兔模型中最佳胚胎阶段的微创胚胎移植与胚胎玻璃化冷冻

摘要

辅助生殖技术（ARTs）正处于持续评估中，以提高治疗效果并降低相关风险。本文描述了一种微创胚胎移植方法，并结合高效的冷冻保存方案，使得兔子可作为人类生殖研究的理想动物模型。

摘要

辅助生殖技术（ARTs），例如 体外 胚胎培养或胚胎冷冻保存等操作可能影响自然发育模式，并带来围产期和出生后的后果。为确保辅助生殖技术（ART）应用的安全性，有必要开展动物模型研究。此外，作为最后一步，胚胎发育研究还需评估其发育为足月健康子代的能力。在此过程中，将胚胎移植至子宫是开展任何与辅助生殖技术相关实验所不可或缺的环节。

一个多世纪以来，兔被用作研究哺乳动物生殖的模式生物。除了在系统发育上与人类接近、体型小且维护成本低之外，兔还具有重要的生殖特征，例如诱导排卵、早期胚胎发育时间线与人类相似以及妊娠期较短，这些特点使我们能够方便地研究辅助生殖技术（ART）应用后的后果。此外，辅助生殖技术（如胞质内精子注射、胚胎培养或冷冻保存）在该物种中的应用也具有适当的效率。

通过本文介绍的腹腔镜胚胎移植技术和冷冻保存方案，我们阐述了：1）如何采用一种简便、微创的技术进行胚胎移植；2）一种有效的兔胚胎长期保存方案，以提供灵活的时间安排和样本运输能力。在不同发育阶段兔胚胎移植后获得的结果表明，桑葚胚是兔胚胎回收与移植的理想时期。因此，需要进行输卵管胚胎移植，这证明了手术操作的合理性。此外，兔桑葚胚能够成功实现玻璃化冷冻并经腹腔镜移植，证实了所述技术的有效性。

引言

旨在克服人类不孕症、提高高遗传价值家畜的推广效率以及保存动物遗传资源，一系列被称为辅助生殖技术的方法（如超数排卵）被广泛应用， 体外 受精、胚胎培养或冷冻保存技术得到了发展^1,2目前，通过给予激素治疗来刺激卵巢，以产生大量窦状卵泡。¹从这些卵泡中采集的卵母细胞可进行成熟、受精并发育 体外 直至它们被冷冻保存或移植到代孕母体中³然而，在这些治疗过程中，配子和受精卵会暴露于一系列非生理性的处理步骤，这可能需要胚胎进行适应以在这些条件下存活^4,5这种适应性成为可能源于早期胚胎的可塑性，该特性允许胚胎在基因表达和发育编程方面发生改变⁶然而，这些修饰可能会影响胚胎发育的后续阶段直至成年期，目前普遍认为，操作方法、处理时机、冷冻保存程序或培养条件均会对胚胎的命运产生不同的影响^7,8因此，为了阐明辅助生殖技术（ARTs）所引起的具体效应，使用特征明确的动物模型是必不可少的。

方案

本研究中使用的所有实验程序均按照欧盟动物实验指令 2010/63/EU 的规定进行，并经西班牙瓦伦西亚理工大学动物实验伦理委员会审查和批准（研究编号：2015/VSC/PEA/00170）。XGD、FMJ、MPVC 和 JSV 持有由瓦伦西亚自治区政府行政部门颁发的动物实验许可证书。XGD 被授权在实验期间对动物的福利和护理进行现场监督。

1. 胚胎移植

1. 受体雌性动物的准备
   1. 仅使用性成熟的雌性个体（> 4.5 个月大。
   2. 移植前一周，将雌性动物适应于16小时光照/8小时黑暗的光照周期，以启动卵泡生长并增强雌性接受性。
   3. 选择受体雌性，观察阴门的肿胀程度和颜色。若阴门肿胀且呈红润状，则该雌性处于可接受交配状态。
   4. 通过单次肌肉注射诱导假孕（排卵） 1 µg 无论体重如何，均使用醋酸布舍瑞林（促性腺激素释放激素的合成类似物）。
      注意：通常情况下， 0.8 µg 适用于中等体型兔子（4-5 kg）的促排卵诱导剂量，因此 1 µg 通常可确保排卵。
   5. 根据拟移植胚胎的年龄，提前相应天数诱导排卵（例如，新鲜桑葚胚移植前70-72小时）。
2. 麻醉与镇痛
   1. 称重兔子，并准备以下麻醉剂和镇痛剂。

