在此，我们采用生物发光、X射线以及正电子发射断层扫描/计算机断层扫描成像技术，研究抑制mTOR活性对异种移植模型中骨髓植入性骨髓瘤肿瘤的影响。该方法可对靶向骨髓植入性骨髓瘤肿瘤的治疗手段的抗骨髓瘤效应进行符合生理条件的、无创的和多模态的分析 体内.
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
多发性骨髓瘤（MM）肿瘤在骨髓（BM）中植入，其存活和进展依赖于该微环境中存在的复杂分子与细胞相互作用。然而，骨髓微环境难以被轻易复制 体外，这可能会限制许多研究的生理相关性 体外 和 离体 实验模型。这些问题可通过使用异种移植模型来克服，在该模型中，转染了荧光素酶（LUC）的8226 MM细胞可特异性地植入小鼠骨骼系统。当给予这些小鼠适当的底物D-荧光素（D-luciferin）后，可通过检测肿瘤产生的生物发光成像（BLI）变化，分析治疗对肿瘤生长和生存的影响。 体内。此BLI数据与使用代谢标志物2-脱氧-2-(18F)氟代脱氧葡萄糖（18F-FDG）用于监测肿瘤代谢随时间的变化。这些成像平台可在肿瘤/骨髓微环境中实现多次无创测量。
引言
多发性骨髓瘤（MM）是一种无法治愈的疾病，由恶性浆B细胞组成，这些细胞浸润骨髓（BM），导致骨质破坏、贫血、肾功能损害和感染。MM占所有血液系统恶性肿瘤的10%–15%1，是累及骨骼系统最常见的癌症2。MM的发生源于长寿浆细胞的癌性转化，这些浆细胞最初在淋巴组织生发中心形成，随后归巢至骨髓3。骨髓具有高度异质性的微环境，包含多种关键的细胞成分、低氧分压（pO2）区域（缺氧）、丰富的血管网络、复杂的细胞外基质以及细胞因子和生长因子网络，这些因素共同促进MM的肿瘤发生4。因此，建立一种肿瘤严格定位于骨髓的播散性MM异种移植模型，将是一种非常强大且具有临床相关性的工具，可用于在活体（in vivo）条件下研究MM的病理过程5,6。然而，多种技术难题可能限制大多数异种移植模型的有效性，使其成本高昂且难以应用。这些问题包括骨髓微环境中肿瘤移植的一致性和可重复性差、肿瘤形成所需时间较长，以及在不牺牲实验小鼠的情况下难以直接观察和测量肿瘤生长/存活变化的局限性7,8。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
以下所述的所有动物实验程序均经大洛杉矶退伍军人医疗系统机构动物照护与使用委员会（IACUC）批准，并在无菌且无病原体的条件下进行。
1. 表达荧光素酶的8226细胞（8226-LUC）的制备
- 将人多发性骨髓瘤细胞系8226维持于添加了10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素的RPMI-1640培养基中，在37 °C、含95%空气和5%二氧化碳（CO₂）的湿润 atmosphere 中培养2).
- 通过转染1 × 10⁶个8226细胞，生成稳定表达LUC的报告细胞系6 8226细胞转染含荧光素酶报告基因的载体，随后如前所述用潮霉素（100 - 350 mg/mL）进行筛选6.
- 在标准无菌培养条件下培养细胞 2 至 3 周，每隔一天更换一次培养基，直至建立稳定转染的 8226 细胞系。
- 确认 体外 1 x 10 中的荧光素酶活性6 转染细胞/100 µL 磷酸盐缓冲液（PBS），通过加入荧光素酶底物 D-荧光素（在预热的培养基中配制成 150 µg/mL 的工作液），在试管或 96 孔板中使用发光仪检测细胞的生物发光信号6.
