NOG小鼠中多发性骨髓瘤骨髓异种移植的多模态生物发光与正电子发射断层扫描/计算机断层扫描成像

摘要

在此，我们采用生物发光、X射线以及正电子发射断层扫描/计算机断层扫描成像技术，研究抑制mTOR活性对异种移植模型中骨髓植入性骨髓瘤肿瘤的影响。该方法可对靶向骨髓植入性骨髓瘤肿瘤的治疗手段的抗骨髓瘤效应进行符合生理条件的、无创的和多模态的分析 体内.

摘要

多发性骨髓瘤（MM）肿瘤在骨髓（BM）中植入，其存活和进展依赖于该微环境中存在的复杂分子与细胞相互作用。然而，骨髓微环境难以被轻易复制 体外，这可能会限制许多研究的生理相关性 体外 和 离体 实验模型。这些问题可通过使用异种移植模型来克服，在该模型中，转染了荧光素酶（LUC）的8226 MM细胞可特异性地植入小鼠骨骼系统。当给予这些小鼠适当的底物D-荧光素（D-luciferin）后，可通过检测肿瘤产生的生物发光成像（BLI）变化，分析治疗对肿瘤生长和生存的影响。 体内。此BLI数据与使用代谢标志物2-脱氧-2-(¹⁸F)氟代脱氧葡萄糖（¹⁸F-FDG）用于监测肿瘤代谢随时间的变化。这些成像平台可在肿瘤/骨髓微环境中实现多次无创测量。

引言

多发性骨髓瘤（MM）是一种无法治愈的疾病，由恶性浆B细胞组成，这些细胞浸润骨髓（BM），导致骨质破坏、贫血、肾功能损害和感染。MM占所有血液系统恶性肿瘤的10%–15%¹，是累及骨骼系统最常见的癌症²。MM的发生源于长寿浆细胞的癌性转化，这些浆细胞最初在淋巴组织生发中心形成，随后归巢至骨髓³。骨髓具有高度异质性的微环境，包含多种关键的细胞成分、低氧分压（pO₂）区域（缺氧）、丰富的血管网络、复杂的细胞外基质以及细胞因子和生长因子网络，这些因素共同促进MM的肿瘤发生⁴。因此，建立一种肿瘤严格定位于骨髓的播散性MM异种移植模型，将是一种非常强大且具有临床相关性的工具，可用于在活体（in vivo）条件下研究MM的病理过程^5,6。然而，多种技术难题可能限制大多数异种移植模型的有效性，使其成本高昂且难以应用。这些问题包括骨髓微环境中肿瘤移植的一致性和可重复性差、肿瘤形成所需时间较长，以及在不牺牲实验小鼠的情况下难以直接观察和测量肿瘤生长/存活变化的局限性^7,8。

本方案采用了一种经改良的异种移植模型，该模型最初由 Miyakawa 建立 等⁹，其中通过静脉（IV）注射骨髓瘤细胞进行攻击，导致 "播散的" 在NOD/SCID/IL-2γ(null)（NOG）小鼠骨髓中稳定且可重复植入的肿瘤¹⁰。该 原位 通过将LUC等位基因稳定转染至8226人多发性骨髓瘤细胞系，并连续检测这些移植肿瘤细胞产生的生物发光成像信号变化，实现对肿瘤的可视化观察⁶重要的是，该模型可扩展用于多种其他表达LUC的人源多发性骨髓瘤细胞系（例如，U266 和 OPM2）具有相似的倾向，可特异性地植入 NOG 小鼠的骨骼中。通过小鼠的生物发光成像识别肿瘤后，接着测量放射性药物探针（如 ¹⁸F-FDG）通过PET/CT进行检测。这有助于进一步表征关键的生化代谢通路（即，肿瘤/骨髓微环境中代谢的改变、缺氧状态的变化以及细胞凋亡的诱导。该模型的主要优势在于可利用多种放射性标记、生物发光及荧光探针和标记物，用于研究多发性骨髓瘤的进展过程及病理机制 体内.

方案

以下所述的所有动物实验程序均经大洛杉矶退伍军人医疗系统机构动物照护与使用委员会（IACUC）批准，并在无菌且无病原体的条件下进行。

1. 表达荧光素酶的8226细胞（8226-LUC）的制备

1. 将人多发性骨髓瘤细胞系8226维持于添加了10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素的RPMI-1640培养基中，在37 °C、含95%空气和5%二氧化碳（CO₂）的湿润 atmosphere 中培养₂).
2. 通过转染1 × 10⁶个8226细胞，生成稳定表达LUC的报告细胞系⁶ 8226细胞转染含荧光素酶报告基因的载体，随后如前所述用潮霉素（100 - 350 mg/mL）进行筛选⁶.
3. 在标准无菌培养条件下培养细胞 2 至 3 周，每隔一天更换一次培养基，直至建立稳定转染的 8226 细胞系。
4. 确认 体外 1 x 10 中的荧光素酶活性⁶ 转染细胞/100 µL 磷酸盐缓冲液（PBS），通过加入荧光素酶底物 D-荧光素（在预热的培养基中配制成 150 µg/mL 的工作液），在试管或 96 孔板中使用发光仪检测细胞的生物发光信号⁶.

