E t 仍被用于山羊、绵羊或其他动物等物种, 这些动物会带来额外的困难^,如兔子^(两种)或小鼠 (小尺寸)。尽管如此, 手术转移方法往往已逐渐被侵入性较小的方法所取代。内窥镜检查被用来转移胚胎, 例如, 在兔子, 猪和小反刍动物^18,19,²⁰。这些微创内窥镜方法可用于通过漏斗将胚胎移植到壶腹, 这在兔子中是必不可少的, 并已在某些物种²⁰中显示出有益的效果。这是基于胚胎和母亲在输卵管早期胚胎阶段正确对话的重要性。如上所述, 在胚胎通过输卵管的胚胎迁移过程中, 兔子的胚胎重塑对于实现能够植入^{22,23 的}胚胎至关重要。

大尺寸的动物模型, 如牛, 很有趣, 因为生化和植入前的特征与人类 2^{4 种}相似。然而, 大型动物过于昂贵, 无法在初步试验中使用, 啮齿类动物被认为是实验室研究的理想模型 (76% 的模型生物是啮齿类动物)。然而, 兔子模型在生殖研究中比啮齿类动物有一些优势, 因为人类所表现出的一些生殖生物过程在兔子中比在小鼠身上更相似。人类和兔子呈现类似的胚胎基因组激活、胃和血液胎盘结构。此外, 使用兔子可以知道受精的确切时间和怀孕阶段, 因为他们诱发排卵²⁵。兔子的生命周期很短, 31天内完成妊娠, 约4-5 进入青春期;这种动物由于其温顺和非攻击性的行为, 容易处理, 与大型动物的费用相比, 它的保养非常经济。此外, 重要的是要提到, 兔子有一个双子宫, 有两个独立的子宫颈11^,25。这使得兔子处于优先的位置, 因为来自不同实验组的胚胎可以转移到同一动物体内, 但进入不同的子宫角。这使我们能够比较这两种实验效果, 减少母亲因素的结果。

如今, 非手术 ET 方法在兔中没有使用。在90年代末使用经颈椎 et 技术进行的一些研究导致低分娩率从5.5% 到 20.0 11^,26和50-65 的手术方法, 其中包括腹腔镜手术描述Besenfelder 和 Brem¹⁸。这些非手术性 ET 方法在兔体内的成功率较低, 与输卵管缺乏必要的胚胎重塑而同时发生, 而输卵管输卵管内缺乏必要的胚胎重塑, 而输卵管内的胚胎重塑是避免的。在这里, 我们描述了一个有效的微创腹腔镜 ET 程序使用兔子作为模型生物。这项技术为大型动物和人类的生殖研究提供了一个模型。

由于家兔胚胎植入的时间窗口特别狭窄, 该物种的 et 要求在 ET 胚胎发育阶段和接受者²⁷的生理状态之间有高度的同步性。在某些情况下, 在生殖治疗减缓胚胎发育 (如体外培养) 或改变子宫内膜接受度 (如超排卵治疗) 后, 胚胎和母亲子宫之间没有同步。这些情况会对结果产生负面影响。为了在这些情况下的反应, 我们描述了一个有效的兔子脑膜玻璃化协议, 使我们能够暂停, 组织和恢复实验。这一过程在后勤方面是生殖研究所需要的, 并使我们有能力长期储存胚胎, 使其能够运输。腹腔镜手术和冷冻保存策略可以更好地规划少动物的研究。因此, 我们的方法提供了卫生和经济优势, 并符合 3Rs (替换, 减少和细化) 的动物研究的概念, 明确的目标是改善人类对实验动物的治疗。因此, 有了这些方法, 兔子就成了体内生殖检测的理想模型生物。

本研究中使用的所有实验程序都是根据关于动物实验的欧盟 eec 指令进行的, 并得到了 València Politècnica 大学动物实验伦理委员会的审查和批准。西班牙 (研究代码: 2015VSC/PEA/00号)。XGD、FMJ、MPVC 和 JSV 持有瓦伦西亚政府颁发的动物实验授权证书。XGD 被授权在实验期间对动物的福利和护理进行现场监督。