2. 原位异种移植模型
<....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
在初步的预实验中，将8226-LUC细胞经静脉注射至NOD/SCID小鼠后，并未形成骨髓（BM）植入的多发性骨髓瘤（MM）肿瘤，尽管鳞状MM肿瘤可轻松形成（成功率100%）。相比之下，将8226细胞经静脉接种至NOG小鼠后，可在15至25天内于骨骼中形成肿瘤（极少在非骨骼组织如肝脏或脾脏中形成肿瘤）。由于无法通过直接观察动物体表来确认骨骼内的肿瘤，因此必须采用其他方法来验证肿瘤成功植入及其在骨髓内的位置（图1）。与Miyakawa等9的报道类似，可通过ELISA检测到接种后的NOG小鼠血清中由8226细胞产生的人IgG（数据未显示），但这些数据仅能证实肿瘤植入，无法确定肿瘤的位置或范围。对多只动物进行连续成像可显示骨髓植入MM肿瘤的分布情况（图4）。随后，可通过生物发光成像（BLI）对这些植入的肿瘤细胞进行连续且无创的检测，以评估接受mTOR抑制剂替西罗莫司治疗的小鼠中肿瘤生长和存活情况的.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
尽管存在多种多发性骨髓瘤的临床前异种移植模型6,9,11,12,13，但在骨髓微环境中研究肿瘤与骨髓（BM）相互作用的能力仍然有限14。本文所述技术可实现8226-LUC肿瘤细胞在NOG小鼠骨骼中的快速且可重复的移植。
该方案的关键步骤包括建立表达荧光素酶的多发性骨髓瘤细胞系，以及验证荧光素酶的稳定表达 体外15细胞系建立后，通过尾静脉注射对NOG小鼠进行接种，并通过检测生物发光成像（BLI）活性来确认肿瘤在骨骼中的移植情况。 体内 （通常在攻毒后10至20天内）图1A）.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者 Kevin Francis 就职于 Perkin-Elmer 公司。
致谢
本工作获得了美国退伍军人事务部生物医学实验室研究与开发服务局（BLRDS）向 P.F. 资助的 VA MERIT 拨款1I01BX001532的支持；E.C. 对退伍军人事务部临床科学研究计划的支持表示感谢&D 服务（功绩奖 I01CX001388）和退伍军人事务部康复 R&D 服务（功绩奖 I01RX002604）。J.K. 还获得了加州大学洛杉矶分校教师种子基金的进一步支持。本内容不一定代表美国退伍军人事务部或美国政府的观点。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 8226 人骨髓瘤细胞系 | ATCC | CCL-155 | |
| NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ 小鼠 (NOG) | Jackson Labs | 5557 | |
| VivoGlo 荧光素底物 | Promega | P1041 | |
| Hypoxyprobe-1 试剂盒 | HPL | HP1-100 | |
| PE-CD45（克隆 H130） | BD Biosciences | 555483 | 用于流式细胞术鉴定骨髓渗出液中人 CD45+ 肿瘤细胞 |
| 兔抗人 CD45 抗体（克隆 D3F8Q） | Cell Signaling Technology | 70527 | 用于切除骨组织免疫组化的一抗 |
| 山羊抗兔 IgG（HRP 标记） | ABCAM | ab205718 | 用于切除骨组织免疫组化的二抗 |
| 双荧光素酶报告基因检测系统 | Promega | E1910 | |
| pGL4.5 荧光素酶报告载体 | Promega | E1310 | |
| IVIS Lumina XRMS 活体成像系统 | Perkin Elmer | ||
| Sofie G8 PET/CT 成像系统 | Perkin Elmer |
参考文献
- Raab, M. S., Podar, K., Breitkreutz, I., Richardson, P. G., Anderson, K. C. Multiple Myeloma. The Lancet. 374 (9686), 324-339 (2009).
- Galson, D. L., Silbermann, R., Roodman, G. D. Mechanisms of Multiple Myeloma Bone Disease. BoneKEy Reports. 1, 135(2012).
- Anderson, K. C., Carrasco, R. D.
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