2. 原位异种移植模型

1. 在适当的动物饲养设施中，将 NOG 小鼠（4 - 6 周龄，雄性或雌性）维持于无菌/无病原体条件下。
2. 在实验当天，准备用于尾静脉注射的 8226 LUC 转染细胞（约 5 × 10⁶ 个细胞/只小鼠）。用预冷的 PBS 洗涤细胞 3 次，计数后将细胞重悬于预冷的 PBS（不含抗生素和 FBS）中，终浓度为 5 × 10⁶ 个细胞/200 µL PBS，置于无菌试管中。保持细胞在冰上，并尽快进行接种（30 - 120 分钟内）。
3. 使用异氟烷（1% - 3% 溶于空气，流速 0.5 - 1 L/min）麻醉小鼠，将其仰卧位放置于加热垫上，头部朝外。通过轻捏脚趾检查麻醉深度，并在眼睛上涂抹眼用软膏。
4. 使用 1 mL 胰岛素注射器和 26 号针头，通过尾静脉注射 8226-LUC 细胞（每只注射 200 µL）。
   注意：可使用加热灯加热小鼠尾巴，以扩张静脉，提高注射成功率。
5. 将动物放回原笼，并持续观察直至其完全恢复。
6. 通过检测麻醉状态下小鼠的生物发光成像（BLI）来确认 8226-LUC 细胞在小鼠骨骼中的植入情况（如下所述并见图 1A）。
   注意：也可通过流式细胞术检测骨髓渗出物中人源 CD45 的表达（图 1B），或通过收获骨组织进行免疫组化分析（图 1C）。

3. 生物发光成像（BLI）的测量 在体 内

注意：小鼠体内移植肿瘤的可测量生物发光成像（BLI）信号通常在接种后10至20天首次出现，但具体时间可能需要通过实验确定。

1. 用异氟烷（1% - 3%，以0.5 - 1 L/min的气流通入空气中）麻醉小鼠，并通过捏压脚趾检查麻醉深度。在小鼠眼睛上涂抹眼用软膏。
2. 经腹腔注射（每只注射200 µL）“in vivo-grade” D-荧光素底物（用无菌生理盐水稀释至30 mg/mL）。
3. 在注射荧光素底物后5 - 10分钟内，将麻醉后的小鼠仰卧置于小动物成像系统中，进行生物发光成像（BLI）检测（尽管小鼠体内的BLI信号可持续45 - 60分钟）（图2）。选择生物发光和X射线分析模式并采集图像（图3）。
   1. 使用成像软件，在选定的兴趣区域（ROIs）内测量平均辐射通量（光子数/s/cm²/球面度）（图4）。
   2. 将小鼠放回原饲养笼，并持续观察直至其完全恢复（约15 - 20分钟）。

4. 靶向治疗小鼠

1. 测量动物的基线生物发光成像（BLI）信号，并将动物随机分入不同的治疗组（每组4 - 8只小鼠）。
2. 通过腹腔注射（每次200 µL）给予小鼠替西罗莫司（0.2 - 40 mg/kg 小鼠），给药方案为连续5天每日注射，随后休息2天，再进行额外5次每日注射¹¹。
3. 按照第3节所述方法，每周两次测量荧光素酶活性（光子数/s/cm²/球面度），并绘制BLI随时间的变化曲线。肿瘤BLI的变化可用小鼠的连续成像图像表示（图5B）。
   注意：建议每日监测动物状态，直至出现以下症状（通常在初次接种后45 - 60天内发生）：体重减轻（较植入前体重减少超过10%）和/或后肢瘫痪；此时应使用CO₂麻醉箱实施安乐死，随后进行颈椎脱臼确认死亡。