结果

通过微创腹腔镜技术移植新鲜或玻璃化冷冻的胚胎，使兔成为生殖研究中最理想的模式动物之一。表1展示了在不同发育阶段（图4）移植胚胎后新鲜胚胎移植的结果。出生时的存活率（发育为仔兔的胚胎百分比）证明了本文所述腹腔镜技术的有效性。当移植处于桑葚胚阶段（包括早期或致密化桑葚胚）的胚胎时，获得的存活率更高。基于这些结果，我们进行了第二项实验，以验证这些胚胎经玻璃化冷冻后的存活率。因此，表2展示了同时期回收的玻璃化冷冻兔桑葚胚移植后的结果，并根据胚胎是否达到良好致密化程度进行区分。不同胚胎阶段的出生存活率存在差异，其中致密化桑葚胚的存活率更高。因此，腹腔镜胚胎移植是一种在兔中可靠地移植新鲜和玻璃化冷冻胚胎的技术

讨论

自首例通过移植胚胎实现活产的病例被记录以来⁹，该技术及兔种已在生殖研究中变得至关重要。此外，涉及操作、生产、冷冻保存的胚胎研究 等等。 最后一步需要评估胚胎产生健康足月后代的能力，因此胚胎移植技术不可或缺。^13,28多年来，最初用于将胚胎移植到母体子宫的外科手术方法，已在绝大多数物种中逐渐被侵入性更小的方法所取代。^{13,14,15,21,27,29,30}然而，在兔子中，早期胚胎发育阶段的输卵管内胚.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
牛血清白蛋白（BSA）	VWR	332
盐酸丁丙诺啡	Alvet Escartí	626	须由持证兽医开具处方。
醋酸布舍瑞林	Sigma Aldrich	B3303
氯己定葡萄糖酸盐皂	Alvet Escartí	0265DCCJ500B
氯己定葡萄糖酸盐溶液	Alvet Escartí	0265DCCA500B
CO2	液化空气集团	99921	CO2 N48
CO2 培养箱	Fisher Scientific	15385194
二甲基亚砜	Sigma Aldrich	W387509
杜尔贝科’磷酸盐缓冲液（DPBS）	Sigma Aldrich	D5773	不含氯化钙
电动剃须刀	Oster Golden A5	078005-140-002
内窥镜摄像头	Optomic Spain S.A	OP-714
带硅胶瓣膜阀的内镜穿刺器	卡尔·史托斯内窥镜伊比利亚公司érica S.A.	30114GK	轻量型套管穿刺器模型
恩诺沙星	Alvet Escartí	9993046	须由持证兽医开具处方。
23G 皮颅针	Alvet Escartí	514056353	也可以使用更小的针头。
硬膜外导管	Vygon 公司	187.10
硬膜外穿刺针	Vygon 公司	187.10
乙二醇	Sigma Aldrich	102466-M
眼膏	Alvet Escartí	5273
盐酸氯胺酮	Alvet Escartí	184	须由持证兽医开具处方。
腹腔镜设备	卡尔·史托斯内窥镜伊比利亚公司érica S.A.	26003 AA	Hopkins® 腹腔镜，0º-mm 直视腹腔镜，30 cm 长，5 mm 工作通道。
光源	Optomic Spain S.A	Fibrolux 250
液氮	液化空气集团	P1505XXX
机械式CO2气腹机	卡尔·史托斯内窥镜伊比利亚公司érica S.A.	Endoflator®
美洛昔康	Alvet Escartí	9993501	须由持证兽医开具处方。
35毫米培养皿	Sigma Aldrich	CLS430165-500EA
塑料敷料（Nobecutan）	IBOR medica	7140028
0.25 mL 塑料吸管	IMV - 技术	6431
聚维酮碘溶液	Alvet Escartí	02656DPYS500S
剪刀	ROBOZ	RS-5880	任何常规外科级不锈钢小直剪均可使用。
气腹机用硅胶管	卡尔·史托斯内窥镜伊比利亚公司érica S.A.	20400040
体视显微镜	Leica	MZ16F	较便宜的选择包括Leica MZ8或Nikon SMZ-10、SMZ-2B等。
无菌手套	Alvet Escartí	087GL010075
无菌手术衣	Alvet Escartí	12261501
无菌口罩	Alvet Escartí	058B15924B
稻草塞	IMV - 技术	6431
蔗糖	Sigma Aldrich	S7903
1 mL注射器	Fisher Scientific	11750425
5 mL注射器	Fisher Scientific	11773313
导尿管	IMV - 技术	17722
水浴锅	RAYPA	BAE-4
赛拉嗪	Alvet Escartí	525225	须由持证兽医开具处方。
兔子	理工大学è瓦尔技术ència	A线	其他母系，如V系或HP系，也可使用。