1. 胚胎移植

1. 接受者女性的准备
   1. 仅使用性成熟的女性 (> 4.5个月大)。
   2. 在 ET 前一周, 使女性适应16小时的黑暗状态, 以启动卵泡生长和增强女性的接受度。
   3. 选择接受的女性, 观察外阴的浑浊和颜色。如果外阴是浑浊和红色的, 雌性是容易接受的。
   4. 通过肌肉注射1微克醋酸 buserelin (促性腺激素释放激素的合成类似物), 无论体重大小, 都能诱导假性假性 (排卵)。
      注: 通常情况下, 0.8 微克是中等大小家兔 (4-5 千克) 诱导排卵的合适剂量, 因此1微克通常保证排卵。
   5. 在被转移的胚胎的年龄之前的许多天进行排卵 (例如, 在新鲜的 morula et 之前的 70-72小时)。
2. 麻醉和镇痛
   1. 称量兔子并加载以下麻醉剂和镇痛药。
      1. 在带有30G 针的1毫升注射器中: 装载 xylazine (5mg/kg) 和盐酸丁丙诺非 (0.03 mg/kg)。在另一个带有23G 周耳针的1毫升注射器中, 装载盐酸氯胺酮 (35 mg/2 kg)。
   2. 抓住兔子, 肌肉注射木糖-丁丙诺非混合物。
   3. 将含有氯胺酮的颅周针插入耳边缘静脉, 慢慢静脉注射所有注射器内装物。
   4. 修复针头, 并在剩余的步骤中将其插入, 以便在必要时进行更多麻醉。
   5. 把兔子留在笼子里 (干净, 没有任何其他动物) 在一个温暖的舞台上。
   6. 一旦不省人事, 应用眼药膏, 以避免眼睛干燥, 并检查是否没有眼睑自由。
      注: 此方案提供了至少30分钟的手术麻醉平面。如果需要更长的时间, 在30分钟后注入额外剂量, 其中一半的氯胺酮在1.2.1 中描述。
   7. 通过检查踏板反射和呼吸运动来监测麻醉深度。呼吸模式的变化, 以不规则和更快的速度表明失去了适当的麻醉平面。
   8. 监测粘膜 (眼睛、嘴唇等) 的颜色、呼吸率 (每分钟30-60 次呼吸)、心率 (每分钟12-325次跳动) 和直肠温度 (38-39.6°c)。
   9. 在转移前 8小时, 向动物保留食物, 以避免更大的肠胃大小和活动, 直到 e t 过程完成。让客人免费使用水。
3. 胚胎准备
   1. 将胚胎操作介质加热到 25°c: 培养基 (BM), 由 Dulbecco 的磷酸盐缓冲盐水 (DPBS) 组成, 并辅以 0.2% (w/v) 的牛血清白蛋白。
   2. 在立体显微镜下工作, 用 BM 冲洗新鲜或解冻 (步骤 2) 胚胎。
   3. 使用无菌手套, 将适当配置的17G 硬膜外导管连接到1毫升注射器上。
   4. 将1厘米的 BM 浸入导管, 然后是一个小气泡。
   5. 在 BM 的体积为10μl 的情况下吸收5-7 个胚胎, 然后是另一个小气泡。
   6. 通过吸气1厘米的 BM 完成导管的加载。
4. 胚胎移植
   1. 考虑使用无菌手套、长袍和面膜, 以确保无菌环境。