5. 使用¹⁸F-FDG 进行 PET/CT 分析以测量肿瘤代谢变化

1. 实验前24小时移除动物饲养笼中的食物，使其禁食，以避免非特异性摄取过多 ¹⁸F-FDG
2. 准备 ¹⁸F-放射性标记的FDG PET探针（50 - 100 µCi/次注射，溶于无菌生理盐水中）于实验当日使用。记录注射的时间和放射性活度 ¹⁸使用剂量校准仪测量F-FDG探针的剂量。
   注意：由于 ¹⁸F 的半衰期相对较短（约 2 小时），因此必须妥善准备并周密规划这些探针的使用。
3. 用异氟烷（1% - 3%，以0.5 - 1 L/min的气流通入空气中）麻醉动物，将其仰卧置于加热垫上，头部朝向远离操作者的方向。通过轻捏脚趾检查麻醉深度。在动物眼睛上涂抹眼用软膏。
4. 注射探针 通过 尾静脉注射（每次100 µL），使用带护罩的1 mL胰岛素注射器和26号针头。
   注意：可使用加热灯对尾部进行加温，从而扩张静脉，提高注射效率。
5. 使用活度计测量针头/注射器中的残留放射性，并记录活度及时间。
   注意：小鼠孵育条件、剂量和时间的标准化对于确保数据的可重复性和可比性至关重要。
6. 在整个探针摄取期间（约45至90分钟），使用加热垫将小鼠维持在麻醉状态和37 °C。
   注意：为避免探针的非特异性摄取，必须保持小鼠处于静止状态并维持体温在 37 °C。
7. 错开注射时间 ¹⁸F-FDG 探针约每 20 至 30 分钟注射一次，以确保小鼠的标记时间相近。
   注意：正确的操作流程和探针注射时机将获得最佳且可重复的成像效果。
8. 测量 ¹⁸PET/CT小动物成像系统中对应于移植瘤的选定感兴趣区域内的18F-FDG活性（图6).
   注意：最初建议采用10分钟的静态PET曝光和2分钟的CT曝光，但具体的曝光时间可能需要通过实验确定。
9. 将动物放回其饲养笼中，并监测直至完全恢复。在探针放射性衰减至本底水平的24小时内，将小鼠饲养于专用的恢复室中。
   注意：由于半衰期较短 ¹⁸F，使用新探针可每周进行多达两次的频繁测量。

结果

在初步的预实验中，将8226-LUC细胞经静脉注射到NOD/SCID小鼠体内后，并未形成骨髓（BM）定植的多发性骨髓瘤（MM）肿瘤，尽管鳞状MM肿瘤可轻松形成（成功率100%）。相比之下，将8226细胞经静脉注射至NOG小鼠后，可在15至25天内于骨骼中形成肿瘤（极少在非骨骼组织如肝脏或脾脏中形成肿瘤）。由于无法通过直接观察动物体表来确认骨骼内的肿瘤，因此必须采用其他方法来验证肿瘤是否成功定植以及其在骨髓内的具体位置（图1）。与Miyakawa et al.⁹的报道类似，可通过ELISA检测到受注射NOG小鼠血清中由8226细胞产生的人IgG（数据未显示），但这些数据仅能证实肿瘤定植，无法说明肿瘤的位置或范围。对多只动物进行连续成像可显示骨髓定植MM肿瘤的分布情况（图4）。通过生物发光成像（BLI）可对这些定植的肿瘤细胞进行连续、无创性测量，以评估接受mTOR抑制剂替西罗莫司治疗的小鼠体内...

讨论

尽管存在多种多发性骨髓瘤的临床前异种移植模型^6,9,11,12,13，但在骨髓微环境中研究肿瘤与骨髓（BM）相互作用的能力仍然有限¹⁴。本文所述技术可实现8226-LUC肿瘤细胞在NOG小鼠骨骼中的快速且可重复的移植。

该方案的关键步骤包括建立表达荧光素酶的多发性骨髓瘤细胞系，以及验证荧光素酶的稳定表达 体外¹⁵细胞系建立后，通过尾静脉注射对NOG小鼠进行接种，并通过检测生物发光成像（BLI）活性来确认肿瘤在骨骼中的移植情况。 体内 （通常在攻毒后10至20天内）图1A）...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
8226 人骨髓瘤细胞系	ATCC	CCL-155
NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ 小鼠 (NOG)	Jackson Labs	5557
VivoGlo 荧光素底物	Promega	P1041
Hypoxyprobe-1 试剂盒	HPL	HP1-100
PE-CD45（克隆 H130）	BD Biosciences	555483	用于流式细胞术鉴定骨髓渗出液中人 CD45+ 肿瘤细胞
兔抗人 CD45 抗体（克隆 D3F8Q）	Cell Signaling Technology	70527	用于切除骨组织免疫组化的一抗
山羊抗兔 IgG（HRP 标记）	ABCAM	ab205718	用于切除骨组织免疫组化的二抗
双荧光素酶报告基因检测系统	Promega	E1910
pGL4.5 荧光素酶报告载体	Promega	E1310
IVIS Lumina XRMS 活体成像系统	Perkin Elmer
Sofie G8 PET/CT 成像系统	Perkin Elmer