   2. 消毒手术器械, 清洁将进行手术的表面, 并用70% 的乙醇擦拭。
   3. 按照以前的详细步骤 (步骤 1.2) 执行麻醉, 检查反射丢失。
   4. 用电动剃须刀刮掉腹侧腹部的皮毛。
   5. 无菌地准备腹侧腹部。
      1. 清洁手术区域, 并删除任何剩余的头发。用葡萄糖酸氯己定肥皂清洗手术区域。用氯己定溶液和乙醇对该区域进行96度 (3次) 消毒。
   6. 将动物放在温暖的手术桌上, 位于特伦德伦堡的位置 (在45°向下向下), 以确保胃和肠道位于颅内。如果是浑浊的膀胱, 可以考虑膀胱的排空。如果在这个过程中任何内脏受损, 动物可能会死亡。因此, 正确定位它们非常重要 (图 1)。
   7. 使用无菌毛巾覆盖该区域, 并使用一个孔 (开窗) 暴露剃须区域, 以便将手术部位与任何潜在的污染区域分开。
   8. 将一个内窥镜5厘米的小车插入腹腔, 将2厘米尾端插入灵素过程, 并通过它插入腹腔, 并带有压力调节机械插入器。
      注: 腹内压力应为8-12 毫米汞柱与二氧化碳₍ 图 1a)。
   9. 通过内窥镜小车插入内窥镜相机 (图 1 b)。
      注: 确定生殖道, 确定内皮和壶腹的状态和位置之前的 et, 以方便下一步。
   10. 将17-G 硬膜外针头插入腹股沟区域, 距离漏斗膜2-3 厘米 (图 1 b)。
   11. 识别漏斗的入口 (图 2 a, 2A)。
   12. 通过硬膜外针将加载的导管 (步骤 1.3) 插入腹部 (图 1c)。
   13. 找到输卵管, 并通过壶腹的漏斗插入1-2 厘米的硬膜外导管 (图 2A-2A)。不要进入输卵管很远, 以防止损伤和出血。
   14. 通过轻轻按压注射器与导管耦合的柱塞, 将胚胎释放到输卵管中 (图 2d-2f)。两个气泡都必须退出导管。
   15. 就在胚胎被释放后, 取出导管。
   16. 冲洗导管, 吸气和释放操作介质, 以检查胚胎的缺失, 并确认其成功转移。
   17. 如果需要, 重复步骤1.4.11 在子宫的另一侧1.4.16。
   18. 取出硬膜外针头和内窥镜摄像头。
   19. 通过内镜车释放二氧化碳_. 如果动物腹部仍有多余的气体, 就会有疼痛和不适。
   20. 从腹腔取下内窥镜上的小车。取下手术毛巾。
   21. 停止麻醉。
   22. 用氯己定溶液清洗小车制作的切口。用微型铝和塑料敷料关闭小车做的切口。
5. 术后护理
   1. 用抗生素治疗动物:10 mg* 公斤 enroxacin, 皮下注射, 每 24小时5天。
   2. 管理镇痛药: 盐酸丁丙诺非 (0.03 mg/kg), 肌肉注射, 每次 12小时, 3天;美洛昔康 (0.2 mg/kg), 皮下, 每24小时一次, 3天。
   3. 术后对动物进行至少30分钟的监测 (取决于动物和使用的麻醉剂量), 确保它们恢复生理状况。
   4. 识别受者 (例如,耳纹身) 和将动物单独安置在一个干净的笼子里, 并具有适当的环境条件。

图 1: 腹腔镜辅助腹腔镜胚胎移植 (外部视图).A)插入内窥镜小车 (一个端口)。B)插入内窥镜摄像机和硬膜外针头 (黑色箭头)。C)通过硬膜外针插入胚胎移植导管 (白色箭头)。请点击这里查看此图的较大版本.

图 2: 腹腔镜辅助腹腔镜胚胎移植 (内图).答:导管通过硬膜外针头插入腹部区域。星号表示漏斗。B、C、D:充满胚胎的导管入壶腹区域 , 穿过漏斗。英、法:胚胎的释放, 通过一个肿胀的输卵管的可视化确认。这一数字已改编自 Marco-Jiménez等人.³⁸.请点击此处查看这一数字的较大版本.

2. 胚胎玻璃化和温暖

1. 在室温 (约 22°C) 下进行所有操作, 以降低在温度较高的情况下的玻璃化溶液毒性。
   注: 在此协议中, 胚胎可以使用0.1-2 微米自动移液器进行移动, 但其他类似的移动胚胎拖动最小体积的设备可能是合适的。
2. 在两步加法程序中对胚胎进行玻璃化治疗:
   1. 将胚胎置于平衡溶液中 2分钟, 溶液中含有 10% (v/v) 乙二醇和溶解在 BM 中的 10% (v/v) 二甲基亚硫氧化物。
   2. 将胚胎 (从步骤 2.2.1) 移动 1分钟, 形成玻璃化溶液, 其中包括溶解在 BM 中的20% 乙二醇和 20% (v/v) 二甲基磺酰亚硫醚。
3. 将胚胎加载到一个125Μl 塑料区 (其中包含一个闭端, 带有棉塞和一个开放的极端)。该过程在图 3中进行了架构化。
   1. 将0.125μl 的闭合端与相应的微分配器 (例如 Captroll III®) 耦合。
   2. 吸气 BM, 直到秸秆长度的--, 随后是一个小气泡。
   3. 将胚胎吸收在40Μl 的玻璃化溶液中, 然后是另一个小气泡。
   4. 吸进 BM, 直到第一个液体分数 (步骤 2.3.2) 到达棉花。
   5. 用秸秆塞关闭开口端。
4. 在执行步骤2.3 时执行步骤 2.2.2, 以确保经过的时间不超过一分钟, 这将对胚胎有毒。
5. 将母量直接注入液氮, 实现玻璃化。
6. 在所需的时间内, 将该部门存放在氮气的战争中。
7. 只需一步就能解冻胚胎。
   1. 将从液氮蒸汽水平放置10厘米, 时间为20-30。
   2. 当结晶过程开始在委场内, 将该过程浸入25°c 的水浴中10-15。
   3. 取下电源插头, 切下棉塞。
   4. 使用耦合微分配器, 在 BM 25°c 时将所有的蔗糖含量排出一个含有 0.33 M 蔗糖溶液的板材, 时间为5分钟。
      注: 必须快速完成此步骤, 以减少胚胎接触玻璃化溶液。
   5. 将胚胎移动到包含 BM 溶液的新盘子中, 再延长5分钟。
   6. 考虑只有非受损的胚胎 (与完整的粘液涂层和透明带) 继续与 ET。
      注: 考虑到在解冻的胚胎中, 异步转移 (例如, 在 morula 移植中, 60-62小时) 可能会通过允许胚胎和母亲子宫内膜之间的重新同步来改善结果。

图 3: 正确加载秸秆的规划.A) bm 是指在玻璃化过程中使用的胚胎操作介质。胚胎必须装入玻璃化溶液中。B)加载秸秆的宏观外观与放大的细节的胚胎位置。这种大容量的装置使我们能够对大量的胚胎进行玻璃化, 这与最小体积的装置不同。此外, 与最小体积设备相比, 该装置的处理更容易, 而兔子^{4 1只}的结果相似。请点击这里查看此图的较大版本.

微创腹腔镜移植新鲜或玻璃胚胎使兔子成为生殖研究的最佳模型动物之一。表 1显示了在不同发育阶段 (图 4) 转移的胚胎的新鲜 et 的结果。出生时的存活率 (胚胎产生小狗的百分比) 证明了本文所描述的腹腔镜技术的有效性。当在早期或紧凑型莫鲁拉阶段用胚胎进行 e t 时, 获得了较高的值。基于这些结果, 我们进行了第二次实验, 以证明这些胚胎玻璃化后的存活率。因此, 在表 2中, 我们显示了在移植玻璃化兔后获得的结果, 同时, 区分那些已经达到良好的压实程度或未达到的胚胎。不同胚胎阶段的出生成活率不同, 压实膜中的成活率较高。因此, 腹腔镜胚胎移植是兔移植新鲜玻璃胚胎的可靠技术

图 4: 兔子胚胎.A) pr核。B) 8个细胞。C)早期的莫鲁拉。D)紧凑型 morula。E)囊胚。星号表示两个原核。黑箭表示透明带。白色箭头表示粘液涂层, 通常在胚胎之间变化。内细胞质量. te: 滋养。刻度栏: 50μm. 请点击这里查看这个数字的更大版本.

表1。腹腔镜下新鲜兔胚胎移植 (体内衍生) 的效率。 1在 18-20 h (前核)、35-38小时 (8个细胞)、60-62小时 (早期莫鲁拉)、70-72小时 (紧凑型莫鲁拉) 和 80-82 h (囊胚) 交配后恢复。紧凑型 (和 gt;32 细胞) 和非紧凑型 (3 2个细胞) 可以在 7 0-7 2 小时建立, 但只转移了紧凑型。2从接受者怀孕的出生时生存率确实如此。a, b具有不同上标的值在统计上是不同的 (P<0.001)。

表2。非压实与致密玻璃化的可行性。 a、b具有不同上标的值在统计上是不同的 (P<0.001)。1从接受者怀孕的出生时生存率确实如此。同时恢复了胚胎 (70-72 小时), 并分为紧凑型 (和 gt;32 细胞) 和非紧凑型细胞 (32 细胞)。

作者没有什么可透露的。